Comment les gènes teintent les fleurs

Les fleurs,

entre nuances

et fragrances

les fleurs Le g&ie ge’ne’tique, gGke aux connaissances de plus en plus pointues SW la synthkse des pigments floraux, commence h cre’er des varie’th aux couleurs ine’dites : phtnia orange, ceillet mauve, voire Yose bleue...

D

epuis pr&s de quatre sikles, les fleurs font I’objet, en raison de leur beautP et de leur valeur commerciale, de recherches destintes :1 I’obtention de nouvelles vari&t&. Jusquc dans les annees quatre-vingt, on ne pouvait atteindre cet objectif que par des techniques d’hybridntion et, dam une moindrc mcsurc, en provoquant des mutations gCnitiyues. Les resultats impressionnants de cette silection traditionnelle sont &dents lorsquc I’on visitc les expositions et vcntes de flcurs, oii pcuvcnt Etre contenplCes des centaines d’especes de toutes origines, des milliers de vari&&, et une gamme extraordinaire de teintes et de motifs color&s. Dcpuis LUICdkcennie, dans un march6 mondial en expansion constante (voir l’article de M. Guillaume, p. 16), le gtnie g&tiyuc vicnt cornpEter cc’ savoir-faire. Ainsi, en 1987, l’tquipe de Heinz Saedler, de l’lnstitut Max-Planck de Cologne (Allemagne), a rCussi pour la premiere fois i crt5er une varittC de fleur transginique, en l’occurrence un p&unia de coulcur rouge orangf? (1). De mCme, en 1995, la firme Florigene (Collingwood, Melbourne. Australie) a donne naissance a un ceillet (Dimthus cavyophyllz~) dc couleur mauve, en lui transt& rant un gene qu’clle avait isol the/. le pCtunia (2). La crkation de roses bleues, veritable q&te du Graal pour beaucoup de chercheurs et d’hortlculteura, semblc aujourd’hui i portke de main. Ces rechcrches s’appuient sur une connaissance de la gCnCtique et la biochimie florales de plus en plus pr&ise. Depuis les travaux de <;regor Me~del sur la coloration des fleurs, des gousses et dcs graines du pois (P~SMWIsativtm), dans les anndcs 1860, les scientifiques ont rCalis6 que I’Ctude de la pigmentation des plantcs pcut contribuer j I’tlucidation des principes fondamcntaux de la g&&clue et de la biochimie. La biosynthcsc des pigments floraux est utilisCe comme ~111 systeme d’analysc cles ni&anismes qui dbterminent I’expresslon des g&es dans le temps, au tours de la vie de la plante, et dam I’espace, c’est-A-dire dam chaque cellule et dans les differents tissus. La coloration des v&taux sup&-ieurs (racines, tiges, bois, feuilles, fleurs, pollens, fruits, graincs) cst en effct due

’ D(rpattement de g&&tique molkxlaire,

Vrije

Universiteit, De Boolelaan 1087, 1081 HV Amsterdam, Pays-Bas.

Cauteur adresse ses remerciements a Erich Grotewold et Ronald Koes.

(1) P. Meyer et a/. (1987) Nature330, 677-678. (2) T.A. Holton et a/. (1993) Nature366, 276-279. (a) R.E. Koes et al. (1994) BioEssays 16, 123-132. (4) T.A. Holton, E 6. Cornish (1995) Plant Ce117,1071-1083

