- Email: [email protected]
Analiza genotypowa oraz profil lekowrażliwości szczepów Staphylococcus aureus izolowanych od dzieci chorych na mukowiscydozę
pediatria polska 87 (2012) 545–551
Dostępne online www.sciencedirect.com
journal homepage: www.elsevier.com/locate/pepo
Artykuł oryginalny/Original research article
Analiza genotypowa oraz profil lekowrażliwości szczepów Staphylococcus aureus izolowanych od dzieci chorych na mukowiscydozę Genetic fingerprinting and antimicrobial susceptibility profiles of Staphylococcus aureus strains isolated from children with cystic fibrosis Katarzyna Semczuk 1,*, Katarzyna Dzierżanowska-Fangrat 1, Hanna Dmeńska 2, Beata Fronc 1, Danuta Dzierżanowska 1 1 Zakład Mikrobiologii i Immunologii Klinicznej, Instytut ,,Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka’’ Kierownik: prof. nadzw. dr hab. n. med. Katarzyna Dzierżanowska-Fangrat, Warszawa, Poland 2 Poradnia Pulmonologiczna, Instytut ,,Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka’’ Kierownik: dr n. med. Przemysław Westfal, Warszawa, Poland
informacje o artykule
abstract
Historia artykułu:
Background: The pathophysiology of cystic fibrosis (CF) is associated with genetically
Otrzymano: 23.08.2012
determined abnormal chloride conductance on the apical membrane of the epithelial
Zaakceptowano: 04.09.2012
cell. As a result favourable environment for bacterial and fungal infections is maintained.
Dostępne online: 07.09.2012
Respiratory tract infections in CF patients are caused mainly by Staphylococcus aureus, Haemphilus influenzae, and Pseudomonas aeruginosa which is the most destructive pulmo-
Słowa kluczowe: mukowiscydoza
nary pathogen. Objectives: The aim of this study was to analyse genetic diversity and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus strains isolated from children with
Staphylocccus aureus PFGE
cystic fibrosis. Material and methods: A total of 21 patients with confirmed cystic fibrosis
lekowrażliwość
collected, and 201 isolates of S. aureus were cultured. Genotyping was performed using
were included to the study. Within 8 years 257 specimens from the respiratory tract were the pulsed field gel electrophoresis (PFGE) technique, and antimicrobial susceptibility was
Keywords: Cystic fibrosis Staphylocccus aureus PFGE Antimicrobial susceptibility
determined by the E-test method. The following data were retrieved from medical records: age at CF diagnosis, clinical signs and symptoms, respiratory function (FEV1), frequency of hospitalization and antibiotic use. Results and conclusions: The mean age of patients studied was 7 years (range 0.5–16 years). Over 80% of patients had pulmonary manifestations. The genotyping confirmed that Staphylococcus aureus persistently colonized the respiratory tract of patients with CF. For over 95% of strains the colonization lasted from 6 months to 8 years. Less than 5% of strains did not show a tendency for a long-term colonization, and they were isolated only once. In 34% of patients the same genotype was isolated through the study period, and it could not be eradicated despite antibiotic treatment. As many as 62% of children were persistently colonized with 2 or 3 strains simultaneously. Over 94% of strains were susceptible to b-lactams, fluoroquinolones,
* Adres do korespondencji: Zakład Mikrobiologii i Immunologii Klinicznej, Instytut ,,Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka’’, Al. Dzieci Polskich 20, 04-730 Warszawa. Tel.: +48 22 815 72 70; mobile: +48 506 141 656; fax: +48 22 815 72 75. Adres email: [email protected] (K. Semczuk). 0031-3939/$ – see front matter © 2012 Polish Pediatric Society. Published by Elsevier Urban & Partner Sp. z o.o. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.pepo.2012.09.003
546
pediatria polska 87 (2012) 545–551
trimethoprim/sulfamethoxazole, aminoglycosides, and glycopeptides. The highest rates of resistance were observed for macrolides (23%) which were the second most commonly used antibiotics in bronchopulmonary exacerbations. Some of S. aureus strains were effectively transmitted among the patients. However, only methicillin-susceptible isolates (MSSA) were involved in the transmission. MRSA transmission was not detected. © 2012 Polish Pediatric Society. Published by Elsevier Urban & Partner Sp. z o.o. All rights reserved.
Wprowadzenie Mukowiscydoza (zwłóknienie torbielowate – cystic fibrosis; CF) jest najczęstszą genetycznie uwarunkowaną, monogenową chorobą populacji kaukaskiej. Najczęstszą postacią kliniczną mukowiscydozy jest przewlekła choroba oskrzelowo-płucna. Objawy zajęcia procesem chorobowym układu oddechowego występują w 1. r. ż. u prawie połowy chorych. Zmiany w układzie oddechowym mają decydujący wpływ na jakość i długość życia. W dalszym ciągu u 80–95% chorych główną przyczyną upośledzenia funkcji życiowych i zgonu jest niewydolność oddechowa spowodowana nieodwracalnym uszkodzeniem płuc [1, 2]. Płuca i gruczoły śluzowe noworodków chorych na mukowiscydozę w większości wypadków nie wykazują zmian morfologicznych, ale wkrótce pojawiają się objawy procesu zapalnego, który wyraźnie poprzedza infekcję. Genetycznie uwarunkowane zaburzenia wodno-elektolitowe na powierzchni szczytowej komórek nabłonka oddechowego wytwarzają środowisko sprzyjające zakażeniom bakteryjnymi i grzybiczym. Reakcją na zakażenie jest napływ granulocytów obojętnochłonnych, wysięk i nadprodukcja gęstego i lepkiego śluzu [3]. Nadmierna aktywność neutrofili i upośledzony klirens śluzowo-rzęskowy sprzyjają infekcjom oskrzelowo-płucnym, za które odpowiada ograniczona grupa drobnoustrojów oportunistycznych. Gronkowiec złocisty izolowany jest jako jeden z pierwszych patogenów kolonizujących drogi oddechowe i dominuje u pacjentów poniżej 10. roku życia [4]. W erze przedantybiotykowej u chorych niemowląt większość zaostrzeń oskrzelowo-płucnych powodował gronkowiec złocisty, przyczyniając się do wczesnej i wysokiej śmiertelności. Obecnie zastosowanie kompleksowego leczenia, w tym intensywnej antybiotykoterapii, pozwoliło na wydłużenie i poprawę jakości życia chorych na mukowiscydozę [1, 5]. W przedstawionej pracy oceniano grupę pacjentów z mukowiscydozą, u których obserwowano przewlekłą kolonizację dróg oddechowych gronkowcem złocistym. Celem pracy była analiza genetyczna szczepów Staphylococcus aureus, określenie czasu utrzymywania się jednego genotypu gronkowca oraz ocena profilu lekooporności.
Materiał i metody Analizą objęto 21 chorych na mukowiscydozę leczonych w Instytucie ,,Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka’’ w Warszawie. Na podstawie dokumentacji medycznej uzyskano
dane dotyczące wieku, w którym rozpoznano chorobę, objawów klinicznych, wyników badań czynnościowych układu oddechowego (FEV1 – natężona objętość wydechowa pierwszosekundowa), liczby hospitalizacji, antybiotykoterapii stosowanej w ciągu 8 lat obserwacji. Podczas rutynowych wizyt w Poradni Pulmonologicznej IP-CZD, odbywających się przeciętnie raz na kwartał, wykonywano badania mikrobiologiczne. Materiał stanowiła plwocina lub ,,głęboki’’ wymaz z gardła, uzyskiwany od pacjentów mających trudności z odkrztuszaniem. Pobrane materiały posiewano na podłoża mikrobiologiczne (BBL, Graso, Biomerieux) i inkubowano w warunkach tlenowych. Gronkowiec złocisty izolowany był z podłoża agar Columbia, Chapmana i identyfikowany z wykorzystaniem klasycznych metod diagnostycznych. Wrażliwość na antybiotyki była oznaczona metodą ilościową za pomocą dyfuzji z paska z gradientem stężeń antybiotyków (E-test, AB Biodisc, obecnie Biomerieux) na podłożu agarowym Muller Hinton. Warunki inkubacji i interpretacji wyników przebiegały zgodnie z zaleceniami CLSI (Clinical and LaboratoryStandards Institute) z 2007 r. Metycylino-wrażliwość oznaczono metodami fenotypowymi, tj. dyfuzyjno-krążkową z cefoksytyną oraz testem lateksowym Slidex MRSA Detection (Biomerieux) do wykrywania białka PBP2a. Dla szczepów opornych zastosowano również metodę genetyczną PCR do wykrywania genu mecA (DNA Gdańsk). Fenotyp oporności na makrolidy i linkozamidy oznaczono, stosując metodę dyfuzyjno-krążkową z erytromycyną 15 mg oraz klindamycyną 2 mg, tzw. D-test. Typowanie genetyczne uzyskanych izolatów S. aureus wykonano metodą PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis – elektroforeza w pulsującym polu elektrycznym), stosując do izolacji DNA zestawy GenePath Universal Module (Bio-Rad), a do trawienia GenePath Enzyme Module Group 1 z enzymem restrykcyjnym SmaI (Bio-Rad). Analizę pokrewieństwa wykonano za pomocą programu Molecular Analyst Fingenprinting Plus (BioRad), stosując współczynnik Dice'a oraz kryteria Tenovera. Główne genotypy, czyli klony, oznaczano dużą literą alfabetu (np. A), do podtypów dodawano kolejno cyfry arabskie (np. A1, A2,...).
