- Email: [email protected]
Ekspresja cząsteczki adhezyjnej CD44 na subpopulacjach limfocytów przerosłych migdałków gardłowych dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha
Ekspresja czàsteczki adhezyjnej CD44 na subpopulacjach limfocytów przeros∏ych migda∏ków gard∏owych dzieci chorych na wysi´kowe zapalenie ucha Expression of adhesion molecule CD44 on subpopulations of lymphocytes in hypertrophied adenoids in children with otitis media with effusion Karol Ratomski1, Beata ˚elazowska-Rutkowska1, Jolanta Wysocka1, Bo˝ena Skotnicka2 1
Zak∏ad Laboratoryjnej Diagnostyki Pediatrycznej AM w Bia∏ymstoku Kierownik: prof. dr hab. J. Wysocka 2 Klinika Otolaryngologii Dzieci´cej AM w Bia∏ymstoku Kierownik: prof. dr hab. E. Hassmann-Poznaƒska
F Summary Introduction: The CD44 on lymphocytes binding to its ligand hyaluronan can mediate primary adhesion (rolling interactions) of lymphocytes on high endothelial venules (HEV). This adhesion molecule plays an important role to maturation and proliferation of lymphocytes in the secondary lymphoid organs. CD44 has a crucial role in migrate of lymphocytes to inflammatory sites. The aim of this study was evaluation of the percentage and MFI (mean fluorescence intensity) of lymphocytes CD4+, CD8+, CD19+ with expression of surface adhesive molecule CD44 in hypertrophied adenoids in children with otitis media with effusion. Material and methods: 42 children with otitis media with effusion and 30 children with hypertrophied adenoids were tested. Children were also divided into two subgroups: young (below 5 years) and older children (above 5 years old). Expression of adhesion molecule CD28 on lymphocytes of adenoids tissue was estimated by flow cytometry method. Results: This study showed significantly higher percentage of lymphocytes CD19+CD44+ in children with otitis media with effusion (OME 87,83%) than in comparative group with hypertrophied adenoids (AH 85,61%). We did not find difference between OME and AH in mean fluorescence intensity of subpopulations lymphocytes T and B with expression CD44. Conclusions: Adhesion molecule CD44 is important for developing of effectors lymphocytes in hypertrophy adenoid. Increase percentage of lymphocytes CD19 with expression CD28, especially in older children confirms their participation in developing and forming of immunological response in otitis media with effusion. H a s ∏ a i n d e k s o w e : CD44, limfocyty, przerost migda∏ka gard∏owego (PMG), wysi´kowe zapalenie ucha (WZU) K e y w o r d s : CD44, lymphocytes, adenoid hypertrophy (AH), otitis media with effusion (OME) Otolaryngol Pol 2007; LXI (1): 58–62
© 2007 by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów – Chirurgów G∏owy i Szyi
F WST¢P Funkcje immunologiczne, jakie podejmujà limfocyty zale˝à od wymiany pomi´dzy tymi komórkami „informacji biologicznych” poprzez ich czàsteczki adhezyjne. Interakcje pomi´dzy receptorami powierzchniowymi limfocytów decydujà o ich dojrzewaniu, przekazywaniu pobudzenia, migracji do narzàdów
immunologicznych lub narzàdów obj´tych procesem zapalnym, a nawet o ich apoptozie [3, 9, 19]. Czàsteczka adhezyjna CD44 powszechnie wyst´puje na powierzchni limfocytów T i B niemal na wszystkich stadiach ich rozwoju [13]. Jest transb∏onowà glikoproteinà, tworzy wiele izoform powierzchniowych, przez co bierze udzia∏ w wielu procesach komórkowych [3, 11]. Ligandem CD44 sà
Autorzy nie zg∏aszajà konfliktu interesów.
58
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1
Ekspresja czàsteczki adhezyjnej CD44
czàsteczki kwasu hialuronowego obecne w macierzy pozakomórkowej [11, 15], jak równie˝ na komórkach Êródb∏onka [16, 21]. ObecnoÊç kwasu hialuronowego wykazano równie˝ na komórkach naczyƒ pozaw∏osowatych z wysokim Êródb∏onkiem (HEV) w drugorz´dowych narzàdach limfatycznych [6]. Migracja obwodowych limfocytów poza naczynia krwionoÊne zapoczàtkowana jest w procesie toczenia limfocytów po Êródb∏onku naczyƒ z udzia∏em CD44 i czàsteczek kwasu hialuronowego [2, 21]. Przechodzenie krà˝àcych limfocytów do tkanek, w których trwa proces zapalny z udzia∏em CD44, umo˝liwia rozwini´cie i utrzymanie w tym miejscu odpowiedzi zapalnej [11]. Czàsteczka CD44 bierze udzia∏ w T-komórkowo zale˝nym dojrzewaniu i ró˝nicowaniu naiwnych limfocytów B w tkance migda∏ka gard∏owego [14]. Przekazanie pobudzenia limfocytom B z udzia∏em innych czàsteczek kostymulujàcych CD40-CD40L, CD80-CD28 przyczynia si´ do funkcjonalnego formowania komórkowych oÊrodków rozmna˝ania i powstawania komórek B pami´ci zdolnych do rozwini´cia odpowiedzi immunologicznej [14]. Wi´kszoÊç limfocytów B migda∏ków z ekspresjà CD44 wytwarza immunoglobulin´ G, którà mo˝e dostarczaç nast´pnie do krà˝enia [4]. Celem badaƒ by∏a ocena odsetka limfocytów T i B z ekspresjà czàsteczki adhezyjnej CD44 w tkance przeros∏ych migda∏ków gard∏owych dzieci z wysi´kowym zapaleniem ucha Êrodkowego trwajàcym powy˝ej trzech miesi´cy.