28

BIOFUTUR 187

l

Mars 1999

:1 I’accumulation de diffkrents pigments naturels : les chlorophylles de couleur verte, n&essaires g la photosynth&e ; les flavonoi’des, polyphCnols qui induisent des teintes jaunes (chalcones, aurones), ivoire (flavones), ou roses, oranges, rouges et bleues (anthocyanes) ; les carodnoides, responsablcs des couleurs jaune et orange ; et les b&ala’ines, pigments rouges ou jaunes caracttristiques d’un seul ordre de plantes i fleurs, les caryophyllales (la betterave et les amarantes, par exemple). La teinte des p&ales de fleurs et des fruits est largement dtterminCe par I’accumulation, dans les vacuoles des cellules de I’Cpiderme, de certains flavono’ides : les anthocyanes (de anthos, fleur, et ky‘~~zos, bleu). Ces pigments sont essentiels i la reproducdes espkces, car ils favorisent la pollinisation tion sexuie par les animaux butineurs (voir l’encadve’ p. 30). Ce sont egalement eux qui, avec les carotCnoldes, donnent leurs couleurs automnales aux feuilles, apr& la disparition des chlorophylles. La biochimie et l’enzymologie de la voie de synthgse des anthocyanes sont bien connues (3,4) (voir la figure cicontue). Presque tous les g&nes codant les enzymes, dites de structure, de cette voie ont Ctl isolts durant les dix dern&es an&es, g&e aux travaux effect&s essentiellement sur Ic mai’s (Zea mays), le pCttmia hybride (Petunia hybuida) et le muflier, ou gueule-de-loup (Antirrhinum mujtls) (4). Les chercheurs ont aussi identifiC certains des ggnes rkgulateurs qui activent ou inhibent l’expression des g&es de structure, i des niveaux (( prCcoces )) ou plus cctardifs )) de la voie de hiosynth&e des flavonoldes. Tout est parti de I’analyse g&Gtique des nombreux mutants de ces espkces, dont les fleurs ou les graines apparaissaient affect&es dans leur pigmentation. Ces recherches ont me& 5 l’isolement de transposons, tel le transposon AC (pour activutor) du ma’is, identifik en 1948 par Barbara McClintock, que les chercheurs ont ensuite utilist pour produire des mutations ciblkes (mutagen&se dirigCe) (voir Biofutur 186, 32-35). Tr&s souvent, les mutations induites entrainent I’accumulation de composCs intermkdiaires, qui donncnt aux fleurs et aux graines de nouvelles couleurs. Cepcndant, on ne rencontre jamais d’espkce prCsentant toutes les couleurs possibles. Ainsi, les roses, les chrysan-

themeset les &lets ne synthkisent pas la delphinidine, une anthocyane bleue et ses d&iv&, car ces fleurs sont dipourvues de l’enzyme nkcessaire, la flavonoi’de 3’5’.hydroxylase (F3’5’H) (5) (voiv la figure). D’oti I’impossibilitC

(5) P.Elomaa, T. Holton (1994) Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 12,63-88.

(6) M.R.Alfenito et al. (1998) Plant Gel/IO, 1135-1150.

(7) K.A.Marrs et al. (1995) Mature375, 397-400.

(6) Y.P.Lu era/. (1998) P/ant Cell IO, 267-282.

Le petunia hybride est l’un des mod6les utilisk

par la recherche pour cr6er de nouvelles couleurs florales.

d’obtenir, par croisemcnts ou par mutations, des roses violettes ou bleues. Florigene a justcment utilise le gene codant la F3’5’H pour produire sa variete d’crillet mauve.

> Une pompe B anthocyanes En revanche, sous l’action de la dihydroflavonol rbductase (DFR), le petunia synthetise la delphinidinc et ses derives pourpres. Mais il ne produit pas la pelargonidine de couleur orange, car la DFR de petunia n’agit pas sur Ic\ precurseurs de cette anthocyane, le dihydrokacmpft-rol. De ce fait, les varietes traditionnclles de petunia ne pcuvcnt avoir qu’une gamme restreintc de couleurs, allant du vcrmillon au violet. C’est en introduisant le gene de la DFR de mai’s dans des protoplastes (cellulcs depourvues de paroi) que l’equipe de Heinz Saedler a produit des petunias d’unc nouvelle teinte, rouge brique (I). La couleur des fleurs nait de la stabilisation et de l’accumulation des anthocyanes darts les vacuoles dcs ccIIuIcx. Mais, puisqu’elles sont synthttistes dans le cytosol, cm1ment les anthocyanes parviennent-elles dam ces (( pochcs ‘J cellulaires ? Ces quatre dernieres an&es, grace a I’etude de mutants, les chercheurs ont commence a decrire le mecanisme de transport en jeu. Ainsi, chez le mats, lea mutations du gene bronze2 (Bz2) entrainent la decoloration des grains, qui sont de couleur bronze. La mutation du gPnc homologue du petunia, anG~cyunin9 (ano), est a I’origine de petunias de couleur pale (6). Chcz Ic mai’s, la proteine co au dee par le gene hz2, BZ2, est une enzyme appartenant groupe des glutathion S-transferases (GST), qui inactivcnt les composes organiques toxiques en conjuguant le glutathion, un tripeptide, a ces substrats. En effet, la membrane vacuolaire (le tonoplaste) des cellules vegetales contient uric pompe dependante du glutathion (pompc GS-X), qui sequestre les composes toxiques conjugues au glutathion dans la vacuole. Dam le cas des anthocyanes, dont l’accumulation peut egalement itre toxique, la proteine 822 permet leur conjugaison au glutathion et lcur transport dans la vacuole via la pompe GS-X (7). Recemment, l’equipe de Philip Rea, de l’universite de Pennsylvanie (Philadelphie), a identifie chez l’arabette (Arubdopsis th&7rza),