Wyniki Wiek pacjentów w momencie rozpoczęcia badań wynosił od 6 miesięcy do 16 lat (śr. wiek 7 lat). W badanej grupie 21 pacjentów były dwa dwuosobowe rodzeństwa. Pacjenci prezentowali charakterystyczne objawy dla mukowiscydozy, przede wszystkim ze strony układu oddechowego i pokarmowego. Zmiany w układzie oddechowym objawiały
547
pediatria polska 87 (2012) 545–551
Tabela I – Charakterystyka badanych chorych z mukowiscydozą Table I – Characteristics of the study populationof patients with cystic fibrosis Liczba badanych pacjentów Wiek pacjentów w latach (średni; zakres) Płeć męska/żeńska Wiek rozpoznania CF w latach (średni; zakres) Objawy kliniczne ze strony układu oddechowego (liczba pacjentów; %) Wartość współczynnika FEV1 w 1998 r. (średni; zakres) Wartość współczynnika FEV1 w 2005 r. (średni; zakres) Średnia liczba hospitalizacji przypadająca na pacjenta Pacjenci skolonizowani metycylinoopornym szczepem S. aureus – MRSA (liczba; %) Pacjenci skolonizowani pałeczką Pseudomonas aeruginosa (liczba; %)
21 7 (0,5–16) 8/13 5,3 (0,1–16) 17 (81%) 96,7 (48–124) 84,2 (62–114) 2,6 3 (14%) 15 (71%)
się nawracającymi zapaleniami płuc i oskrzeli, postępującą chorobą oskrzelowo-płucną, z okresowymi zaostrzeniami, zapaleniem zatok przynosowych. Ze strony układu pokarmowego obserwowano niewydolność trzustki, u starszych pacjentów cechy niewydolności wątroby oraz cukrzycę. W okresie obserwacji u jednego pacjenta przeprowadzono transplantację wątroby. Ponad 90% (19) pacjentów wymagało co najmniej jednokrotnej hospitalizacji. Charakterystykę badanych chorych z mukowiscydozą przedstawiono w tabeli I. Każdy z pacjentów kilkakrotnie w ciągu roku wymagał antybiotykoterapii. Najczęściej stosowaną grupą leków były antybiotyki beta-laktamowe (36%), rzadziej makrolidy (21%) oraz fluorochinolony (14%). W analizowanym okresie pobrano 257 badań (86 próbek plwociny i 171 wymazów z gardła), z których uzyskano 201 izolatów Staphylococcus aureus. W 22 (8%) badaniach, pochodzących od 7 (33%) pacjentów, uzyskano po dwa fenotypowo zróżnicowane szczepy gronkowca złocistego. Zidentyfikowano 18 izolatów MRSA, które pochodziły od 3 (14%) pacjentów.
Wyniki lekowrażliwości na podstawie wartości MIC, zakres uzyskanych wartości oraz MIC50 i MIC90 przedstawiono w tabeli II. Fenotyp oporności na makrolidy miał najczęściej (73%) charakter indukcyjny MLSb. U 15 (71%) pacjentów uzyskano również izolację pałeczek Pseudomonas aeruginosa. Wyniki analizy wzorów PFGE wykazały, że u 7 (34%) pacjentów w okresie prowadzenia badań, tj. 8 lat, izolowano ten sam szczep o identycznym wzorze restrykcyjnym i niezmiennym fenotypie lekooporności. U kolejnych 8 (38%) pacjentów zróżnicowano po 2 genotypy (A i B), z wyraźną dominacją jednego typu, dłużej utrzymującego się i drugiego izolowanego sporadycznie. U 5 (24%) pacjentów uzyskano szczepy należące do 3 różnych genotypów, które izolowano kilkukrotnie w ciągu 8 lat obserwacji. Tylko u jednego z pacjentów uzyskano 8 izolatów, które zaliczono do 5 różnych genotypów. Porównanie wzorów PFGE 201 izolatów S. aureus pozwoliło na wyodrębnienie 41 genotypów. Znaczna większość szczepów wykazywała tendencję do długotrwałej kolonizacji. Czas trwania kolonizacji dla 31 szczepów wyniósł od 6 miesięcy do 8 lat (średni czas trwania kolonizacji określono na 4 lata). U każdego pacjenta zidentyfikowano co najmniej jeden szczep, który izolowany był minimum dwukrotnie. Do klonów sporadycznych, czyli uzyskanych jednorazowo, należało 10 szczepów, które izolowano u 4 pacjentów.
Omówienie Chorzy na mukowiscydozę od momentu rozpoznania objęci są wielospecjalistyczną opieką lekarską. Częstość wizyt i badań uzależniona jest od wieku i stanu klinicznego chorego. Jednym z elementów opieki są regularnie wykonywane badania mikrobiologiczne, które pozwalają na monitorowanie flory kolonizującej drogi oddechowe, a także ustalenie celowanej antybiotykoterapii w przypadku pojawiających się zaostrzeń oskrzelowo-płucnych [6, 7]. Częstość występowania gronkowca złocistego w drogach oddechowych chorych na mukowiscydozę wynosi 10–90% i w dużej mierze zależy od zasad prowadzonej profilaktyki przeciwbakteryjnej [8]. Jak wykazały badania, wczesna
Tabela II – Lekowrażliwość 201 izolatów S. aureus (zakres wartości MIC – minimalne stężenie hamujące, wartość MIC50 i MIC90) Table II – Antimicrobial susceptibility of 201 isolates of S. aureus (range of values MIC – minimal inhibitory concentration, value MIC50 i MIC90) Antybiotyk/Chemioterapeutyk Metycylina Cefuroksym Amoksycylina /kw.klawulanowy Erytromycyna Klindamycyna Trimetoprim/Sulfametoksazol Gentamycyna Cyprofloksacyna Wankomycyna Linezolid
Zakres MIC mg/ml
MIC 50
MIC 90
% izolatów wrażliwych
0,125–256 0,125–16 0,094–256 0,064–256 0,047–256 0,023–4 0,064–32 0,064–12 0,5–1,5 0,5–1
1 0,5 0,38 0,19 0,094 0,047 0,25 0,125 1 0,5
2 1 0,75 24 0,5 0,094 1 0,5 1 1
94
77 84 99 95 98 100 100
548
pediatria polska 87 (2012) 545–551
profilaktyka przeciwbakteryjna, zastosowana przed 2.–3. roku życia skutecznie zmniejsza częstość kolonizacji dróg oddechowych i obniża liczbę zaostrzeń ze strony układu oddechowego [7–9]. W latach 1999–2001 u 86% pacjentów chorych na mukowiscydozę leczonych w Poradni Pulmonologicznej oraz Klinice i Poradni Gastroenterologii Hepatologii i Żywienia IP-CZD izolowano gronkowca złocistego, a u 39% pałeczki ropy błękitnej [10]. W prezentowanej pracy analizowano grupę pacjentów konsultowanych w latach 1998–2005, u których obserwowano przewlekłą kolonizację gronkowcem złocistym. Średnia wieku chorych z badanej grupy wynosiła 7 lat, a mukowiscydozę rozpoznano średnio w 5,3 roku życia. Średnią wieku rozpoznania choroby zawyżyła pacjentka, u której mukowiscydozę zdiagnozowano dopiero w wieku 16 lat (typ mutacji delta F 508/3849 + 10 kbC). U pozostałych pacjentów chorobę rozpoznawano poniżej 4. r. ż. W ciągu 8 lat w badanej grupie częstość izolacji gronkowca złocistego wzrosła z 74% w 1998 roku do 100% w 2005 roku. Leczenie zmian oskrzelowo-płucnych u chorych na mukowiscydozę wymaga kompleksowej i skojarzonej terapii, tj. stosowania leków mukolitycznych, rozszerzających oskrzela, leków przeciwzapalnych, antybiotyków oraz fizjoterapii. Antybiotyki stosowane są w przypadku nowych zakażeń oskrzelowo-płucnych oraz w zaostrzeniach przewlekłych zmian zapalnych. Rozpoznanie zaostrzenia choroby oskrzelowo-płucnej jest wskazaniem do przeprowadzenia terapii antybiotykami dobranymi na podstawie lekowrażliwości flory bakteryjnej [6, 7, 11]. U ponad 80% pacjentów podczas planowych wizyt w Poradni Pulmonologicznej występowały objawy ze strony układu oddechowego. W leczeniu najczęściej stosowane były antybiotyki beta-laktamowe (min. amoksycylina, amoksycylina z kw. klawulanowym, cefadroksyl, cefaklor, cefuroksym) oraz makrolidy (klarytromycyna, azytromycyna, spiramycyna, roksytromycyna). Badane szczepy charakteryzowały się bardzo dobrą wrażliwością na metycylinę (94%), co warunkuje wrażliwość na pozostałe leki beta-laktamowe. Znacznie mniej szczepów było wrażliwych na makrolidy (77%). Oporność na makrolidy miała głównie fenotyp MLSB o charakterze indukcyjnym (73%), który wyklucza możliwość stosowania w terapii antybiotyków makrolidowych oraz linkozamidów. Narastanie oporności na makrolidy niewątpliwie może być związane ze zwiększoną częstością stosowania tej grupy leków u pacjentów chorych na mukowiscydozę. Powszechność stosowania antybiotyków makrolidowych u chorych na mukowiscydozę związana jest nie tylko z aktywnością przeciwbakteryjną, ale również ze zdolnością penetracji wewnątrzkomórkowej oraz właściwościami immunomodulującymi. Wykazano także wpływ makrolidów na klirens śluzowo-rzęskowy, polegający na zmniejszeniu produkcji śluzu i jego lepkości [12, 13]. Makrolidy nie są aktywne wobec pałeczek Pseudomonas aeruginosa, jednak badania wykazały, że długotrwałe stosowanie makrolidów ogranicza syntezę niektórych białek, między innymi proteazy, elastazy czy leukocydyny, oraz hamuje syntezę piocyjaniny i egzotoksyny A, a także zakłóca proces tworzenia biofilmu. U pacjentów przewlekle leczonych azytromycyną wykazano znaczną poprawę