MATERIA¸ I METODY Grupa badana z przerostem migda∏ka gard∏owego i wysi´kowym zapaleniem ucha Êrodkowego trwajàcym powy˝ej 3 miesi´cy (WZU) liczy∏a 42 pacjentów w wieku od 2 do 17 roku ˝ycia. Grupa porównawcza jedynie z przerostem migda∏ków gard∏owych (PMG), którà stanowili rówieÊnicy, liczy∏a 30 dzieci. Ze wzgl´du na stopieƒ dojrza∏oÊci uk∏adu immunologicznego obydwie grupy WZU i PMU podzielono na podgrupy wiekowe dzieci m∏odszych (m∏) od 2 do 5 roku ˝ycia i dzieci starszych (st) od 6 do 17 roku ˝ycia. W grupie badanej wÊród dzieci m∏odszych WZUm∏ znalaz∏o si´ 19 osób, a w podgrupie dzieci starszych WZUst 23 badanych. Grupa dzieci m∏odszych z przerostem migda∏ka gard∏owego PMUm∏ liczy∏a 14 osób, a grupa starsza PMUst 16 dzieci.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1
Materia∏em badanym by∏y migda∏ki gard∏owe uzyskane od dzieci w czasie zabiegu adenoidektomii przeprowadzonego w Klinice Otolaryngologii Dzieci´cej Akademii Medycznej w Bia∏ymstoku. Na wykonanie badaƒ uzyskano zgod´ Komisji Bioetycznej Akademii Medycznej w Bia∏ymstoku. Badania zosta∏y wykonane metodà trójkolorowej cytometrii przep∏ywowej na cytometrze firmy EPICS XL, Coulter. Procedur´ przygotowania tkanki przeros∏ych migda∏ków gard∏owych do badaƒ opisano we wczeÊniejszej publikacji [23]. Do badaƒ zastosowano przeciwcia∏a monoklonalne skierowane przeciw nast´pujàcym antygenom powierzchniowym limfocytów: CD4, CD8, CD19, CD44 (DakoCytomation). Analiz´ statystycznà uzyskanych wyników przeprowadzono testem nieparametrycznym U Manna-Whitney’a z u˝yciem programu STATISTICA 5.0. Wyniki podawano w wartoÊciach odsetkowych i MFI (Êrednia intensywnoÊç fluorescencji). Za istotnà statystycznie przyj´to wartoÊç przy p<0,05.
WYNIKI W badaniach wykazano znamienny statystycznie wzrost Êredniego odsetka limfocytów CD19+ CD44+ w migda∏kach gard∏owych dzieci z wysi´kowym zapaleniem ucha i przerostem migda∏ków gard∏owych (WZU 87,83%) w odniesieniu do grupy dzieci z samym przerostem migda∏ków gard∏owych (PMG 85,61%). Nie wykazano ró˝nic znamiennych statystycznie pomi´dzy odsetkiem subpopulacji limfocytów T (CD4 i CD8) z ekspresjà CD44 pomi´dzy grupà badanà i porównawczà (tabela I). Po podziale na podgrupy wiekowe statystycznie wy˝szy odsetek limfocytów CD4+ CD44+ wykazano w migda∏kach gard∏owych u dzieci starszych chorujàcych na wysi´kowe zapalenie ucha (99,47%) ni˝ w grupie bez stanu zapalnego ucha (99,05%). Podobnie wykazano wy˝szy odsetek limfocytów CD19+ CD44+ w przeros∏ych migda∏kach gard∏owych dzieci ze stanem zapalnym ucha Êrodkowego (88,68%) ni˝ w samym przeroÊcie (84,63%) (tabela II). Natomiast nie wykazano ró˝nicy statystycznej w podgrupach wiekowych dla limfocytów CD8+ z ekspresjà czàsteczki adhezyjnej CD44. Ârednia intensywnoÊç fluorescencji (MFI) czàsteczki adhezyjnej CD44 na limfocytach T i B migda∏ka gard∏owego nie wykaza∏a ró˝nicy znamiennej
59
K. Ratomski i inni
Tabela I. Odsetek i MFI limfocytów T i B z ekspresjà CD44+ w tkance migda∏ka gard∏owego u dzieci chorych na wysi´kowe zapalenie ucha z przerostem migda∏ka gard∏owego (WZU) i w grupie porównawczej z przerostem migda∏ka gard∏owego (PMG) Limfocyty (± SD)
Wysi´kowe zapalenie ucha (WZU) N = 42
Przerost migda∏ków gard∏owych (PMG) N = 30
CD4+CD44+ (%) CD8+CD44+ (%) CD19+CD44+ (%) CD4+CD44+ (MIF) CD8+CD44+ (MIF) CD19+CD44+ (MIF)
99,36 ± 0,52 97,73 ± 1,80 87,83 ± 3,15A 9,09 ± 1,63 10,59 ± 1,70 10,79 ± 1,62 p < 0,04A
99,44 ± 0,41 98,13 ± 1,70 85,61 ± 3,72A 9,55 ± 1,95 11,48 ± 2,05 10,61 ± 1,46
Tabela II. Odsetek i MIF limfocytów T i B z ekspresjà CD44+ w tkance migda∏ka gard∏owego u dzieci chorych na wysi´kowe zapalenie ucha z przerostem migda∏ka gard∏owego (WZU) i w grupie porównawczej z przerostem migda∏ka gard∏owego (PMG) po podziale na podgrupy wiekowe Limfocyty (± SD)
CD4+CD44+ (%) CD8+CD44+ (%) CD19+CD44+ (%) CD4+CD44+ (MIF) CD8+CD44+ (MIF) CD19+CD44+ (MIF)
Wysi´kowe zapalenie ucha (WZU) WZUm∏ N = 19 WZUst N = 23 99,07 ± 0,44 97,36 ± 1,81 86,78 ± 3,86 9,27 ± 1,32 10,58 ± 1,62 10,27 ± 1,74
99,47 ± 0,39B 99,25 ± 0,39 98,07 ± 1,79 98,28 ± 1,77 88,68 ± 2,28C 86,07 ± 4,10 8,65 ± 1,94 9,44 ± 2,01 10,60 ± 1,83 11,52 ± 2,23 11,26 ± 1,43 10,59 ± 1,41 p < 0,01B, p < 0,004C
statystycznie w ocenianych grupach, ró˝nicy takiej nie wykazano równie˝ po podziale na podgrupy wiekowe. Dok∏adne wartoÊci MFI pokazano w tabelach I i II.