deux genescodant des protknes ayant une activitk de type pompe GS-X : AtMRPl et AtMK1’2 (8). Une fois dans la vacuole, une meme anthocyanc peut prendre differentes couleurs, allant du bleu au rouge, selon

la presence d’ions metalliques et I’arrivee dans la vacuole d’autres pigments, tcls que les flavonols, flavonoi‘des launes ou incolores. <:omme les anthocyanes, les flavonols (kaempferol, quercttine, myricetine) derivent des dihydroflavonols (ou flavanonols), par suite de I’activite de la flavonol synthase (FLS) d ans le cytosol (voir la figure). Chew le petunia, le gene til codant cette enzyme influence la couleur florale, de differentes facons : par copigmentation, formation de complexes associant molecules d’anthocyane et molecules de flavonol ; et par competition pour les

3

x malonyl-CoA

OH 0

kaempf&ol

1

hydroxylase synthas

OH

--=--+

OH 0

OH flavono’de3%hydroxylase

dihydmkaempf&ol

F3’5’H

0

3’.5’-hydroxylase

dihydmquercbtine

dlhvdmmwrfeMlfta

i

DFR ANS 3GT

v

‘O-Glc

OH PBlargonidine-3-glusoside

DFR = dihydroflavonol reductase

v

‘O-Glc

OH Cyanidine-3-gluoosids

ANS = anthocyanibine synthase

Les voies de synthese des anthocyanes

(en vet-t, les genes impliqu&

BIOFUTLIR 187 l Mars 1999 29

chez le mtiis).

Les fleurs,

(9) T.A.Holton et al. (1993) PlantJ. 4, 1003-1010. (10) K. Yoshrdaeta/. (1995) Nature 373, 291. (11) A. van Houwe-

lingen ef al (1998) RantJ. 13, 39-50 (12) F.Quattrocchro

(1994)These, Vrije Universitert Amsterdam. (13) K. Noda et al.

(1994) Nature369, 661-664. (14) K.C.Coneet al (1993) PlantCe1/5, 1795-l 805.

(15) S.R.Ludwrg, S.R.Wessler(1990) Ce1162, 849-851. (16) F.Quattrocchio

et al (1998) PlantJ 13,475-488 (17) J. Goodrrch et al (1992) Ce1168. 955-964. (18) D.A. Selinger,

V.L.Chandler(1999) PlantCell11, 5-14. (19) EA. Burr et a/.

(1996) PlantCell8, 1249-1259. (20) M. Suzukiet al.

(1997) PlantCell9, 799-807 (21) E. Moyano et al. (1996) PlantCell8, 1519-I 532

-J. Mol eta/. (1999)

CurK Opin. Biotechno/. (sous presse) J. Mol eta/. (1998) Trends Plant Sci. 3,

l

212-217. l

J. Mol (1995)

Trends Biotechnol. 13, 350-355. Site Web sur Antirrhinum majus, Max-Planck Institute www.mpiz-koeln. mpgdei-stueberl snapdragon/ l

entre nuances

precurseurs des voies de synthese : la competition entre la FLS et la DFR pour le dihydroflavonol, substrat commun aux deux enzymes, peut augmenter la synthese du flavono), au detriment de celle d’anthocyanc (9). Les fleurs Pgees de nombreuses especes sont affect&s par un bleuissement de leur couleur de base, qui est lie a une augmentation du pH de la vacuole (IO). Les anthocyanes virent en effet au rouge en milieu acide, et au hleu cn milieu basiquc. Des factcurs c~lviI-oIJI1c[1lcI~t~lux et

et fragrances

cellules Ppidermrques des p&ales ont une apparence de ‘( pneu a plat )). Cette forme, la encore, provoque un changement draconic11 de la couleur florale (II). Plusieurs indices suggerent que ces differents genes sont des regulateurs de I’expression d’autres genes impliquts dans la genese de la forme des cellules.