wydolności oddechowej, zmniejszenie ryzyka zaostrzeń płucnych, zmniejszenie częstości podawania leków w postaci dożylnej i konieczności hospitalizacji [14–17]. Oporność na makrolidy wśród szczepów gronkowca złocistego jest bardzo zróżnicowana. Badania przeprowadzone w Polsce na szczepach Staphylococcus aureus kolonizujących górne drogi oddechowe zdrowych dzieci w wieku przedszkolnym wykazały nieco niższy odsetek oporności na erytromycynę. U dzieci w wieku 3–5 lat uczęszczających do przedszkola wynosił on 15,4%, a w grupie kontrolnej (dzieci pozostające w domu) – 9,4%. W obu grupach odnotowano przewagę fenotypu indukcyjnego MLSB [18]. U chorych na mukowiscydozę wśród szczepów MSSA i MRSA zaobserwowano dominację fenotypu MLSB konstytutywnego, a oporność na makrolidy była najczęściej występującym mechanizmem oporności (50%) [19]. Narastanie oporności na antybiotyki może skutkować długotrwałą kolonizacją szczepami wieloopornymi. W badaniach nad przewlekłą kolonizacją dróg oddechowych pacjentów z CF początkowo wykorzystywano metody fenotypowe. W jednej z pierwszych analiz epidemiologicznych wykazano, że tylko 17% pacjentów wydawało się trwale skolonizowanych jednym fenotypem gronkowca, a czas trwania kolonizacji oceniono maksymalnie na 10 miesięcy. Badacze wnioskowali, że pacjenci zakażani są przez kolejne szczepy [20]. Podobne wyniki otrzymywali inni autorzy. Kolonizację jednym, dominującym szczepem gronkowca złocistego wykazano, w zależności od badań, u 21–73% pacjentów z CF [21–23]. Ten sam szczep gronkowca złocistego izolowano ponownie po 19–31 miesięcy mimo zastosowanego leczenia [22, 24]. W badanej populacji dzieci chorych na mukowiscydozę izolowane szczepy gronkowca złocistego nie ulegały eradykacji, pomimo wrażliwości in vitro na antybiotyki stosowane w leczeniu zaostrzeń oskrzelowo-płucnych. Przed i po zastosowanej antybiotykoterapii izolowano te same szczepy, co zobrazowały wyniki badań genetycznych. Typowanie metodą PFGE wykazało, że u 34% pacjentów występował niezmienny genotyp gronkowca złocistego, mimo że przerwy między kolejnymi izolacjami wynosiły niekiedy 2 lata (Ryc. 1). U pozostałych 62% pacjentów również obserwowano przewlekłą kolonizację, ale co najmniej 2 lub 3 różnymi szczepami równocześnie. Niektóre szczepy były izolowane nawet po kilku latach. U wszystkich badanych pacjentów uzyskano co najmniej jeden szczep, którego czas utrzymywania się w drogach oddechowych wynosił od 6 miesięcy do 8 lat. Analiza genetyczna ujawniła również możliwość kolonizacji dróg oddechowych co najmniej 2 różnymi szczepami jednocześnie. Wykrywanie tego zjawiska podczas rutynowej, klasycznej diagnostyki mikrobiologicznej może być utrudnione na skutek słabo wyrażonych różnic w fenotypie. Ma to szczególnie znaczenie, gdy drogi oddechowe kolonizują szczepy wrażliwy i oporny, zwłaszcza na antybiotyki beta-laktamowe czy makrolidy. W badanej grupie u 7 (33%) pacjentów z jednego badania izolowano po 2 różne szczepy gronkowca (Ryc. 2). W badaniach Brangera i wsp. zjawisko jednoczesnej współkolonizacji dwóch różnych szczepów wykazano u 3% badanych pacjentów z CF [21, 22].
pediatria polska 87 (2012) 545–551
[(Ryc._1)TD$FIG]
[(Ryc._3)TD$FIG]
Ryc. 1 – Wzory PFGE szczepów S. aureus izolowanych od pacjentów z mukowicydozą; pacjent z przewlekłą kolonizacją MRSA (ten sam szczep izolowany w latach 2000–2005) Fig. 1 – Pulsed-field gelelectrophoresis patterns S. aureus isolated from cystic fibrosis patients; patient with chronic colonization of MRSA (the same strain isolated in years 2000– 2005)
[(Ryc._2)TD$FIG]
Ryc. 2 – Wzory PFGE szczepów S. aureus izolowanych od pacjentów z mukowicydozą; pacjent, u którego izolowano 3 zróżnicowane genotypowo i fenotypowo klony S. aureus (A, B, C) w latach 1998–2004 (w 2004 r. z jednego badania izolowano 2 różne szczepy A i C) Fig. 2 – Pulsed-field gelelectrophoresis patterns S. aureus isolated from cystic fibrosis patients; patient with 3 genotype and phenotype different strains S.aureus (A,B, C) in years 1998–2004 (in 2004, isolation of 2 different strais – A and C)
Metody typowania genetycznego najczęściej stosowane są głównie w dochodzeniach epidemiologicznych w celu ujawnienia zjawiska krzyżowych infekcji. Pacjenci z mukowiscydozą objęci stałą opieką wielospecjalistyczną często poddawani są hospitalizacji, rehabilitacji w tych samych ośrodkach. W warunkach polskich nie ma ośrodków przeznaczonych do leczenia chorych na CF, które zapewniałyby
549
Ryc. 3 – Porównanie wzorów PFGE szczepów izolowanych od rodzeństwa (XVIII i XX) w latach 2000–2005; na przestrzeni 5 lat nie doszło do wymiany szczepów między pacjentami Fig. 3 – Comparison of pulsed-field gel electrophoresis patterns of isolates from siblings (XVIII i XX) in years 2000–2005; over the 5 years there has been no exchange of strains between patients
ochronę przed zakażeniami krzyżowymi. W większości polskich szpitali nie ma również możliwości separacji pacjentów z CF pod względem bakteriologicznym (pacjentów bez kolonizacji Pseudomonas aeruginosa czy MRSA od pacjentów zakażonych). Taka sytuacja sprzyja transmisji szczepów między chorymi. Wyniki typowania genetycznego w badanej grupie potwierdziły możliwość przenoszenia szczepów między pacjentami. Zjawisko to dotyczyło jednak tylko 2 pacjentów, którzy należeli do jednej z dwóch par rodzeństwa (VIII i X). U drugiej pary (XVIII i XX) na przestrzeni 5 lat nie zaobserwowano transmisji szczepów (Ryc. 3), każdy z pacjentów skolonizowany był szczepem o odmiennym wzorze restrykcyjnym. U 4 pacjentów uzyskano szczepy blisko spokrewnione, ale nie identyczne. W badanej grupie 21 pacjentów nie stwierdzono obecności klonów charakterystycznych dla badanej populacji. U pacjentów chorych na mukowiscydozę istotne zagrożenie stanowi rozprzestrzenianie się szczepów gronkowca złocistego opornego na metycylinę (MRSA). W literaturze znane są doniesienia o transmisji szczepów MRSA podczas hospitalizacji lub w trakcie wspólnych obozów rehabilitacyjnych [2, 24, 25]. O możliwości klonalnego szerzenia szczepów metycylinoopornych świadczą wyniki badań Kidd i wsp., którzy wykazali obecność endemicznego szczepu MRSA u 10 dorosłych pacjentów z CF [24]. Również w badaniach Vergison i wsp. potwierdzono klonalne szerzenie się szczepów MRSA. W grupie belgijskich pacjentów chorych na mukowiscydozę 67% szczepów MRSA zakwalifikowano do szczepów o charakterze epidemicznym [26]. Częstość kolonizacji szczepami MRSA chorych na mukowiscydozę jest bardzo zróżnicowana w zależności od kraju i ośrodka. Według rejestru pacjentów z CF prowadzonego w Stanach Zjednoczonych, wynosi od 0–23%, średnio około 7% [2]. Badania przeprowadzone w Royal Brompton Hospital w Londynie na przestrzeni 32 lat (1965–1997) wśród 974 chorych na mukowiscydozę wykazały obecność MRSA jedynie u 26 pacjentów (2,7%) [27, 28]. W cytowanym wcześniej
550
pediatria polska 87 (2012) 545–551
belgijskim badaniu częstość izolacji MRSA określono średnio na 5% (0–17%) [26]. W badanej przez nas populacji 21 chorych, na przestrzeni 8 lat, szczepy MRSA uzyskano jedynie od 3 (14%) pacjentów (I, XIV, XIX). Analizując dane o częstości izolacji MRSA w poszczególnych krajach, można stwierdzić, że grupa pacjentów z mukowiscydozą nie odbiega znacząco od innych grup chorych. Według raportu EARSS (European Antimicrobial Resistance Surveillance System), częstość występowania szczepów MRSA w Europie w 2009 roku wynosiła w zależności od kraju 1–50%, w Polsce średnio 20% [29]. Analiza profili restrykcyjnych uzyskanych szczepów MRSA wykazała, że należały one do 3 różnych, niespokrewnionych ze sobą klonów, z wyraźną różnicą w profilu oporności. W przypadku dwóch pacjentów (I, XIV) były to typowe wielooporne szczepy szpitalne z dodatkową opornością na tetracyklinę, erytromycynę, klindamycynę, a także kotrimoksazol i cyprofloksacynę. Pacjenci byli wielokrotnie hospitalizowani, min. w IP-CZD oraz innych placówkach. U jednego z nich (XIV) w 2001 roku w Belgii przeprowadzono transplantację wątroby. U trzeciego pacjenta (XIX) izolowano szczep MRSA wrażliwy na wszystkie pozostałe grupy leków, jedynie w ostatnim roku obserwacji wykryto oporność na makrolidy o fenotypie M. We wszystkich przypadkach kolonizacja miała charakter długotrwały, wynosiła od 2 do 8 lat. W ciągu 8 lat nie doszło do przeniesienia szczepów MRSA na innych pacjentów z CF. Znaczenie kliniczne kolonizacji szczepami metycylinoopornymi pacjentów chorych na mukowiscydozę od lat budzi kontrowersje. Znane są doniesienia, z których wynika, że pacjenci z izolacją MRSA wymagają częstszego leczenia antybiotykami i mają bardziej zaawansowane zmiany radiologiczne w płucach. Nie obserwowano natomiast pogorszenia funkcji układu oddechowego. Parametry badań czynnościowych układu oddechowego (FEV1 i FVC) nie różnią się od wyników uzyskiwanych u pacjentów bez MRSA [27, 28]. Mimo obserwowanego zmniejszenia wartości FEV1 (spadek średniej wartości FEV1 z 96,7% do 84,2%) w badanej grupie pacjentów w ciągu 8 lat nie zaobserwowano wpływu kolonizacji MRSA na ten wskaźnik. Kolonizacja szczepem metycylino-opornym, nawet przy braku objawów pogarszania się stanu klinicznego, jest wskazaniem do częstszych badań kontrolnych. W przebiegu zaostrzeń oskrzelowo-płucnych częściej wskazana jest hospitalizacja i intensywna antybiotykoterapia dożylna. Leczenie jest uciążliwe dla chorego oraz obarczone ryzykiem powikłań. Podczas hospitalizacji pacjenci z kolonizacją lub zakażeniem MRSA powinni być izolowani, aby zminimalizować ryzyko transmisji tych szczepów na innych pacjentów. W zakażeniach dolnych dróg oddechowych wywołanych szczepami MRSA coraz częściej stosowany jest linezolid [2, 27]. Wszystkie badane izolaty MRSA zachowały pełną wrażliwość na linezolid oraz glikopeptydy. Do długotrwałej kolonizacji dróg oddechowych pacjentów z mukowiscydozą przyczynia się patomechanizm choroby. Gęsty, lepki śluz stwarza doskonałe warunki do zasiedlania przez drobnoustroje, które cechują się znaczną heterogennością [1, 2]. Gronkowce złociste izolowane od chorych na mukowiscydozę wykazują zdolność do wytwarzania śluzu zewnątrzkomórkowego i biofilmu oraz tzw. form małych
kolonii (small colony variants; SCV). Taka zmienność fenotypowa może być przyczyną uporczywych i nawracających zakażeń, które ulegają reaktywacji mimo stosowania celowanego leczenia [30, 31].