DYSKUSJA CD44 jest szeroko rozpowszechnionà glikoproteinà b∏onowà obecnà na komórkach limfatycznych w postaci ró˝nych izoform powierzchniowych [3]. Pe∏ni ona wiele funkcji biologicznych, w∏àczajàc w to zasiedlanie drugorz´dowych narzàdów limfatycznych przez limfocyty pochodzàce z krwi obwodowej [11, 25], a tak˝e migracj´ komórek do tkanek obj´tych procesem zapalnym [10, 22], przenoszenie sygna∏u pobudzenia, adhezj´ mi´dzykomórkowà [13], regulacj´ odpowiedzi immunologicznej limfocytów T poprzez udzia∏ w interakcji z komórkami dendrytycznymi [7], a tak˝e dojrza∏ych limfocytów B [4] poprzez wp∏yw na ich poliklonalnà aktywacj´ [26]. Badania wykaza∏y statystycznie wy˝szy odsetek limfocytów B z ekspresjà CD44 u dzieci z przeros∏ym migda∏kiem gard∏owym i wysi´kowym za-
60
Przerost migda∏ków gard∏owych (PMG) PMGm∏ N = 14 PMGst N = 16 99,05 ± 1,18B 97,79 ± 1,61 84,63 ± 2,74C 10,28 ± 1,54 11,40 ± 1,72 10,67 ± 1,67
paleniem ucha Êrodkowego ni˝ w grupie porównawczej z samym przerostem migda∏ka. Wykazano równie˝ wy˝szy odsetek tej subpopulacji limfocytów w podgrupie dzieci badanych powy˝ej 6 roku ˝ycia. W badaniach wykazano wy˝szy odsetek limfocytów CD4+ CD44+ w przeros∏ych migda∏kach gard∏owych podgrupy dzieci starszych ze stanem zapalnym ucha Êrodkowego w porównaniu z grupà porównawczà. Najwa˝niejszym ligandem CD44 jest kwas hialuronowy [11], który jest rozpoznawany na komórkach wysokiego nab∏onka HEV w drugorz´dowych narzàdach limfatycznych [24]. Interakcja CD44 z kwasem hialuronowym jest poczàtkowym krokiem prowadzàcym do ekstrawazacji limfocytów T i B [2, 15, 21, 24]. Interakcja ta ma zasadnicze znaczenie w toczeniu i przyleganiu limfocytów wykazujàcych ekspresj´ CD44 w ˝y∏kach postkapilarnych [9]. Po wejÊciu do migda∏ków limfocyty T i B migrujà do specyficznych dla nich przestrzeni, gdzie dochodzi do kontaktu z APC. Clarck i wsp. [6] uwa˝ajà, ˝e migracja limfocytów w migda∏kach jest równie˝ zale˝na od interakcji CD44
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1
Ekspresja czàsteczki adhezyjnej CD44
i kwasu hialuronowego na komórkach zr´bu. Milicevic i wsp. [20] uwa˝ajà, ˝e limfocyty Th i Tc oraz B obecne w drugorz´dowych narzàdach limfatycznych wykazujà wy˝szà ekspresj´ CD44 w porównaniu z limfocytami krwi obwodowej. Aktywacja limfocytów T wymaga dwóch sygna∏ów, pierwszy pochodzi z TCR, a drugi z moleku∏ adhezyjnych. Föger i wsp. [8] wykazali, ˝e CD44 podobnie jak CD28 bierze udzia∏ w stymulacji limfocytów T zale˝nej od antygenu. Z badaƒ tych autorów [8] wynika, ˝e proliferacji limfocytów T indukowanej przez CD44 towarzyszy wzrost ekspresji antygenu CD69, b´dàcego wczesnym markerem aktywacji limfocytów T, wzrost ekspresji CD25, który jest receptorem IL-2, a tak˝e wzrost wytwarzania IL-2. JednoczeÊnie sygna∏ kostymulujàcy pochodzàcy od CD44 pe∏ni wa˝nà rol´ jako regulator AICD (activation induced cell death) aktywowanych limfocytów T, indukujàc proces apoptozy [8, 19]. Rozpuszczalna postaç CD44 wyst´puje w ch∏once i osoczu krwi obwodowej. Powstaje ona w wyniku proteolizy domeny zewnàtrzkomórkowej i jej poziom wydaje si´ korelowaç z aktywacjà uk∏adu immunologicznego [5, 12]. Podczas aktywacji i ró˝nicowania limfocytów B w drugorz´dowych narzàdach limfatycznych ekspresja czàsteczki adhezyjnej CD44 jest zmienna [14, 18]. Kostymulacja naiwnych limfocytów B przez CD44 w migda∏kach powoduje ich aktywacj´ i powstawanie oÊrodków rozmna˝ania, a z drugiej strony indukuje apoptoz´ oÊrodkowych limfocytów B [14]. Na powstajàcych w oÊrodkach rozmna˝ania centoblastach gwa∏townie obni˝a si´ ekspresja CD44, dopiero w nast´pnym stadium centrocyta ekspresja tego receptora zaczyna wzrastaç. W migda∏kach najwy˝szy poziom ekspresji CD44 obserwowano na dojrza∏ych limfocytach B wytwarzajàcych immunoglobuliny A i G [4, 18]. Wysoki poziom ekspresji czàsteczki CD44 na dojrza∏ych limfocytach obwodowych narzàdów limfatycznych jest istotny z punktu widzenia ich udzia∏u w procesach zapalnych. Cytokiny i chemokiny obecne w ognisku zapalnym powodujà szybkà aktywacj´ czàsteczki CD44 obecnej na limfocytach T [1]. CD44 uczestniczy w absorpcji i usuwaniu kwasu hialuronowego, co ma znaczenie w progresji i ograniczaniu procesu zapalnego [22]. Czàsteczka adhezyjna CD44 bierze udzia∏ w powstawaniu limfocytów efektorowych w tkance przeros∏ych migda∏ków gard∏owych. Wzrost odsetka limfocytów B z ekspresjà CD44 wskazuje na mo˝liwoÊç udzia∏u komórek migda∏ka w powsta-
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1
waniu i utrzymywaniu miejscowej odpowiedzi immunologicznej w wysi´kowym zapaleniu ucha Êrodkowego.