> Les genes rbgulateurs

Indepcndamment des facteurs qui peuvent modifier la couleur des plantes, comme le pH ou la forme des cellulcs, les processus de regulation des genes influencent plus directement la pigmentation. Des mutants chez lesquels la synthese des anthocyanes est inhibee ou bloa fonction principale de la pigmentation florale est d’attirer quGe ont et6 identifies chez de nombreuses especes. les insectes et les oiseaux pollinisateurs : les motifs color& des fleurs les rendent aisement reconnaissables, par contraste Beaucoup de mutations affectent les enzymes de strucavec leur environnement. Toutefois, les pollinisateurs ne perqoiture, mais d’autres affectent les genes regulateurs qui acvent pas tous les couleurs de la meme faGon. Les fleurs rouges, tivcnt au inhibent la production de ces enzymes. En efpar exemple, sont visibles pour les colibris, mais paraissent incofet, des genes regulateurs codant des facteurs de lores aux abeilles, qui ne pemoivent que les longueurs d’onde transcription peuvent activer les genes de structure parsit&es entre 300 et 650 nanometres (I). Or I’rnactivation par suite ticipant :1 la voie de synthesr des flavono’ides. Chez le mats, ces ghes appartiennent a deux familles de mutations de seulement quelques genes intervenant dans la synthese des flavonoides peut affecter la couleur des petales. principalcs. La premiere correspond a des facteurs de transcription caracterises par LIII domaine MYB, apPar exemple, la large palette de couleurs, de motifs et de formes pelt ainsi cn raison dc sa similarite avec le domaine de des scrophulariacees du genre Mimulus provient de mutations intervenues sur quelques genes (2). De tels changements suffiliaison j I’ADN des proteines Myb, impliquees dans la sent pour que le pollinisateur ne reconnarsse plus la fleur qu’il ciilcerisation chez les mammiferes : ce sont les proteines Cl et les proteines Pl (14). La seconde famille comprend butine normalement. La plante mutante peut alors etre isolee genetiquement de ses congeneres et evoluer vers une nouvelle Its protdines R et B, autres facteurs de transcription dont la structure secondaire possede un motif de type espece. Les pigments vegetaux ont done probablement joue un role non negligeable dans l’evolution des angiospermes, depuis (( helice~boucle-helice )) (bHLH, basic helix-loop-helix ) (15). Ces categories comprennent, au sein de la leur avenement voilb 100 millions d’annees. n m&mc espece, de multiples genes paralogues (derives d’un mime gene) qui cadent des proteines similaires, (1) I? Kevan et a/. (1996) Trends Plant Sci. 1, 280-284. ayant toutefois des modes d’expression differents. Ce (2) H.D. Bradshaw Jr. et al. (1995) Nature 376, 762-765. sent probablement ces differences d’expression qui dCterminent le type de pigmentation des grains de ma?s. La .. preuv’e en est que l’expression, dans des tissus naturellegenetiques sont impliqucls dans la regul,ltion du pH vamcnt &pigmentPs, des genes cl et r, est suffisante pour y cuolarrc. Chez Ie petunia, on a ainsl decouvert 7 loci chroinduire la production d’anthocyanes. mosomiques (ph 1 a ph7) dont la mutation CALM Ic blcuisLiactivatron dcs genes de synthese requiert la combisement de la fleur (111, apparcmment par augmentation du naison d’une proteine de type MYB et d’une proteine de pH de la V~CLIOIC. Plusieurs gene\ regulant I’activite dc type K ou 8, qui mteragissent I’une avec l’autre, alors qu’a ces loci, et qui interviennent par aillcurs Jan5 Ic controle l’inverse, les prottines Pl se passent de partenaire. Chez le de la synthese des anthocyancs, ont et5 identifies par mais, on a mi5 en evidence au moins trois genes de synthese mon Cquipe, h Amsterdam : mthocyirfzln I (anl), anthoactives par le couple CUR (voir la figure) : le gene C2, qui cyunzn2 (an21 et iz~tho~-~~i7~iizl I (dfz I)]. I.cur mutation co& la chalcone synthase (CHS), le gene AZ, qui code la diaussi ~111 changcmcnt de pH (12). II est probable entraine hydroflavonol reductase (DFR), et le gene bronze1 (Bzl), qu’un ou plusieurs genes ph dent I’cxpwbion cst regulee qui code la flavonol-0-glucosyltransferase (UFGT ou par ccs g&es cadent des proteincs appartenanr a des 3 CT). Le petunia produit des proteines regulatrices sipompes de translocation dcs protons, ou :I des voirs memilaires aux protcines Cl et aux proteines R du taboliques qui produisent ou sequestrent dc5 protons OLI mai’s : AN2 et MYBPh.?, et la proteine JAF13 resdes regulatcura de protons, contribuant ,linsi h la regulapectivement (16). Chez la gueule-de-loup, l’homotion du pH vacuolaire. logue de Cl reste inconnu, mais celui des proLa couleur des plantes, influencee par le phtnomcne de ttincs Ii et B a ete identifie en 1992 : il s’agit de 1 copigmentation et par la presence d’tons dans la vacuole, la proteine DEL (pour delilu) (17). En outre, chez est aussi influencee par les variations de la forme dea cclle mais, David Selinger et Vicki Chandler (unilules 06 s’accumulent les anthocyanes. Amst, les ccllulcs de versite de I’Arizona, Tucson, fitats-Unis) ant I’epidcrme interne des petales du mufher sent coniques : de identtfit tout recernment un nouveau gene rPce fait, elles absorbent fortemcnt la lumiere et donncnt a gulateur de la synthese des anthocyanes, pale I’epidermc un aspect de velours lustre. Invcrhcmcnt, la couillcwone colorl (pilcl ). II est necessaire a I’action leur tres pale Ii& j la mutation du ghc ~~rtxtn, cliez cette 1 du couple Cl/K et agit independamment de ces facespecc, provient d’uii aplatissemcnt dca celiules epiderteurs de transcrlptton (18). miques (13). La mutation du gtme l~omologt~e cheL le pe1 tunia (myhPhl) entraine ~111 phenotype slmilalre (11). Chez II cxiste igalement des regulateurs negatifs des en . zymcs de synthese des anthocyanes. L’exemple le mieux d’autres mutants du petunia, appeles sh~~~~~lle& (47~1) (de connu est le gene intensifier 1 (lnl) identifie chez le ma% en I’anglais bo shr~uel UP, se ratatiner), une large fraction dcs