Wnioski Przeprowadzone badania wykazały, że szczepy Staphylococcus aureus izolowane od dzieci chorych na mukowiscydozę charakteryzują się zdolnością do długotrwałej, nawet wieloletniej kolonizacji dróg oddechowych. Długotrwała kolonizacja dotyczyła szczepów MRSA oraz MSSA. Szczepy nie ulegały eradykcji mimo zastosowania celowanej antybiotykoterapii. U chorych na mukowiscydozę istnieje możliwość jednoczesnej kolonizacji dróg oddechowych kilkoma szczepami S. aureus o odmiennym genotypie i profilu lekooporności. Nie stwierdzono istnienia klonów charakterystycznych dla badanej populacji pacjentów z CF. Potwierdzono jednak ryzyko transmisji szczepów między pacjentami. Nadmierne stosowanie antybiotyków może prowadzić do narastania oporności, dlatego decyzję o zastosowaniu leczenia oraz ocenę jego skuteczności należy podejmować, biorąc pod uwagę objawy kliniczne, wyniki badania przedmiotowego, badań pomocniczych, ze szczególnym uwzględnieniem diagnostyki mikrobiologicznej.
Wkład autorów/Authors' contributions KS – zasadniczy wkład w koncepcję i projekt pracy, zebranie danych, analiza i interpretacja danych oraz napisanie artykułu. KD-F, DD – wkład w koncepcję i projekt pracy, krytyczne zrecenzowanie pracy oraz akceptacja ostatecznej wersji do opublikowania. HD – analiza danych i krytyczne zrecenzowanie pracy oraz akceptacja ostatecznej wersji do opublikowania. BF – zebranie danych.
Konflikt interesu/Conflict of interest Nie występuje.
pi smiennictwo/references
[1] Lyczak JB, Cannon CL, Pier GB. Lung Infections Associated with Cystic Fibrosis. ClinMicrobiol Rev 2002;15(2):194–222. [2] Saiman L. Siegel J and the Cystic Fibrosis Foundation Consensus Conference on Infection Control Participants. Infection control recommendations for patients with cystic fibrosis: microbiology, important pathogens, and infection control practices to prevent patient-to-patients transmission. Infect Control Hosp Epidemiol 2005;24(5): 6–53. [3] Mazurczak T. Mukowiscydoza, dziedziczenie, etiopatogeneza, diagnostyka i leczenie. Instytut Matkii Dziecka 2006. [4] Armstrong DS, Grimwood K, Carlin JB, Carzino R, Olinsky A, Phelan PD. Bronchoalveolar lavage and oropharyngeal
pediatria polska 87 (2012) 545–551
[5] [6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12] [13]
[14]
[15]
[16] [17]
[18]
cultures to identify lower respiratory pathogens in infants with cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol 1996;21:267–275. Saiman L, Siege J. Infection Control in Cystic Fibrosis. Clin Microbiol Rev 2004;17(1):57–71. Kerem E, Conway S, Elborn S, Heijerman H. Standards of care for patients with cystic fibrosis: a European consensus For the Consensus Committee1. J Cyst Fibros 2005;4:7–26. Ratjen F. Changes in strategies for optimal antibacterial therapy in cystic fibrosis. Int J Antimicrob Agents 2001;17:93–96. Southern KW, Littlewood AE, Littlewood JM. The prevalence and significance of chronic Staphylococcus aureus infection in patients with cystic fibrosis on long-term flucloxacillin. W: Escobar H, Baquero CF, Svarez L, reds. Clinical Ecology of Cystic Fibrosis. Amsterdam: Elsevier Science Publishers; 1993. p. 129–130. Smyth A, Walters S. Prophylactic anti-staphylococcal antibiotics for cystic fibrosis (Cochrane Review). The Cochrane Library 2006;1:1465–1858. Semczuk K, Dmeńska H, Dzierżanowska D, Kołodziejczyk M, Gabińska E, Zaręba H. Analiza Drobnoustrojów izolowanych z dróg oddechowych chorych na mukowiscydozę leczonych w IP-CZD w latach 1999-2002. Pneumonol Alergolog Pol 2005;73:48–54. Consensus Conference Management of patients with cystic fibrosis 18-19 November 2002 Palais du Luxembourg – Paris. Management of patients with cystic fibrosis (pulmonary disease and infection) Société Française de Pédiatrie 2002: 2-14. Dzierżanowska D. Antybiotykoterapia praktyczna. a-medicapress 2008. Alvarez-Elcoro S, Enzler MJ. Repetytorium z leków przeciwdrobnoustrojowych cz. III: Makrolidy: erytromycyna, klarytromycyna i azytromycyna. Med Prakt Ped 2000;3. Ferrara G, Losi M, Franco F, Corbetta L, Fabbri LM, Richeldi L. Macrolides in the treatment of asthma and cystic fibrosis. Respir Med 2005;99:1–10. Mizukane R, Hirakata Y, Kaku M, Ishii Y, Furuya N, Ishida K, et al. Comparative in vitro exoenzyme-supressingactivites of azithromycin and other macrolide antibiotics against Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 1994;38:528–533. Southern KW, Barker PM. Azithromycin for cystic fibrosis. EurRespir J 2004;24:834–838. Wagner T, Soong G, Sokol S, Saiman L, Prince A. Effects of Azithromycin on Clinical Isolates of Pseudomonas aeruginosa From Cystic Fibrosis Patients. Chest 2005;128:912–919. Juda M, Grzegorczyk A, Biernasiuk A, Korona-Głowniak I, Bogut A, Malm A. Lekowrażliwość szczepów Staphylococcusaureus kolonizujących nosogardziel u zdrowych dzieci w wieku przedszkolnym. Ped Pol 2006;81 (6):413–417.
551
[19] Kosikowska U, Juda M, Malm A, Jóźwiakowska M, Tuszkiewicz-Misztal E. Lekowrażliwość szczepów Haemophilus sp. i Staphylococcus aureus kolonizujących drogi oddechowe u dzieci z mukowiscydoą. Przegl Epidemiol 2007;61:377–384. [20] Goering RV, Bauernfeind A, Lenz W, Przyklenk B. Staphylococcus aureusin patients with cystic fibrosis: an epidemiological analysis using a combination of traditional and molecular methods. Infection 1990;18:57–60. [21] Branger C, Fournier JM, Loulergue J, Bouvet A, Goullet P, Boutonnier A, et al. Epidemiology of Staphylococcus aureus in patients with cystic fibrosis. Epidemiol Infec 1994;112 (3):489–500. [22] Branger C, Gardye C, Lambert-Zechovsky N. Persistence of Staphylococcus aureus strains among cystic fibrosis patients over extended periods of time. J Med Microbiol 1996;45(4):294–301. [23] Renders N, Van Belkum A, Overbeek S, Mouton J, Verbrugh H. Molecular epidemiology of Staphylococcus aureus strains colonising the lungs of related and unrelated cystic fibrosis patients. ClinMicrobiol Infect 1997;3:216–221. [24] Kidd TJ, Appl B, Coulter C. Epidemiological Analysis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus isolates from adult Patients with cystic fibrosis. Infect Control Hosp Epidemiol 2006;27:201–203. [25] Goerke C, Kraning K, Stern M, Doring G, Botzenhart K, Wolz C. Molecular epidemiology of community-acquired Staphylococcus aureus in families with and without cystic fibrosis patients. J Infect Dis 2000;181:984–989. [26] Vergison A, Denis O, Deplano A, Casimir G, Claeys G, DeBaets F. National survey of molecular epidemiology of Staphylococcus aureus colonization in Belgian cystic fibrosis patients. J Antimicrob Chemother 2007;59(5): 893–899. [27] Miall LS, McGinley NT, Brownlee KG, Conway SP. Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infection in cystic fibrosis. Arch Dis Child 2001;84:160–162. [28] Thomas SR, Gaya H, Hodson ME. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: impact at a national cystic fibrosis centre. J Hospit Inf 1998;40:203–209. [29] Antimicrobial resistance Surveillance in Europe Annual report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network 2009. European Centre for Disease Prevention and Control, 2010. www.ecdc.europa.eu. [30] Semczuk K, Dzierżanowska-Fangrat K, Dmeńska H, Dzierżanowska D. Częstość występowania fenotypów small colony variants wśród szczepów Staphylococcus aureus izolowanych od dzieci chorych na mukowiscydozę. Med Dośw Mikrobiol 2008;60:319–328. [31] Semczuk K, Dzierżanowska-Fangrat K, Dmeńska H, Dzierżanowska D. Ocena wytwarzania biofilmu przez szczepy Staphylococcus aureus izolowanych od dzieci chorych na mukowiscydozę. Med Dośw Mikrobiol 2008;60:311–318.