PIÂMIENNICTWO 01. Ariel A, Lider O, Brill A, Cahalon L, Savion N, Varon D, i wsp. Induction of interactions between CD44 and hyaluronic acid by short exposure of human T cells to diverse proinflammatory mediators. Immunology 2000; 100: 345. 02. Bonder CS, Clark SR, Norman MU, Johnson P, Kubes P. Use of CD44 by CD4+ Th1 and Th2 lymphocytes to roll and adhere. Blood 2006. W druku. 03. Borland G, Ross JA, Guy K. Forms and functions of CD44. Immunology 1998; 93: 139. 04. Brieva JA, Roldan E, Rodriguez C, Navas G. Human tonsil, blood and bone marrow in vivo-induced B cells capable of spontaneous and high-rate immunoglobulin secretion in vitro: differences in the requirements for factors and for adherent and bone marrow stromal cells, as well as distinctive adhesion molecule expression. Eur J Immunol 1994; 24: 362. 05. Cichy J, Pure E. The liberation of CD44. J Cell Biol 2003; 161: 839. 06. Clark RA, Alon R, Springer TA. CD44 and hyaluronian-dependent rolling interactions of lymphocytes on tonsillar stroma. J Cell Biol 1996; 134: 1075. 07. Do Y, Nagarkatti PS, Nagarkatti M. Role of CD44 and hyaluronic acid (HA) in activation of alloreactive and antigen-specific T cells by bone marrow-derived dendritic cells. J Immunol 2004; 27: 1. 08. Föger N, Marhaba R, Zöller M. CD44 supports T cell proliferation and apoptosis by apposition of protein kinases. Eur J Immunol 2000; 30: 2888. 09. Gal I, Lesley J, Ko W, Gonda A, Stoop R, Hyman R, i wsp. Role of the extracellular and cytoplasmic domains of CD44 in the rolling interaction of lymphoid cells with hyaluronian under physiologic flow. J Biol Chem 2003; 278: 11150. 10. Gee K, Kryworuchko M, Kumar A. Recent advances in the regulation of CD44 expression and its role in inflammation and autoimmune diseases. Arch Immunol Ther Exp 2004; 52: 13. 11. Goodison S, Urquidi V, Tarin D. CD44 cell adhesion molecules. J Clin Pathol Mol Pathol 1999; 52: 189. 12. Herrlich P, Zoller M, Pals ST, Ponta H. CD44 splice variants: metastases meet lymphocytes. Immunol Today 1993; 14: 395. 13. Högerkorp CM, Bilke S, Breslin T, Ingvarsson S, Borrebaeck CAK. CD44-stimulated human B cells express transcripts specifically involved in immunomodulation and inflammation as analyzed by DNA microarrays. Blood 2003; 101: 2307. 14. Ingvarsson S, Dahlenborg K, Carlsson R, Borreabeck CAK. Co-ligation of CD44 on naive human tonsillar B cells induces progression towards a germinal center phenotype. Int Immunol 1999; 11: 739.
61
K. Ratomski i inni
15. Isacke CM, Yarwood H. The hyaluronan receptor, CD44. Int J Biochem Cell Biol 2002; 34: 718. 16. Johnson P, Maiti A, Brown KL, Li R. A role for the cell adhesion molecule CD44 and sulfation in leukocyte-endothelial cell adhesion during an inflammatory response? Biochem Pharmacol 2000; 59: 455. 17. Kim JH, Glant TT, Lesley J, Hyman R, Mikecz K. Adhesion of lymphoid cells to CD44-specific substrata: the consequences of attachment depend on the ligand. Exp Cell Res 2000; 256; 445. 18. Kremmidiotis G, Zola H. Changes in CD44 expression during B cell differentiation in human tonsils. Cell Immunol 1995; 161: 147. 19. McKallip RJ, Do Y, Fisher MT, Robertson JL, Nagarkatti PS, Nagarkatti M. Role of CD44 in activation-induced cell death: CD44 – deficient mice exhibit enhanced T cell response to conventional and superantigens. Int Immunol 2002; 14: 1015. 20. Miliçeviç NM, Nohroudi K, Miliçeviç Z, Westermann J. Blood lymphocytes, monocytes and NK cells modulate their expression of CD44, ICAM-1, LFA-1 and MHC class II after arrival into lymphoid organs. Immunol Invest 2004; 33: 439. 21. Nandi A, Estess P, Siegelman MH. Hyaluronian anchoring and regulation on the surface of vascular endothelial cells is mediated through the functionally active form of CD44. J Biol Chem 2000; 275: 14939. 22. Pure E, Cuff CA. A crucial role for CD44 in inflammation Trends Mol Med 2001; 7: 213.
62
23. Ratomski K, Wysocka J, Hassmann-Poznaƒska E, Kasprzycka E. Ekspresja receptora CD23 na limfocytach przeros∏ych migda∏ków gard∏owych u dzieci chorych na wysi´kowe zapalenie ucha. Otolaryngol Pol 2005; 59: 219. 24. Siegelman MH, DeGrendele HC, Estess P. Activation and interaction of CD44 and hyaluronan in immunological systems. J Leukocyt Biol 1999; 66: 315. 25. Sumoza-Toledo A, Santos-Argumedo L. The spreading of B lymphocytes induced by CD44 cross-linking requires actin, tubulin, and vimentin rearrangements. J Leukoc Biol 2004; 75: 233. 26. Wyant TL, Fisher MT, McKallip RJ, Nagarkatti PS, Nagarkatti M, Conrad DH. Mouse B cell activation is inhibited by CD44 cross-linking. Immunol Invest 2005; 34: 399.
