Criblage d’extraits de plantes de Madagascar pour recherche d’activité antipaludique et d’effet potentialisateur de la chloroquine

Journal of Ethnopharmacology 64 (1999) 117 – 126

Criblage d’extraits de plantes de Madagascar pour recherche d’activite´ antipaludique et d’effet potentialisateur de la chloroquine Philippe Rasoanaivo *, Suzanne Ratsimamanga-Urverg, David Ramanitrahasimbola, Herintsoa Rafatro, Albert Rakoto-Ratsimamanga Institut Malgache de Recherches Applique´es, Laboratoires de Phytochimie et de Pharmacologie Cellulaire et Parasitaire, B.P. 3833, 101 -Antananari6o, Madagascar Received 22 January 1998; received in revised form 19 May 1998; accepted 12 June 1998

Abstract Cinquante plantes ende´miques de Madagascar ont e´te´ soumises a` un criblage biologique dans le but de rechercher une activite´ antiplasmodiale in vitro et une activite´ modulatrice de la chloroquine sur la souche chloroquinore´sistante FCM29. Douze plantes ont montre´ une activite´ antiplasmodiale in vitro significative (CI50 B 5 mg/ml). Sept d’entre elles sont utilise´es en me´decine traditionnelle pour traiter le paludisme ou la fie`vre. Le re´sultat le plus saillant du fractionnement bioguide´ a e´te´ la mise en e´vidence d’une activite´ antiplasmodiale tre`s marque´e (CI50 = 0.08 mg/ml) d’une de´hydroaporphine, la de´hydrodicentrine. Sur 34 extraits teste´s, seul l’extrait alcaloı¨dique de Strychnos sp. (nom vernaculaire Tsi6oanino) et ses constituants isole´s a` l’e´tat pur ont montre´ une activite´ modulatrice de la chloroquine. © 1999 Elsevier Science Ireland Ltd. All rights reserved. Keywords: Plantes malgaches; Criblage biologique; Activite´ antipaludique; Action reversante

1. Introduction Arme´e d’un e´ventail d’antipalude´ens doue´s d’activite´s spe´cifiques et de puissants insecticides, l’Organisation Mondiale de la Sante´ (OMS) a de´clare´ en 1955 que la malaria pourrait eˆtre e´radique´e. Cependant, la conviction des anne´es * Corresponding author.

1960 qui devait voir aboutir l’e´radication du paludisme a fait place a` une confusion engendre´e par la de´ception qui suivit l’e´chec du programme de l’OMS. Les Plasmodium profitaient du re´pit qui leur e´tait donne´ pour de´velopper une forme de lutte: la re´sistance. Cette re´sistance a entraıˆne´ un de´re`glement des attitudes the´rapeutiques conduisant a` la se´lection de souches re´sistantes. Actuellement, malgre´ la panoplie des moyens mis

0378-8741/99/$ - see front matter © 1999 Elsevier Science Ireland Ltd. All rights reserved. PII: S0378-8741(98)00114-7

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en oeuvre pour le maıˆtriser, le paludisme demeure la premie`re ende´mie mondiale faisant plus de 2000000 de de´ce`s annuellement (WHO, 1996). Mais paradoxalement, une demi-douzaine seulement de me´dicaments antipaludiques sont disponibles sur le marche´. Et qui plus est, on assiste a` un de´sengagement des industries pharmaceutiques dans la recherche et le de´veloppement de nouveaux antipalude´ens. Il est donc urgent d’intensifier d’une part la prospection de nouvelles sources de mole´cules doue´es d’activite´ antipaludique avec probablement des me´canismes d’action nouveaux, et d’autre part la recherche de mole´cules qui peuvent potentialiser l’action de la chloroquine. A cette fin, Madagascar dispose d’une biodiversite´ floristique unique au monde, a` laquelle s’ajoute une tradition se´culaire de pharmacope´e traditionnelle. Nous rapportons dans le pre´sent article les re´sultats de criblage biologique d’extraits de plantes de Madagascar pour la recherche d’activite´ antipaludique et d’effet modulateur de la chloroquine. 2. Mate´riels et me´thodes

2.1. Mate´riel 6e´ge´tal Les plantes ont e´te´ collecte´es sur la base de leurs utilisations traditionnelles ou de leur ende´micite´. Elles ont e´te´ identifie´es par A. Rakotozafy par comparaison avec des e´chantillons authentiques de´pose´s au De´partement de Botanique du Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza, Antananarivo. Un e´chantillon d’herbier de chaque plante a e´te´ de´pose´ a` l’Institut Malgache de Recherches Applique´es (IMRA).