Dostępne online www.sciencedirect.com
journal homepage: www.elsevier.com/locate/pepo
Artykuł oryginalny/Original research article
Analiza genotypowa oraz profil lekowrażliwości szczepów Staphylococcus aureus izolowanych od dzieci chorych na mukowiscydozę Genetic fingerprinting and antimicrobial susceptibility profiles of Staphylococcus aureus strains isolated from children with cystic fibrosis Katarzyna Semczuk 1,*, Katarzyna Dzierżanowska-Fangrat 1, Hanna Dmeńska 2, Beata Fronc 1, Danuta Dzierżanowska 1 1 Zakład Mikrobiologii i Immunologii Klinicznej, Instytut ,,Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka’’ Kierownik: prof. nadzw. dr hab. n. med. Katarzyna Dzierżanowska-Fangrat, Warszawa, Poland 2 Poradnia Pulmonologiczna, Instytut ,,Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka’’ Kierownik: dr n. med. Przemysław Westfal, Warszawa, Poland
informacje o artykule
abstract
Historia artykułu:
Background: The pathophysiology of cystic fibrosis (CF) is associated with genetically
Otrzymano: 23.08.2012
determined abnormal chloride conductance on the apical membrane of the epithelial
Zaakceptowano: 04.09.2012
cell. As a result favourable environment for bacterial and fungal infections is maintained.
Dostępne online: 07.09.2012
Respiratory tract infections in CF patients are caused mainly by Staphylococcus aureus, Haemphilus influenzae, and Pseudomonas aeruginosa which is the most destructive pulmo-
Słowa kluczowe: mukowiscydoza
nary pathogen. Objectives: The aim of this study was to analyse genetic diversity and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus strains isolated from children with
Staphylocccus aureus PFGE
cystic fibrosis. Material and methods: A total of 21 patients with confirmed cystic fibrosis
lekowrażliwość
collected, and 201 isolates of S. aureus were cultured. Genotyping was performed using
were included to the study. Within 8 years 257 specimens from the respiratory tract were the pulsed field gel electrophoresis (PFGE) technique, and antimicrobial susceptibility was
Keywords: Cystic fibrosis Staphylocccus aureus PFGE Antimicrobial susceptibility
determined by the E-test method. The following data were retrieved from medical records: age at CF diagnosis, clinical signs and symptoms, respiratory function (FEV1), frequency of hospitalization and antibiotic use. Results and conclusions: The mean age of patients studied was 7 years (range 0.5–16 years). Over 80% of patients had pulmonary manifestations. The genotyping confirmed that Staphylococcus aureus persistently colonized the respiratory tract of patients with CF. For over 95% of strains the colonization lasted from 6 months to 8 years. Less than 5% of strains did not show a tendency for a long-term colonization, and they were isolated only once. In 34% of patients the same genotype was isolated through the study period, and it could not be eradicated despite antibiotic treatment. As many as 62% of children were persistently colonized with 2 or 3 strains simultaneously. Over 94% of strains were susceptible to b-lactams, fluoroquinolones,
* Adres do korespondencji: Zakład Mikrobiologii i Immunologii Klinicznej, Instytut ,,Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka’’, Al. Dzieci Polskich 20, 04-730 Warszawa. Tel.: +48 22 815 72 70; mobile: +48 506 141 656; fax: +48 22 815 72 75. Adres email: [email protected] (K. Semczuk). 0031-3939/$ – see front matter © 2012 Polish Pediatric Society. Published by Elsevier Urban & Partner Sp. z o.o. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.pepo.2012.09.003
546
pediatria polska 87 (2012) 545–551
trimethoprim/sulfamethoxazole, aminoglycosides, and glycopeptides. The highest rates of resistance were observed for macrolides (23%) which were the second most commonly used antibiotics in bronchopulmonary exacerbations. Some of S. aureus strains were effectively transmitted among the patients. However, only methicillin-susceptible isolates (MSSA) were involved in the transmission. MRSA transmission was not detected. © 2012 Polish Pediatric Society. Published by Elsevier Urban & Partner Sp. z o.o. All rights reserved.
Wprowadzenie Mukowiscydoza (zwłóknienie torbielowate – cystic fibrosis; CF) jest najczęstszą genetycznie uwarunkowaną, monogenową chorobą populacji kaukaskiej. Najczęstszą postacią kliniczną mukowiscydozy jest przewlekła choroba oskrzelowo-płucna. Objawy zajęcia procesem chorobowym układu oddechowego występują w 1. r. ż. u prawie połowy chorych. Zmiany w układzie oddechowym mają decydujący wpływ na jakość i długość życia. W dalszym ciągu u 80–95% chorych główną przyczyną upośledzenia funkcji życiowych i zgonu jest niewydolność oddechowa spowodowana nieodwracalnym uszkodzeniem płuc [1, 2]. Płuca i gruczoły śluzowe noworodków chorych na mukowiscydozę w większości wypadków nie wykazują zmian morfologicznych, ale wkrótce pojawiają się objawy procesu zapalnego, który wyraźnie poprzedza infekcję. Genetycznie uwarunkowane zaburzenia wodno-elektolitowe na powierzchni szczytowej komórek nabłonka oddechowego wytwarzają środowisko sprzyjające zakażeniom bakteryjnymi i grzybiczym. Reakcją na zakażenie jest napływ granulocytów obojętnochłonnych, wysięk i nadprodukcja gęstego i lepkiego śluzu [3]. Nadmierna aktywność neutrofili i upośledzony klirens śluzowo-rzęskowy sprzyjają infekcjom oskrzelowo-płucnym, za które odpowiada ograniczona grupa drobnoustrojów oportunistycznych. Gronkowiec złocisty izolowany jest jako jeden z pierwszych patogenów kolonizujących drogi oddechowe i dominuje u pacjentów poniżej 10. roku życia [4]. W erze przedantybiotykowej u chorych niemowląt większość zaostrzeń oskrzelowo-płucnych powodował gronkowiec złocisty, przyczyniając się do wczesnej i wysokiej śmiertelności. Obecnie zastosowanie kompleksowego leczenia, w tym intensywnej antybiotykoterapii, pozwoliło na wydłużenie i poprawę jakości życia chorych na mukowiscydozę [1, 5]. W przedstawionej pracy oceniano grupę pacjentów z mukowiscydozą, u których obserwowano przewlekłą kolonizację dróg oddechowych gronkowcem złocistym. Celem pracy była analiza genetyczna szczepów Staphylococcus aureus, określenie czasu utrzymywania się jednego genotypu gronkowca oraz ocena profilu lekooporności.
Materiał i metody Analizą objęto 21 chorych na mukowiscydozę leczonych w Instytucie ,,Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka’’ w Warszawie. Na podstawie dokumentacji medycznej uzyskano
dane dotyczące wieku, w którym rozpoznano chorobę, objawów klinicznych, wyników badań czynnościowych układu oddechowego (FEV1 – natężona objętość wydechowa pierwszosekundowa), liczby hospitalizacji, antybiotykoterapii stosowanej w ciągu 8 lat obserwacji. Podczas rutynowych wizyt w Poradni Pulmonologicznej IP-CZD, odbywających się przeciętnie raz na kwartał, wykonywano badania mikrobiologiczne. Materiał stanowiła plwocina lub ,,głęboki’’ wymaz z gardła, uzyskiwany od pacjentów mających trudności z odkrztuszaniem. Pobrane materiały posiewano na podłoża mikrobiologiczne (BBL, Graso, Biomerieux) i inkubowano w warunkach tlenowych. Gronkowiec złocisty izolowany był z podłoża agar Columbia, Chapmana i identyfikowany z wykorzystaniem klasycznych metod diagnostycznych. Wrażliwość na antybiotyki była oznaczona metodą ilościową za pomocą dyfuzji z paska z gradientem stężeń antybiotyków (E-test, AB Biodisc, obecnie Biomerieux) na podłożu agarowym Muller Hinton. Warunki inkubacji i interpretacji wyników przebiegały zgodnie z zaleceniami CLSI (Clinical and LaboratoryStandards Institute) z 2007 r. Metycylino-wrażliwość oznaczono metodami fenotypowymi, tj. dyfuzyjno-krążkową z cefoksytyną oraz testem lateksowym Slidex MRSA Detection (Biomerieux) do wykrywania białka PBP2a. Dla szczepów opornych zastosowano również metodę genetyczną PCR do wykrywania genu mecA (DNA Gdańsk). Fenotyp oporności na makrolidy i linkozamidy oznaczono, stosując metodę dyfuzyjno-krążkową z erytromycyną 15 mg oraz klindamycyną 2 mg, tzw. D-test. Typowanie genetyczne uzyskanych izolatów S. aureus wykonano metodą PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis – elektroforeza w pulsującym polu elektrycznym), stosując do izolacji DNA zestawy GenePath Universal Module (Bio-Rad), a do trawienia GenePath Enzyme Module Group 1 z enzymem restrykcyjnym SmaI (Bio-Rad). Analizę pokrewieństwa wykonano za pomocą programu Molecular Analyst Fingenprinting Plus (BioRad), stosując współczynnik Dice'a oraz kryteria Tenovera. Główne genotypy, czyli klony, oznaczano dużą literą alfabetu (np. A), do podtypów dodawano kolejno cyfry arabskie (np. A1, A2,...).