Adres autora: Karol Ratomski Zak∏ad Laboratoryjnej Diagnostyki Pediatrycznej AM w Bia∏ymstoku ul. Waszyngtona 17 15-269 Bia∏ystok e-mail: [email protected] Prac´ nades∏ano: 3.07.2006 r.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1
Zak∏ad Laboratoryjnej Diagnostyki Pediatrycznej AM w Bia∏ymstoku Kierownik: prof. dr hab. J. Wysocka 2 Klinika Otolaryngologii Dzieci´cej AM w Bia∏ymstoku Kierownik: prof. dr hab. E. Hassmann-Poznaƒska
F Summary Introduction: The CD44 on lymphocytes binding to its ligand hyaluronan can mediate primary adhesion (rolling interactions) of lymphocytes on high endothelial venules (HEV). This adhesion molecule plays an important role to maturation and proliferation of lymphocytes in the secondary lymphoid organs. CD44 has a crucial role in migrate of lymphocytes to inflammatory sites. The aim of this study was evaluation of the percentage and MFI (mean fluorescence intensity) of lymphocytes CD4+, CD8+, CD19+ with expression of surface adhesive molecule CD44 in hypertrophied adenoids in children with otitis media with effusion. Material and methods: 42 children with otitis media with effusion and 30 children with hypertrophied adenoids were tested. Children were also divided into two subgroups: young (below 5 years) and older children (above 5 years old). Expression of adhesion molecule CD28 on lymphocytes of adenoids tissue was estimated by flow cytometry method. Results: This study showed significantly higher percentage of lymphocytes CD19+CD44+ in children with otitis media with effusion (OME 87,83%) than in comparative group with hypertrophied adenoids (AH 85,61%). We did not find difference between OME and AH in mean fluorescence intensity of subpopulations lymphocytes T and B with expression CD44. Conclusions: Adhesion molecule CD44 is important for developing of effectors lymphocytes in hypertrophy adenoid. Increase percentage of lymphocytes CD19 with expression CD28, especially in older children confirms their participation in developing and forming of immunological response in otitis media with effusion. H a s ∏ a i n d e k s o w e : CD44, limfocyty, przerost migda∏ka gard∏owego (PMG), wysi´kowe zapalenie ucha (WZU) K e y w o r d s : CD44, lymphocytes, adenoid hypertrophy (AH), otitis media with effusion (OME) Otolaryngol Pol 2007; LXI (1): 58–62
© 2007 by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów – Chirurgów G∏owy i Szyi
F WST¢P Funkcje immunologiczne, jakie podejmujà limfocyty zale˝à od wymiany pomi´dzy tymi komórkami „informacji biologicznych” poprzez ich czàsteczki adhezyjne. Interakcje pomi´dzy receptorami powierzchniowymi limfocytów decydujà o ich dojrzewaniu, przekazywaniu pobudzenia, migracji do narzàdów
immunologicznych lub narzàdów obj´tych procesem zapalnym, a nawet o ich apoptozie [3, 9, 19]. Czàsteczka adhezyjna CD44 powszechnie wyst´puje na powierzchni limfocytów T i B niemal na wszystkich stadiach ich rozwoju [13]. Jest transb∏onowà glikoproteinà, tworzy wiele izoform powierzchniowych, przez co bierze udzia∏ w wielu procesach komórkowych [3, 11]. Ligandem CD44 sà
Autorzy nie zg∏aszajà konfliktu interesów.
58
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1
Ekspresja czàsteczki adhezyjnej CD44
czàsteczki kwasu hialuronowego obecne w macierzy pozakomórkowej [11, 15], jak równie˝ na komórkach Êródb∏onka [16, 21]. ObecnoÊç kwasu hialuronowego wykazano równie˝ na komórkach naczyƒ pozaw∏osowatych z wysokim Êródb∏onkiem (HEV) w drugorz´dowych narzàdach limfatycznych [6]. Migracja obwodowych limfocytów poza naczynia krwionoÊne zapoczàtkowana jest w procesie toczenia limfocytów po Êródb∏onku naczyƒ z udzia∏em CD44 i czàsteczek kwasu hialuronowego [2, 21]. Przechodzenie krà˝àcych limfocytów do tkanek, w których trwa proces zapalny z udzia∏em CD44, umo˝liwia rozwini´cie i utrzymanie w tym miejscu odpowiedzi zapalnej [11]. Czàsteczka CD44 bierze udzia∏ w T-komórkowo zale˝nym dojrzewaniu i ró˝nicowaniu naiwnych limfocytów B w tkance migda∏ka gard∏owego [14]. Przekazanie pobudzenia limfocytom B z udzia∏em innych czàsteczek kostymulujàcych CD40-CD40L, CD80-CD28 przyczynia si´ do funkcjonalnego formowania komórkowych oÊrodków rozmna˝ania i powstawania komórek B pami´ci zdolnych do rozwini´cia odpowiedzi immunologicznej [14]. Wi´kszoÊç limfocytów B migda∏ków z ekspresjà CD44 wytwarza immunoglobulin´ G, którà mo˝e dostarczaç nast´pnie do krà˝enia [4]. Celem badaƒ by∏a ocena odsetka limfocytów T i B z ekspresjà czàsteczki adhezyjnej CD44 w tkance przeros∏ych migda∏ków gard∏owych dzieci z wysi´kowym zapaleniem ucha Êrodkowego trwajàcym powy˝ej trzech miesi´cy.