2.2. Extraction Le mate´riel ve´ge´tal (150 g) se´che´ et broye´ a e´te´ extrait jusqu’a` e´puisement par mace´ration avec l’e´thanol 95°. Les solutions alcooliques ont e´te´ e´vapore´es a` sec sous pression re´duite. La moitie´ de l’extrait alcoolique ainsi obtenu a e´te´ soumise a` un partage liquide-liquide entre le chloroforme et l’eau. La phase organique a e´te´ e´vapore´e a` sec sous pression re´duite tandis que la phase aqueuse a e´te´ jete´e.

L’extraction des alcaloı¨des totaux a e´te´ effectue´e par mace´ration re´pe´te´e du mate´riel ve´ge´tal avec de l’acide ace´tique 2.5% jusqu’a` re´action de Mayer ne´gative. Les solutions acides rassemble´es ont e´te´ alcalinise´es par du bicarbonate de sodium jusqu’a` pH  8 puis extraites trois fois par le dichlorome´thane. La phase organique e´vapore´e a` sec sous pression re´duite a laisse´ un re´sidu correspondant aux alcaloı¨des totaux.

2.3. Test antiplasmodial in 6itro La souche chloroquinore´sistante de Plasmodium falciparum FCM29/Cameroun a e´te´ utilise´e tout au long de cette e´tude. Elle a e´te´ maintenue en culture continue par la me´thode de Jensen et Trager (1977). Apre`s de´conge´lation, la suspension de P. falciparum qui e´tait conserve´e dans l’azote liquide a e´te´ lave´e une fois par une solution a` 3.5% de chlorure de sodium puis deux fois par le milieu de culture RPMI 1640 avant d’eˆtre remise en culture. Les parasites ont e´te´ maintenus en culture a` 37°C en atmosphe`re microae´rophilique obtenue par la technique de la jarre a` bougie dans le milieu de culture RPMI additionne´ de 10% de se´rum humain (milieu RPSH) et d’he´maties saines pre´alablement lave´es trois fois au milieu de culture RPMI. Le test antiplasmodial in vitro a e´te´ base´ sur la me´thode initialement de´crite par Desjardins et al. (1979). Une suspension parasitaire a` 2.5% d’he´matocrite et a` 1% de parasite´mie a e´te´ pre´pare´e en ajoutant une quantite´ approprie´e de milieu RPSH et d’he´maties saines. Cette suspension a e´te´ distribue´e dans des plaques de 24 puits (0.7 ml par cupule) contenant une gamme de concentrations de l’extrait a` tester (en triplicata) allant de 1 a` 50 mg/ml. La culture a e´te´ ensuite incube´e a` 37°C pendant 18 h dans les conditions atmosphe´riques pre´ce´demment de´crites. Passe´ ce premier temps d’incubation, une solution d’hypoxanthine tritie´e (0.5 mCi) a e´te´ ajoute´e a` chaque puits et l’incubation a e´te´ poursuivie pendant 24 h afin que le parasite puisse terminer son cycle de maturation. Apre`s ce second temps d’incubation, les plaques ont e´te´ congele´es a` −30°C pendant 2 h puis de´congele´s a` 50°C pendant Þ hr. Les suspensions ont e´te´ collecte´es sur papier filtre Whatman

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934AH avec un appareil Skratron AS Type 7005, lave´es plusieurs fois avec de l’eau distille´e, puis la radioactivite´ incorpore´e a e´te´ estime´e a` l’aide d’un compteur a` scintillation liquide LKB Wallac 1214 Reckbeta. Les concentrations qui inhibent de 50% (CI50) et 90% (CI90) la croissance des parasites ont e´te´ de´termine´es par la me´thode semi-logarithmique. Est conside´re´ comme actif un extrait dont la CI50 est infe´rieure a` 5 mg/ml. Concernant l’e´valuation de l’interaction entre la chloroquine et les extraits, deux concentrations de l’extrait a` tester largement infe´rieure a` sa CI50, habituellement la moitie´ et le quart, ont e´te´ combine´es avec une gamme de concentrations de chloroquine allant de 25 a` 1600 nM. L’effet de la combinaison a e´te´ e´value´ par la me´thode de l’isobologramme (Berenbaum, 1989). Une courbe concave indique une synergie d’action, un courbe convexe une effet antagoniste et une courbe suivant la diagonale un simple effet additif.