Wyniki Wiek pacjentów w momencie rozpoczęcia badań wynosił od 6 miesięcy do 16 lat (śr. wiek 7 lat). W badanej grupie 21 pacjentów były dwa dwuosobowe rodzeństwa. Pacjenci prezentowali charakterystyczne objawy dla mukowiscydozy, przede wszystkim ze strony układu oddechowego i pokarmowego. Zmiany w układzie oddechowym objawiały
547
pediatria polska 87 (2012) 545–551
Tabela I – Charakterystyka badanych chorych z mukowiscydozą Table I – Characteristics of the study populationof patients with cystic fibrosis Liczba badanych pacjentów Wiek pacjentów w latach (średni; zakres) Płeć męska/żeńska Wiek rozpoznania CF w latach (średni; zakres) Objawy kliniczne ze strony układu oddechowego (liczba pacjentów; %) Wartość współczynnika FEV1 w 1998 r. (średni; zakres) Wartość współczynnika FEV1 w 2005 r. (średni; zakres) Średnia liczba hospitalizacji przypadająca na pacjenta Pacjenci skolonizowani metycylinoopornym szczepem S. aureus – MRSA (liczba; %) Pacjenci skolonizowani pałeczką Pseudomonas aeruginosa (liczba; %)
21 7 (0,5–16) 8/13 5,3 (0,1–16) 17 (81%) 96,7 (48–124) 84,2 (62–114) 2,6 3 (14%) 15 (71%)
się nawracającymi zapaleniami płuc i oskrzeli, postępującą chorobą oskrzelowo-płucną, z okresowymi zaostrzeniami, zapaleniem zatok przynosowych. Ze strony układu pokarmowego obserwowano niewydolność trzustki, u starszych pacjentów cechy niewydolności wątroby oraz cukrzycę. W okresie obserwacji u jednego pacjenta przeprowadzono transplantację wątroby. Ponad 90% (19) pacjentów wymagało co najmniej jednokrotnej hospitalizacji. Charakterystykę badanych chorych z mukowiscydozą przedstawiono w tabeli I. Każdy z pacjentów kilkakrotnie w ciągu roku wymagał antybiotykoterapii. Najczęściej stosowaną grupą leków były antybiotyki beta-laktamowe (36%), rzadziej makrolidy (21%) oraz fluorochinolony (14%). W analizowanym okresie pobrano 257 badań (86 próbek plwociny i 171 wymazów z gardła), z których uzyskano 201 izolatów Staphylococcus aureus. W 22 (8%) badaniach, pochodzących od 7 (33%) pacjentów, uzyskano po dwa fenotypowo zróżnicowane szczepy gronkowca złocistego. Zidentyfikowano 18 izolatów MRSA, które pochodziły od 3 (14%) pacjentów.
Wyniki lekowrażliwości na podstawie wartości MIC, zakres uzyskanych wartości oraz MIC50 i MIC90 przedstawiono w tabeli II. Fenotyp oporności na makrolidy miał najczęściej (73%) charakter indukcyjny MLSb. U 15 (71%) pacjentów uzyskano również izolację pałeczek Pseudomonas aeruginosa. Wyniki analizy wzorów PFGE wykazały, że u 7 (34%) pacjentów w okresie prowadzenia badań, tj. 8 lat, izolowano ten sam szczep o identycznym wzorze restrykcyjnym i niezmiennym fenotypie lekooporności. U kolejnych 8 (38%) pacjentów zróżnicowano po 2 genotypy (A i B), z wyraźną dominacją jednego typu, dłużej utrzymującego się i drugiego izolowanego sporadycznie. U 5 (24%) pacjentów uzyskano szczepy należące do 3 różnych genotypów, które izolowano kilkukrotnie w ciągu 8 lat obserwacji. Tylko u jednego z pacjentów uzyskano 8 izolatów, które zaliczono do 5 różnych genotypów. Porównanie wzorów PFGE 201 izolatów S. aureus pozwoliło na wyodrębnienie 41 genotypów. Znaczna większość szczepów wykazywała tendencję do długotrwałej kolonizacji. Czas trwania kolonizacji dla 31 szczepów wyniósł od 6 miesięcy do 8 lat (średni czas trwania kolonizacji określono na 4 lata). U każdego pacjenta zidentyfikowano co najmniej jeden szczep, który izolowany był minimum dwukrotnie. Do klonów sporadycznych, czyli uzyskanych jednorazowo, należało 10 szczepów, które izolowano u 4 pacjentów.
Omówienie Chorzy na mukowiscydozę od momentu rozpoznania objęci są wielospecjalistyczną opieką lekarską. Częstość wizyt i badań uzależniona jest od wieku i stanu klinicznego chorego. Jednym z elementów opieki są regularnie wykonywane badania mikrobiologiczne, które pozwalają na monitorowanie flory kolonizującej drogi oddechowe, a także ustalenie celowanej antybiotykoterapii w przypadku pojawiających się zaostrzeń oskrzelowo-płucnych [6, 7]. Częstość występowania gronkowca złocistego w drogach oddechowych chorych na mukowiscydozę wynosi 10–90% i w dużej mierze zależy od zasad prowadzonej profilaktyki przeciwbakteryjnej [8]. Jak wykazały badania, wczesna
Tabela II – Lekowrażliwość 201 izolatów S. aureus (zakres wartości MIC – minimalne stężenie hamujące, wartość MIC50 i MIC90) Table II – Antimicrobial susceptibility of 201 isolates of S. aureus (range of values MIC – minimal inhibitory concentration, value MIC50 i MIC90) Antybiotyk/Chemioterapeutyk Metycylina Cefuroksym Amoksycylina /kw.klawulanowy Erytromycyna Klindamycyna Trimetoprim/Sulfametoksazol Gentamycyna Cyprofloksacyna Wankomycyna Linezolid
Zakres MIC mg/ml
MIC 50
MIC 90
% izolatów wrażliwych
0,125–256 0,125–16 0,094–256 0,064–256 0,047–256 0,023–4 0,064–32 0,064–12 0,5–1,5 0,5–1
1 0,5 0,38 0,19 0,094 0,047 0,25 0,125 1 0,5
2 1 0,75 24 0,5 0,094 1 0,5 1 1
94
77 84 99 95 98 100 100
548
pediatria polska 87 (2012) 545–551
profilaktyka przeciwbakteryjna, zastosowana przed 2.–3. roku życia skutecznie zmniejsza częstość kolonizacji dróg oddechowych i obniża liczbę zaostrzeń ze strony układu oddechowego [7–9]. W latach 1999–2001 u 86% pacjentów chorych na mukowiscydozę leczonych w Poradni Pulmonologicznej oraz Klinice i Poradni Gastroenterologii Hepatologii i Żywienia IP-CZD izolowano gronkowca złocistego, a u 39% pałeczki ropy błękitnej [10]. W prezentowanej pracy analizowano grupę pacjentów konsultowanych w latach 1998–2005, u których obserwowano przewlekłą kolonizację gronkowcem złocistym. Średnia wieku chorych z badanej grupy wynosiła 7 lat, a mukowiscydozę rozpoznano średnio w 5,3 roku życia. Średnią wieku rozpoznania choroby zawyżyła pacjentka, u której mukowiscydozę zdiagnozowano dopiero w wieku 16 lat (typ mutacji delta F 508/3849 + 10 kbC). U pozostałych pacjentów chorobę rozpoznawano poniżej 4. r. ż. W ciągu 8 lat w badanej grupie częstość izolacji gronkowca złocistego wzrosła z 74% w 1998 roku do 100% w 2005 roku. Leczenie zmian oskrzelowo-płucnych u chorych na mukowiscydozę wymaga kompleksowej i skojarzonej terapii, tj. stosowania leków mukolitycznych, rozszerzających oskrzela, leków przeciwzapalnych, antybiotyków oraz fizjoterapii. Antybiotyki stosowane są w przypadku nowych zakażeń oskrzelowo-płucnych oraz w zaostrzeniach przewlekłych zmian zapalnych. Rozpoznanie zaostrzenia choroby oskrzelowo-płucnej jest wskazaniem do przeprowadzenia terapii antybiotykami dobranymi na podstawie lekowrażliwości flory bakteryjnej [6, 7, 11]. U ponad 80% pacjentów podczas planowych wizyt w Poradni Pulmonologicznej występowały objawy ze strony układu oddechowego. W leczeniu najczęściej stosowane były antybiotyki beta-laktamowe (min. amoksycylina, amoksycylina z kw. klawulanowym, cefadroksyl, cefaklor, cefuroksym) oraz makrolidy (klarytromycyna, azytromycyna, spiramycyna, roksytromycyna). Badane szczepy charakteryzowały się bardzo dobrą wrażliwością na metycylinę (94%), co warunkuje wrażliwość na pozostałe leki beta-laktamowe. Znacznie mniej szczepów było wrażliwych na makrolidy (77%). Oporność na makrolidy miała głównie fenotyp MLSB o charakterze indukcyjnym (73%), który wyklucza możliwość stosowania w terapii antybiotyków makrolidowych oraz linkozamidów. Narastanie oporności na makrolidy niewątpliwie może być związane ze zwiększoną częstością stosowania tej grupy leków u pacjentów chorych na mukowiscydozę. Powszechność stosowania antybiotyków makrolidowych u chorych na mukowiscydozę związana jest nie tylko z aktywnością przeciwbakteryjną, ale również ze zdolnością penetracji wewnątrzkomórkowej oraz właściwościami immunomodulującymi. Wykazano także wpływ makrolidów na klirens śluzowo-rzęskowy, polegający na zmniejszeniu produkcji śluzu i jego lepkości [12, 13]. Makrolidy nie są aktywne wobec pałeczek Pseudomonas aeruginosa, jednak badania wykazały, że długotrwałe stosowanie makrolidów ogranicza syntezę niektórych białek, między innymi proteazy, elastazy czy leukocydyny, oraz hamuje syntezę piocyjaniny i egzotoksyny A, a także zakłóca proces tworzenia biofilmu. U pacjentów przewlekle leczonych azytromycyną wykazano znaczną poprawę
wydolności oddechowej, zmniejszenie ryzyka zaostrzeń płucnych, zmniejszenie częstości podawania leków w postaci dożylnej i konieczności hospitalizacji [14–17]. Oporność na makrolidy wśród szczepów gronkowca złocistego jest bardzo zróżnicowana. Badania przeprowadzone w Polsce na szczepach Staphylococcus aureus kolonizujących górne drogi oddechowe zdrowych dzieci w wieku przedszkolnym wykazały nieco niższy odsetek oporności na erytromycynę. U dzieci w wieku 3–5 lat uczęszczających do przedszkola wynosił on 15,4%, a w grupie kontrolnej (dzieci pozostające w domu) – 9,4%. W obu grupach odnotowano przewagę fenotypu indukcyjnego MLSB [18]. U chorych na mukowiscydozę wśród szczepów MSSA i MRSA zaobserwowano dominację fenotypu MLSB konstytutywnego, a oporność na makrolidy była najczęściej występującym mechanizmem oporności (50%) [19]. Narastanie oporności na antybiotyki może skutkować długotrwałą kolonizacją szczepami wieloopornymi. W badaniach nad przewlekłą kolonizacją dróg oddechowych pacjentów z CF początkowo wykorzystywano metody fenotypowe. W jednej z pierwszych analiz epidemiologicznych wykazano, że tylko 17% pacjentów wydawało się trwale skolonizowanych jednym fenotypem gronkowca, a czas trwania kolonizacji oceniono maksymalnie na 10 miesięcy. Badacze wnioskowali, że pacjenci zakażani są przez kolejne szczepy [20]. Podobne wyniki otrzymywali inni autorzy. Kolonizację jednym, dominującym szczepem gronkowca złocistego wykazano, w zależności od badań, u 21–73% pacjentów z CF [21–23]. Ten sam szczep gronkowca złocistego izolowano ponownie po 19–31 miesięcy mimo zastosowanego leczenia [22, 24]. W badanej populacji dzieci chorych na mukowiscydozę izolowane szczepy gronkowca złocistego nie ulegały eradykacji, pomimo wrażliwości in vitro na antybiotyki stosowane w leczeniu zaostrzeń oskrzelowo-płucnych. Przed i po zastosowanej antybiotykoterapii izolowano te same szczepy, co zobrazowały wyniki badań genetycznych. Typowanie metodą PFGE wykazało, że u 34% pacjentów występował niezmienny genotyp gronkowca złocistego, mimo że przerwy między kolejnymi izolacjami wynosiły niekiedy 2 lata (Ryc. 1). U pozostałych 62% pacjentów również obserwowano przewlekłą kolonizację, ale co najmniej 2 lub 3 różnymi szczepami równocześnie. Niektóre szczepy były izolowane nawet po kilku latach. U wszystkich badanych pacjentów uzyskano co najmniej jeden szczep, którego czas utrzymywania się w drogach oddechowych wynosił od 6 miesięcy do 8 lat. Analiza genetyczna ujawniła również możliwość kolonizacji dróg oddechowych co najmniej 2 różnymi szczepami jednocześnie. Wykrywanie tego zjawiska podczas rutynowej, klasycznej diagnostyki mikrobiologicznej może być utrudnione na skutek słabo wyrażonych różnic w fenotypie. Ma to szczególnie znaczenie, gdy drogi oddechowe kolonizują szczepy wrażliwy i oporny, zwłaszcza na antybiotyki beta-laktamowe czy makrolidy. W badanej grupie u 7 (33%) pacjentów z jednego badania izolowano po 2 różne szczepy gronkowca (Ryc. 2). W badaniach Brangera i wsp. zjawisko jednoczesnej współkolonizacji dwóch różnych szczepów wykazano u 3% badanych pacjentów z CF [21, 22].