MATERIA¸ I METODY Grupa badana z przerostem migda∏ka gard∏owego i wysi´kowym zapaleniem ucha Êrodkowego trwajàcym powy˝ej 3 miesi´cy (WZU) liczy∏a 42 pacjentów w wieku od 2 do 17 roku ˝ycia. Grupa porównawcza jedynie z przerostem migda∏ków gard∏owych (PMG), którà stanowili rówieÊnicy, liczy∏a 30 dzieci. Ze wzgl´du na stopieƒ dojrza∏oÊci uk∏adu immunologicznego obydwie grupy WZU i PMU podzielono na podgrupy wiekowe dzieci m∏odszych (m∏) od 2 do 5 roku ˝ycia i dzieci starszych (st) od 6 do 17 roku ˝ycia. W grupie badanej wÊród dzieci m∏odszych WZUm∏ znalaz∏o si´ 19 osób, a w podgrupie dzieci starszych WZUst 23 badanych. Grupa dzieci m∏odszych z przerostem migda∏ka gard∏owego PMUm∏ liczy∏a 14 osób, a grupa starsza PMUst 16 dzieci.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1
Materia∏em badanym by∏y migda∏ki gard∏owe uzyskane od dzieci w czasie zabiegu adenoidektomii przeprowadzonego w Klinice Otolaryngologii Dzieci´cej Akademii Medycznej w Bia∏ymstoku. Na wykonanie badaƒ uzyskano zgod´ Komisji Bioetycznej Akademii Medycznej w Bia∏ymstoku. Badania zosta∏y wykonane metodà trójkolorowej cytometrii przep∏ywowej na cytometrze firmy EPICS XL, Coulter. Procedur´ przygotowania tkanki przeros∏ych migda∏ków gard∏owych do badaƒ opisano we wczeÊniejszej publikacji [23]. Do badaƒ zastosowano przeciwcia∏a monoklonalne skierowane przeciw nast´pujàcym antygenom powierzchniowym limfocytów: CD4, CD8, CD19, CD44 (DakoCytomation). Analiz´ statystycznà uzyskanych wyników przeprowadzono testem nieparametrycznym U Manna-Whitney’a z u˝yciem programu STATISTICA 5.0. Wyniki podawano w wartoÊciach odsetkowych i MFI (Êrednia intensywnoÊç fluorescencji). Za istotnà statystycznie przyj´to wartoÊç przy p<0,05.
WYNIKI W badaniach wykazano znamienny statystycznie wzrost Êredniego odsetka limfocytów CD19+ CD44+ w migda∏kach gard∏owych dzieci z wysi´kowym zapaleniem ucha i przerostem migda∏ków gard∏owych (WZU 87,83%) w odniesieniu do grupy dzieci z samym przerostem migda∏ków gard∏owych (PMG 85,61%). Nie wykazano ró˝nic znamiennych statystycznie pomi´dzy odsetkiem subpopulacji limfocytów T (CD4 i CD8) z ekspresjà CD44 pomi´dzy grupà badanà i porównawczà (tabela I). Po podziale na podgrupy wiekowe statystycznie wy˝szy odsetek limfocytów CD4+ CD44+ wykazano w migda∏kach gard∏owych u dzieci starszych chorujàcych na wysi´kowe zapalenie ucha (99,47%) ni˝ w grupie bez stanu zapalnego ucha (99,05%). Podobnie wykazano wy˝szy odsetek limfocytów CD19+ CD44+ w przeros∏ych migda∏kach gard∏owych dzieci ze stanem zapalnym ucha Êrodkowego (88,68%) ni˝ w samym przeroÊcie (84,63%) (tabela II). Natomiast nie wykazano ró˝nicy statystycznej w podgrupach wiekowych dla limfocytów CD8+ z ekspresjà czàsteczki adhezyjnej CD44. Ârednia intensywnoÊç fluorescencji (MFI) czàsteczki adhezyjnej CD44 na limfocytach T i B migda∏ka gard∏owego nie wykaza∏a ró˝nicy znamiennej
59
K. Ratomski i inni
Tabela I. Odsetek i MFI limfocytów T i B z ekspresjà CD44+ w tkance migda∏ka gard∏owego u dzieci chorych na wysi´kowe zapalenie ucha z przerostem migda∏ka gard∏owego (WZU) i w grupie porównawczej z przerostem migda∏ka gard∏owego (PMG) Limfocyty (± SD)
Wysi´kowe zapalenie ucha (WZU) N = 42
Przerost migda∏ków gard∏owych (PMG) N = 30
CD4+CD44+ (%) CD8+CD44+ (%) CD19+CD44+ (%) CD4+CD44+ (MIF) CD8+CD44+ (MIF) CD19+CD44+ (MIF)
99,36 ± 0,52 97,73 ± 1,80 87,83 ± 3,15A 9,09 ± 1,63 10,59 ± 1,70 10,79 ± 1,62 p < 0,04A
99,44 ± 0,41 98,13 ± 1,70 85,61 ± 3,72A 9,55 ± 1,95 11,48 ± 2,05 10,61 ± 1,46
Tabela II. Odsetek i MIF limfocytów T i B z ekspresjà CD44+ w tkance migda∏ka gard∏owego u dzieci chorych na wysi´kowe zapalenie ucha z przerostem migda∏ka gard∏owego (WZU) i w grupie porównawczej z przerostem migda∏ka gard∏owego (PMG) po podziale na podgrupy wiekowe Limfocyty (± SD)
CD4+CD44+ (%) CD8+CD44+ (%) CD19+CD44+ (%) CD4+CD44+ (MIF) CD8+CD44+ (MIF) CD19+CD44+ (MIF)
Wysi´kowe zapalenie ucha (WZU) WZUm∏ N = 19 WZUst N = 23 99,07 ± 0,44 97,36 ± 1,81 86,78 ± 3,86 9,27 ± 1,32 10,58 ± 1,62 10,27 ± 1,74
99,47 ± 0,39B 99,25 ± 0,39 98,07 ± 1,79 98,28 ± 1,77 88,68 ± 2,28C 86,07 ± 4,10 8,65 ± 1,94 9,44 ± 2,01 10,60 ± 1,83 11,52 ± 2,23 11,26 ± 1,43 10,59 ± 1,41 p < 0,01B, p < 0,004C
statystycznie w ocenianych grupach, ró˝nicy takiej nie wykazano równie˝ po podziale na podgrupy wiekowe. Dok∏adne wartoÊci MFI pokazano w tabelach I i II.