L

BIOFUTUR187 Mars 1999 l

Verra-t-on bientBt des roses bleues ?

1996

par

une

&1uipc

du

Brookhaven N,ltional Laboratory (lJpton, itat de New York) (19). 11 code une prot6lne ;1 slmilairc dux motif bHLH protCines R. Mais en raison d’unc maturation ddfcctucusc, la majorit des transcrits sont d t’orlgine de protClne5 incompl&es qui agissent commc dcs inhibitcurs. On pcut supposer que le gene In provient d’une mutation d,ins un g&ne activateur qui a 6% ensuite maintenue lor5 des cro15cments effect&s durant la domestication du mai’s. On sait peu de cboses de la faqon dent les gbncs I-+lateurs de types MYB et bHLH sent cux-mPmes actlvi.\ ou inhibks. Toutefois, de rkccntes don&s laissent pcnscr la prottine VPl, codke par le g&e (7)~ I), est un activateur de la transcription du gtne c-1 (20). Cettc action expliquerait le blocage de la transcription de 1‘1synthese des anthocyanes chez les mutants qui p‘lr allleur\ germent de manitre prbcoce par suite d’unc lnsenslbilit6 ;i I’acide abscissique, hormone n6cessairc XI maintien de I’enbryon en dormance. Les rtgulatrurs des gtnes de type bHLH n’ont, en revanche, pas Ct6 idcntifi&. Un fait curieux est I’existence de facteurs regul‘iteurs de la synthkse des flavonoldes apparemment redondants. C’est le cas par exemple, chez le muflier, pour les prottines MYB305 et MYB340 qui activent des g&nes intervenant au d6but de la voie de biosynthese des flavonoides, le g&ne /2h (codant la flavanone-3-hydrt,xvlase, F3H) par exemple. L’iquipe de Cathic Martin, au John Inncs Ccntrc (Norwich, Royaume-Uni), a montrb que ces proteines sont produites j des moments diffcrcnts et que Icur fonction d’activateur de la transcription des g6ncs ciblcs diff&-e en intensitC et en durie, bien qu’elles posstdrnt un domaine MYB quasi identique (21). MYB 305 semblc induire une transcription plus durable que MYB340, qui induit quant i elle une transcription plus puissante mars de courte durte, probabtement par I’effet d’unc comp&tition avec l’autre prot&ne. I1 est done possible que la redondancc de prot&nes MYB ait conduit i uric spCcialisation fonctionnelle permettant l’augmentation, ou le mainticn 5 un mime niveau, de la production des flavonoides, et c&nt i un systkme de rCglagc fin de la synthtse des flavonoldes. Voili dix ans, &it cr& une variCtC orange dc pktunia (1) ; Its premiers millets mauves ont d6sormais 4 ans. Aujourd’hui, il semblc quc i l’on puisse mettre :1 profit les connaissances g&i-tiques et biochimiques accumulees pour donner naissance a de noun velles variGtts par g6n1c g&idtique. En particulier, lorsque le phbnomtne de copigmentation et la rkgulation du pH vacuolairc 1 seront . bien maitrist%, la cr&tion e roses bleues ne sera saris dwtc plus inaccessible.

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