pediatria polska 87 (2012) 545–551
[(Ryc._1)TD$FIG]
[(Ryc._3)TD$FIG]
Ryc. 1 – Wzory PFGE szczepów S. aureus izolowanych od pacjentów z mukowicydozą; pacjent z przewlekłą kolonizacją MRSA (ten sam szczep izolowany w latach 2000–2005) Fig. 1 – Pulsed-field gelelectrophoresis patterns S. aureus isolated from cystic fibrosis patients; patient with chronic colonization of MRSA (the same strain isolated in years 2000– 2005)
[(Ryc._2)TD$FIG]
Ryc. 2 – Wzory PFGE szczepów S. aureus izolowanych od pacjentów z mukowicydozą; pacjent, u którego izolowano 3 zróżnicowane genotypowo i fenotypowo klony S. aureus (A, B, C) w latach 1998–2004 (w 2004 r. z jednego badania izolowano 2 różne szczepy A i C) Fig. 2 – Pulsed-field gelelectrophoresis patterns S. aureus isolated from cystic fibrosis patients; patient with 3 genotype and phenotype different strains S.aureus (A,B, C) in years 1998–2004 (in 2004, isolation of 2 different strais – A and C)
Metody typowania genetycznego najczęściej stosowane są głównie w dochodzeniach epidemiologicznych w celu ujawnienia zjawiska krzyżowych infekcji. Pacjenci z mukowiscydozą objęci stałą opieką wielospecjalistyczną często poddawani są hospitalizacji, rehabilitacji w tych samych ośrodkach. W warunkach polskich nie ma ośrodków przeznaczonych do leczenia chorych na CF, które zapewniałyby
549
Ryc. 3 – Porównanie wzorów PFGE szczepów izolowanych od rodzeństwa (XVIII i XX) w latach 2000–2005; na przestrzeni 5 lat nie doszło do wymiany szczepów między pacjentami Fig. 3 – Comparison of pulsed-field gel electrophoresis patterns of isolates from siblings (XVIII i XX) in years 2000–2005; over the 5 years there has been no exchange of strains between patients
ochronę przed zakażeniami krzyżowymi. W większości polskich szpitali nie ma również możliwości separacji pacjentów z CF pod względem bakteriologicznym (pacjentów bez kolonizacji Pseudomonas aeruginosa czy MRSA od pacjentów zakażonych). Taka sytuacja sprzyja transmisji szczepów między chorymi. Wyniki typowania genetycznego w badanej grupie potwierdziły możliwość przenoszenia szczepów między pacjentami. Zjawisko to dotyczyło jednak tylko 2 pacjentów, którzy należeli do jednej z dwóch par rodzeństwa (VIII i X). U drugiej pary (XVIII i XX) na przestrzeni 5 lat nie zaobserwowano transmisji szczepów (Ryc. 3), każdy z pacjentów skolonizowany był szczepem o odmiennym wzorze restrykcyjnym. U 4 pacjentów uzyskano szczepy blisko spokrewnione, ale nie identyczne. W badanej grupie 21 pacjentów nie stwierdzono obecności klonów charakterystycznych dla badanej populacji. U pacjentów chorych na mukowiscydozę istotne zagrożenie stanowi rozprzestrzenianie się szczepów gronkowca złocistego opornego na metycylinę (MRSA). W literaturze znane są doniesienia o transmisji szczepów MRSA podczas hospitalizacji lub w trakcie wspólnych obozów rehabilitacyjnych [2, 24, 25]. O możliwości klonalnego szerzenia szczepów metycylinoopornych świadczą wyniki badań Kidd i wsp., którzy wykazali obecność endemicznego szczepu MRSA u 10 dorosłych pacjentów z CF [24]. Również w badaniach Vergison i wsp. potwierdzono klonalne szerzenie się szczepów MRSA. W grupie belgijskich pacjentów chorych na mukowiscydozę 67% szczepów MRSA zakwalifikowano do szczepów o charakterze epidemicznym [26]. Częstość kolonizacji szczepami MRSA chorych na mukowiscydozę jest bardzo zróżnicowana w zależności od kraju i ośrodka. Według rejestru pacjentów z CF prowadzonego w Stanach Zjednoczonych, wynosi od 0–23%, średnio około 7% [2]. Badania przeprowadzone w Royal Brompton Hospital w Londynie na przestrzeni 32 lat (1965–1997) wśród 974 chorych na mukowiscydozę wykazały obecność MRSA jedynie u 26 pacjentów (2,7%) [27, 28]. W cytowanym wcześniej
550
pediatria polska 87 (2012) 545–551
belgijskim badaniu częstość izolacji MRSA określono średnio na 5% (0–17%) [26]. W badanej przez nas populacji 21 chorych, na przestrzeni 8 lat, szczepy MRSA uzyskano jedynie od 3 (14%) pacjentów (I, XIV, XIX). Analizując dane o częstości izolacji MRSA w poszczególnych krajach, można stwierdzić, że grupa pacjentów z mukowiscydozą nie odbiega znacząco od innych grup chorych. Według raportu EARSS (European Antimicrobial Resistance Surveillance System), częstość występowania szczepów MRSA w Europie w 2009 roku wynosiła w zależności od kraju 1–50%, w Polsce średnio 20% [29]. Analiza profili restrykcyjnych uzyskanych szczepów MRSA wykazała, że należały one do 3 różnych, niespokrewnionych ze sobą klonów, z wyraźną różnicą w profilu oporności. W przypadku dwóch pacjentów (I, XIV) były to typowe wielooporne szczepy szpitalne z dodatkową opornością na tetracyklinę, erytromycynę, klindamycynę, a także kotrimoksazol i cyprofloksacynę. Pacjenci byli wielokrotnie hospitalizowani, min. w IP-CZD oraz innych placówkach. U jednego z nich (XIV) w 2001 roku w Belgii przeprowadzono transplantację wątroby. U trzeciego pacjenta (XIX) izolowano szczep MRSA wrażliwy na wszystkie pozostałe grupy leków, jedynie w ostatnim roku obserwacji wykryto oporność na makrolidy o fenotypie M. We wszystkich przypadkach kolonizacja miała charakter długotrwały, wynosiła od 2 do 8 lat. W ciągu 8 lat nie doszło do przeniesienia szczepów MRSA na innych pacjentów z CF. Znaczenie kliniczne kolonizacji szczepami metycylinoopornymi pacjentów chorych na mukowiscydozę od lat budzi kontrowersje. Znane są doniesienia, z których wynika, że pacjenci z izolacją MRSA wymagają częstszego leczenia antybiotykami i mają bardziej zaawansowane zmiany radiologiczne w płucach. Nie obserwowano natomiast pogorszenia funkcji układu oddechowego. Parametry badań czynnościowych układu oddechowego (FEV1 i FVC) nie różnią się od wyników uzyskiwanych u pacjentów bez MRSA [27, 28]. Mimo obserwowanego zmniejszenia wartości FEV1 (spadek średniej wartości FEV1 z 96,7% do 84,2%) w badanej grupie pacjentów w ciągu 8 lat nie zaobserwowano wpływu kolonizacji MRSA na ten wskaźnik. Kolonizacja szczepem metycylino-opornym, nawet przy braku objawów pogarszania się stanu klinicznego, jest wskazaniem do częstszych badań kontrolnych. W przebiegu zaostrzeń oskrzelowo-płucnych częściej wskazana jest hospitalizacja i intensywna antybiotykoterapia dożylna. Leczenie jest uciążliwe dla chorego oraz obarczone ryzykiem powikłań. Podczas hospitalizacji pacjenci z kolonizacją lub zakażeniem MRSA powinni być izolowani, aby zminimalizować ryzyko transmisji tych szczepów na innych pacjentów. W zakażeniach dolnych dróg oddechowych wywołanych szczepami MRSA coraz częściej stosowany jest linezolid [2, 27]. Wszystkie badane izolaty MRSA zachowały pełną wrażliwość na linezolid oraz glikopeptydy. Do długotrwałej kolonizacji dróg oddechowych pacjentów z mukowiscydozą przyczynia się patomechanizm choroby. Gęsty, lepki śluz stwarza doskonałe warunki do zasiedlania przez drobnoustroje, które cechują się znaczną heterogennością [1, 2]. Gronkowce złociste izolowane od chorych na mukowiscydozę wykazują zdolność do wytwarzania śluzu zewnątrzkomórkowego i biofilmu oraz tzw. form małych
kolonii (small colony variants; SCV). Taka zmienność fenotypowa może być przyczyną uporczywych i nawracających zakażeń, które ulegają reaktywacji mimo stosowania celowanego leczenia [30, 31].