DYSKUSJA CD44 jest szeroko rozpowszechnionà glikoproteinà b∏onowà obecnà na komórkach limfatycznych w postaci ró˝nych izoform powierzchniowych [3]. Pe∏ni ona wiele funkcji biologicznych, w∏àczajàc w to zasiedlanie drugorz´dowych narzàdów limfatycznych przez limfocyty pochodzàce z krwi obwodowej [11, 25], a tak˝e migracj´ komórek do tkanek obj´tych procesem zapalnym [10, 22], przenoszenie sygna∏u pobudzenia, adhezj´ mi´dzykomórkowà [13], regulacj´ odpowiedzi immunologicznej limfocytów T poprzez udzia∏ w interakcji z komórkami dendrytycznymi [7], a tak˝e dojrza∏ych limfocytów B [4] poprzez wp∏yw na ich poliklonalnà aktywacj´ [26]. Badania wykaza∏y statystycznie wy˝szy odsetek limfocytów B z ekspresjà CD44 u dzieci z przeros∏ym migda∏kiem gard∏owym i wysi´kowym za-
60
Przerost migda∏ków gard∏owych (PMG) PMGm∏ N = 14 PMGst N = 16 99,05 ± 1,18B 97,79 ± 1,61 84,63 ± 2,74C 10,28 ± 1,54 11,40 ± 1,72 10,67 ± 1,67
paleniem ucha Êrodkowego ni˝ w grupie porównawczej z samym przerostem migda∏ka. Wykazano równie˝ wy˝szy odsetek tej subpopulacji limfocytów w podgrupie dzieci badanych powy˝ej 6 roku ˝ycia. W badaniach wykazano wy˝szy odsetek limfocytów CD4+ CD44+ w przeros∏ych migda∏kach gard∏owych podgrupy dzieci starszych ze stanem zapalnym ucha Êrodkowego w porównaniu z grupà porównawczà. Najwa˝niejszym ligandem CD44 jest kwas hialuronowy [11], który jest rozpoznawany na komórkach wysokiego nab∏onka HEV w drugorz´dowych narzàdach limfatycznych [24]. Interakcja CD44 z kwasem hialuronowym jest poczàtkowym krokiem prowadzàcym do ekstrawazacji limfocytów T i B [2, 15, 21, 24]. Interakcja ta ma zasadnicze znaczenie w toczeniu i przyleganiu limfocytów wykazujàcych ekspresj´ CD44 w ˝y∏kach postkapilarnych [9]. Po wejÊciu do migda∏ków limfocyty T i B migrujà do specyficznych dla nich przestrzeni, gdzie dochodzi do kontaktu z APC. Clarck i wsp. [6] uwa˝ajà, ˝e migracja limfocytów w migda∏kach jest równie˝ zale˝na od interakcji CD44
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1
Ekspresja czàsteczki adhezyjnej CD44
i kwasu hialuronowego na komórkach zr´bu. Milicevic i wsp. [20] uwa˝ajà, ˝e limfocyty Th i Tc oraz B obecne w drugorz´dowych narzàdach limfatycznych wykazujà wy˝szà ekspresj´ CD44 w porównaniu z limfocytami krwi obwodowej. Aktywacja limfocytów T wymaga dwóch sygna∏ów, pierwszy pochodzi z TCR, a drugi z moleku∏ adhezyjnych. Föger i wsp. [8] wykazali, ˝e CD44 podobnie jak CD28 bierze udzia∏ w stymulacji limfocytów T zale˝nej od antygenu. Z badaƒ tych autorów [8] wynika, ˝e proliferacji limfocytów T indukowanej przez CD44 towarzyszy wzrost ekspresji antygenu CD69, b´dàcego wczesnym markerem aktywacji limfocytów T, wzrost ekspresji CD25, który jest receptorem IL-2, a tak˝e wzrost wytwarzania IL-2. JednoczeÊnie sygna∏ kostymulujàcy pochodzàcy od CD44 pe∏ni wa˝nà rol´ jako regulator AICD (activation induced cell death) aktywowanych limfocytów T, indukujàc proces apoptozy [8, 19]. Rozpuszczalna postaç CD44 wyst´puje w ch∏once i osoczu krwi obwodowej. Powstaje ona w wyniku proteolizy domeny zewnàtrzkomórkowej i jej poziom wydaje si´ korelowaç z aktywacjà uk∏adu immunologicznego [5, 12]. Podczas aktywacji i ró˝nicowania limfocytów B w drugorz´dowych narzàdach limfatycznych ekspresja czàsteczki adhezyjnej CD44 jest zmienna [14, 18]. Kostymulacja naiwnych limfocytów B przez CD44 w migda∏kach powoduje ich aktywacj´ i powstawanie oÊrodków rozmna˝ania, a z drugiej strony indukuje apoptoz´ oÊrodkowych limfocytów B [14]. Na powstajàcych w oÊrodkach rozmna˝ania centoblastach gwa∏townie obni˝a si´ ekspresja CD44, dopiero w nast´pnym stadium centrocyta ekspresja tego receptora zaczyna wzrastaç. W migda∏kach najwy˝szy poziom ekspresji CD44 obserwowano na dojrza∏ych limfocytach B wytwarzajàcych immunoglobuliny A i G [4, 18]. Wysoki poziom ekspresji czàsteczki CD44 na dojrza∏ych limfocytach obwodowych narzàdów limfatycznych jest istotny z punktu widzenia ich udzia∏u w procesach zapalnych. Cytokiny i chemokiny obecne w ognisku zapalnym powodujà szybkà aktywacj´ czàsteczki CD44 obecnej na limfocytach T [1]. CD44 uczestniczy w absorpcji i usuwaniu kwasu hialuronowego, co ma znaczenie w progresji i ograniczaniu procesu zapalnego [22]. Czàsteczka adhezyjna CD44 bierze udzia∏ w powstawaniu limfocytów efektorowych w tkance przeros∏ych migda∏ków gard∏owych. Wzrost odsetka limfocytów B z ekspresjà CD44 wskazuje na mo˝liwoÊç udzia∏u komórek migda∏ka w powsta-
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1
waniu i utrzymywaniu miejscowej odpowiedzi immunologicznej w wysi´kowym zapaleniu ucha Êrodkowego.
PIÂMIENNICTWO 01. Ariel A, Lider O, Brill A, Cahalon L, Savion N, Varon D, i wsp. Induction of interactions between CD44 and hyaluronic acid by short exposure of human T cells to diverse proinflammatory mediators. Immunology 2000; 100: 345. 02. Bonder CS, Clark SR, Norman MU, Johnson P, Kubes P. Use of CD44 by CD4+ Th1 and Th2 lymphocytes to roll and adhere. Blood 2006. W druku. 03. Borland G, Ross JA, Guy K. Forms and functions of CD44. Immunology 1998; 93: 139. 04. Brieva JA, Roldan E, Rodriguez C, Navas G. Human tonsil, blood and bone marrow in vivo-induced B cells capable of spontaneous and high-rate immunoglobulin secretion in vitro: differences in the requirements for factors and for adherent and bone marrow stromal cells, as well as distinctive adhesion molecule expression. Eur J Immunol 1994; 24: 362. 05. Cichy J, Pure E. The liberation of CD44. J Cell Biol 2003; 161: 839. 06. Clark RA, Alon R, Springer TA. CD44 and hyaluronian-dependent rolling interactions of lymphocytes on tonsillar stroma. J Cell Biol 1996; 134: 1075. 07. Do Y, Nagarkatti PS, Nagarkatti M. Role of CD44 and hyaluronic acid (HA) in activation of alloreactive and antigen-specific T cells by bone marrow-derived dendritic cells. J Immunol 2004; 27: 1. 08. Föger N, Marhaba R, Zöller M. CD44 supports T cell proliferation and apoptosis by apposition of protein kinases. Eur J Immunol 2000; 30: 2888. 09. Gal I, Lesley J, Ko W, Gonda A, Stoop R, Hyman R, i wsp. Role of the extracellular and cytoplasmic domains of CD44 in the rolling interaction of lymphoid cells with hyaluronian under physiologic flow. J Biol Chem 2003; 278: 11150. 10. Gee K, Kryworuchko M, Kumar A. Recent advances in the regulation of CD44 expression and its role in inflammation and autoimmune diseases. Arch Immunol Ther Exp 2004; 52: 13. 11. Goodison S, Urquidi V, Tarin D. CD44 cell adhesion molecules. J Clin Pathol Mol Pathol 1999; 52: 189. 12. Herrlich P, Zoller M, Pals ST, Ponta H. CD44 splice variants: metastases meet lymphocytes. Immunol Today 1993; 14: 395. 13. Högerkorp CM, Bilke S, Breslin T, Ingvarsson S, Borrebaeck CAK. CD44-stimulated human B cells express transcripts specifically involved in immunomodulation and inflammation as analyzed by DNA microarrays. Blood 2003; 101: 2307. 14. Ingvarsson S, Dahlenborg K, Carlsson R, Borreabeck CAK. Co-ligation of CD44 on naive human tonsillar B cells induces progression towards a germinal center phenotype. Int Immunol 1999; 11: 739.
61
K. Ratomski i inni
15. Isacke CM, Yarwood H. The hyaluronan receptor, CD44. Int J Biochem Cell Biol 2002; 34: 718. 16. Johnson P, Maiti A, Brown KL, Li R. A role for the cell adhesion molecule CD44 and sulfation in leukocyte-endothelial cell adhesion during an inflammatory response? Biochem Pharmacol 2000; 59: 455. 17. Kim JH, Glant TT, Lesley J, Hyman R, Mikecz K. Adhesion of lymphoid cells to CD44-specific substrata: the consequences of attachment depend on the ligand. Exp Cell Res 2000; 256; 445. 18. Kremmidiotis G, Zola H. Changes in CD44 expression during B cell differentiation in human tonsils. Cell Immunol 1995; 161: 147. 19. McKallip RJ, Do Y, Fisher MT, Robertson JL, Nagarkatti PS, Nagarkatti M. Role of CD44 in activation-induced cell death: CD44 – deficient mice exhibit enhanced T cell response to conventional and superantigens. Int Immunol 2002; 14: 1015. 20. Miliçeviç NM, Nohroudi K, Miliçeviç Z, Westermann J. Blood lymphocytes, monocytes and NK cells modulate their expression of CD44, ICAM-1, LFA-1 and MHC class II after arrival into lymphoid organs. Immunol Invest 2004; 33: 439. 21. Nandi A, Estess P, Siegelman MH. Hyaluronian anchoring and regulation on the surface of vascular endothelial cells is mediated through the functionally active form of CD44. J Biol Chem 2000; 275: 14939. 22. Pure E, Cuff CA. A crucial role for CD44 in inflammation Trends Mol Med 2001; 7: 213.
62
23. Ratomski K, Wysocka J, Hassmann-Poznaƒska E, Kasprzycka E. Ekspresja receptora CD23 na limfocytach przeros∏ych migda∏ków gard∏owych u dzieci chorych na wysi´kowe zapalenie ucha. Otolaryngol Pol 2005; 59: 219. 24. Siegelman MH, DeGrendele HC, Estess P. Activation and interaction of CD44 and hyaluronan in immunological systems. J Leukocyt Biol 1999; 66: 315. 25. Sumoza-Toledo A, Santos-Argumedo L. The spreading of B lymphocytes induced by CD44 cross-linking requires actin, tubulin, and vimentin rearrangements. J Leukoc Biol 2004; 75: 233. 26. Wyant TL, Fisher MT, McKallip RJ, Nagarkatti PS, Nagarkatti M, Conrad DH. Mouse B cell activation is inhibited by CD44 cross-linking. Immunol Invest 2005; 34: 399.
Adres autora: Karol Ratomski Zak∏ad Laboratoryjnej Diagnostyki Pediatrycznej AM w Bia∏ymstoku ul. Waszyngtona 17 15-269 Bia∏ystok e-mail: [email protected] Prac´ nades∏ano: 3.07.2006 r.
Otolaryngologia Polska 2007, LXI, 1