Wnioski Przeprowadzone badania wykazały, że szczepy Staphylococcus aureus izolowane od dzieci chorych na mukowiscydozę charakteryzują się zdolnością do długotrwałej, nawet wieloletniej kolonizacji dróg oddechowych. Długotrwała kolonizacja dotyczyła szczepów MRSA oraz MSSA. Szczepy nie ulegały eradykcji mimo zastosowania celowanej antybiotykoterapii. U chorych na mukowiscydozę istnieje możliwość jednoczesnej kolonizacji dróg oddechowych kilkoma szczepami S. aureus o odmiennym genotypie i profilu lekooporności. Nie stwierdzono istnienia klonów charakterystycznych dla badanej populacji pacjentów z CF. Potwierdzono jednak ryzyko transmisji szczepów między pacjentami. Nadmierne stosowanie antybiotyków może prowadzić do narastania oporności, dlatego decyzję o zastosowaniu leczenia oraz ocenę jego skuteczności należy podejmować, biorąc pod uwagę objawy kliniczne, wyniki badania przedmiotowego, badań pomocniczych, ze szczególnym uwzględnieniem diagnostyki mikrobiologicznej.
Wkład autorów/Authors' contributions KS – zasadniczy wkład w koncepcję i projekt pracy, zebranie danych, analiza i interpretacja danych oraz napisanie artykułu. KD-F, DD – wkład w koncepcję i projekt pracy, krytyczne zrecenzowanie pracy oraz akceptacja ostatecznej wersji do opublikowania. HD – analiza danych i krytyczne zrecenzowanie pracy oraz akceptacja ostatecznej wersji do opublikowania. BF – zebranie danych.
Konflikt interesu/Conflict of interest Nie występuje.
pi smiennictwo/references
[1] Lyczak JB, Cannon CL, Pier GB. Lung Infections Associated with Cystic Fibrosis. ClinMicrobiol Rev 2002;15(2):194–222. [2] Saiman L. Siegel J and the Cystic Fibrosis Foundation Consensus Conference on Infection Control Participants. Infection control recommendations for patients with cystic fibrosis: microbiology, important pathogens, and infection control practices to prevent patient-to-patients transmission. Infect Control Hosp Epidemiol 2005;24(5): 6–53. [3] Mazurczak T. Mukowiscydoza, dziedziczenie, etiopatogeneza, diagnostyka i leczenie. Instytut Matkii Dziecka 2006. [4] Armstrong DS, Grimwood K, Carlin JB, Carzino R, Olinsky A, Phelan PD. Bronchoalveolar lavage and oropharyngeal
pediatria polska 87 (2012) 545–551
[5] [6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12] [13]
[14]
[15]
[16] [17]
[18]
cultures to identify lower respiratory pathogens in infants with cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol 1996;21:267–275. Saiman L, Siege J. Infection Control in Cystic Fibrosis. Clin Microbiol Rev 2004;17(1):57–71. Kerem E, Conway S, Elborn S, Heijerman H. Standards of care for patients with cystic fibrosis: a European consensus For the Consensus Committee1. J Cyst Fibros 2005;4:7–26. Ratjen F. Changes in strategies for optimal antibacterial therapy in cystic fibrosis. Int J Antimicrob Agents 2001;17:93–96. Southern KW, Littlewood AE, Littlewood JM. The prevalence and significance of chronic Staphylococcus aureus infection in patients with cystic fibrosis on long-term flucloxacillin. W: Escobar H, Baquero CF, Svarez L, reds. Clinical Ecology of Cystic Fibrosis. Amsterdam: Elsevier Science Publishers; 1993. p. 129–130. Smyth A, Walters S. Prophylactic anti-staphylococcal antibiotics for cystic fibrosis (Cochrane Review). The Cochrane Library 2006;1:1465–1858. Semczuk K, Dmeńska H, Dzierżanowska D, Kołodziejczyk M, Gabińska E, Zaręba H. Analiza Drobnoustrojów izolowanych z dróg oddechowych chorych na mukowiscydozę leczonych w IP-CZD w latach 1999-2002. Pneumonol Alergolog Pol 2005;73:48–54. Consensus Conference Management of patients with cystic fibrosis 18-19 November 2002 Palais du Luxembourg – Paris. Management of patients with cystic fibrosis (pulmonary disease and infection) Société Française de Pédiatrie 2002: 2-14. Dzierżanowska D. Antybiotykoterapia praktyczna. a-medicapress 2008. Alvarez-Elcoro S, Enzler MJ. Repetytorium z leków przeciwdrobnoustrojowych cz. III: Makrolidy: erytromycyna, klarytromycyna i azytromycyna. Med Prakt Ped 2000;3. Ferrara G, Losi M, Franco F, Corbetta L, Fabbri LM, Richeldi L. Macrolides in the treatment of asthma and cystic fibrosis. Respir Med 2005;99:1–10. Mizukane R, Hirakata Y, Kaku M, Ishii Y, Furuya N, Ishida K, et al. Comparative in vitro exoenzyme-supressingactivites of azithromycin and other macrolide antibiotics against Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 1994;38:528–533. Southern KW, Barker PM. Azithromycin for cystic fibrosis. EurRespir J 2004;24:834–838. Wagner T, Soong G, Sokol S, Saiman L, Prince A. Effects of Azithromycin on Clinical Isolates of Pseudomonas aeruginosa From Cystic Fibrosis Patients. Chest 2005;128:912–919. Juda M, Grzegorczyk A, Biernasiuk A, Korona-Głowniak I, Bogut A, Malm A. Lekowrażliwość szczepów Staphylococcusaureus kolonizujących nosogardziel u zdrowych dzieci w wieku przedszkolnym. Ped Pol 2006;81 (6):413–417.
551
[19] Kosikowska U, Juda M, Malm A, Jóźwiakowska M, Tuszkiewicz-Misztal E. Lekowrażliwość szczepów Haemophilus sp. i Staphylococcus aureus kolonizujących drogi oddechowe u dzieci z mukowiscydoą. Przegl Epidemiol 2007;61:377–384. [20] Goering RV, Bauernfeind A, Lenz W, Przyklenk B. Staphylococcus aureusin patients with cystic fibrosis: an epidemiological analysis using a combination of traditional and molecular methods. Infection 1990;18:57–60. [21] Branger C, Fournier JM, Loulergue J, Bouvet A, Goullet P, Boutonnier A, et al. Epidemiology of Staphylococcus aureus in patients with cystic fibrosis. Epidemiol Infec 1994;112 (3):489–500. [22] Branger C, Gardye C, Lambert-Zechovsky N. Persistence of Staphylococcus aureus strains among cystic fibrosis patients over extended periods of time. J Med Microbiol 1996;45(4):294–301. [23] Renders N, Van Belkum A, Overbeek S, Mouton J, Verbrugh H. Molecular epidemiology of Staphylococcus aureus strains colonising the lungs of related and unrelated cystic fibrosis patients. ClinMicrobiol Infect 1997;3:216–221. [24] Kidd TJ, Appl B, Coulter C. Epidemiological Analysis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus isolates from adult Patients with cystic fibrosis. Infect Control Hosp Epidemiol 2006;27:201–203. [25] Goerke C, Kraning K, Stern M, Doring G, Botzenhart K, Wolz C. Molecular epidemiology of community-acquired Staphylococcus aureus in families with and without cystic fibrosis patients. J Infect Dis 2000;181:984–989. [26] Vergison A, Denis O, Deplano A, Casimir G, Claeys G, DeBaets F. National survey of molecular epidemiology of Staphylococcus aureus colonization in Belgian cystic fibrosis patients. J Antimicrob Chemother 2007;59(5): 893–899. [27] Miall LS, McGinley NT, Brownlee KG, Conway SP. Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infection in cystic fibrosis. Arch Dis Child 2001;84:160–162. [28] Thomas SR, Gaya H, Hodson ME. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: impact at a national cystic fibrosis centre. J Hospit Inf 1998;40:203–209. [29] Antimicrobial resistance Surveillance in Europe Annual report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network 2009. European Centre for Disease Prevention and Control, 2010. www.ecdc.europa.eu. [30] Semczuk K, Dzierżanowska-Fangrat K, Dmeńska H, Dzierżanowska D. Częstość występowania fenotypów small colony variants wśród szczepów Staphylococcus aureus izolowanych od dzieci chorych na mukowiscydozę. Med Dośw Mikrobiol 2008;60:319–328. [31] Semczuk K, Dzierżanowska-Fangrat K, Dmeńska H, Dzierżanowska D. Ocena wytwarzania biofilmu przez szczepy Staphylococcus aureus izolowanych od dzieci chorych na mukowiscydozę. Med Dośw Mikrobiol 2008;60:311–318.