2.4. Fractionnement bioguide´ Les extraits actifs ont e´te´ soumis a` une se´paration chromatographique de premie`re intention sur colonne, utilisant le gel de silice comme adsorbant et l’hexane avec gradient de dichlorome´thane, puis le dichlorome´thane avec gradient de me´thanol comme e´luant. Les fractions recueillies ont e´te´ groupe´es en fonction de leur similitude en chromatographie sur couche mince et teste´es syste´matiquement. Les fractions actives ont e´te´ rechromatographie´es sur colonne de silice jusqu’a` l’obtention du principe actif a` l’e´tat pur, ou du moins d’une fraction active tre`s e´labore´e. Les fractions peu polaires ont e´te´ analyse´es par chromatographie en phase gazeuse sur appareil Chrompaq (colonne Carbowax 20M de longueur 50 m) tandis que les produits purs actifs ont e´te´ identifie´s au moyen de leurs donne´es spectrales, en particulier la RMN-1D et 2D.

3. Re´sultats

3.1. Structure chimique Les structures chimiques des compose´s bioactifs

119

identifie´s dans cette e´tude sont donne´es dans la Fig. 1. Les re´sultats des analyses en chromatographie en phase gazeuse des fractions peu polaires ainsi que l’identification structurale des constituants actifs, base´e sur l’interpre´tation de leurs donne´es spectrales, en particulier la RMN-1D et 2D, seront publie´s dans des revues approprie´es.

3.2. Acti6ite´ antiplasmodiale in 6itro Cinquante plantes ont e´te´ se´lectionne´es pour criblage biologique dans le but de rechercher une activite´ antiplasmodiale in vitro. Pour 46 plantes, les extraits alcooliques ainsi que les extraits chloroformiques obtenus par partage liquide-liquide de l’extrait e´thanolique ont e´te´ syste´matiquement utilise´s a` cette fin tandis que les extraits totaux alcaloı¨diques ont e´te´ teste´s pour quatre plantes. Les re´sultats sont re´pertorie´s dans le Tableau 1 (Table 1). Sur la base de la valeur des CI50 pour lesquelles un extrait ayant une CI50 B 5 mg/ml est conside´re´ comme actif, 12 plantes ont montre´ une activite´ antiplasmodiale in vitro significative. Sept d’entre elles sont utilise´es en me´decine traditionnelle pour traiter le paludisme ou la fie`vre. Dans tous les cas, les extraits chloroformiques ont e´te´ plus actifs que les extraits e´thanoliques correspondants. Les valeurs des CI50 et CI90 des cinq plantes qui ont fait l’objet de fractionnement bioguide´ sont consigne´es dans le Tableau 2 (Table 2). L’extrait le plus actif est issu de Mundulea antanossarum avec une CI50 de 0.40 mg/ml pour l’extrait chloroformique. Elle est utilise´e dans la partie Sud de Madagascar pour traiter le paludisme. L’activite´ antiplasmodiale a e´te´ localise´e dans la fraction peu polaire d’aspect huileux (CI50 = 0.12 mg/ml) qui, analyse´e en chromatographie sur couches minces et en chromatographie en phase vapeur, contient plusieurs constituants de polarite´ voisine. Aucun produit pur actif n’a pu eˆtre isole´ jusqu’a` pre´sent de cet extrait huileux. Ocotea lae6is n’a pas d’utilisation traditionnelle. Le fractionnement bioguide´ de l’extrait chloroformique (CI50 = 0.9 mg/ml) a permis d’isoler le constituant antiplasmodial identifie´ a` une de´hydroaporphine connue, la de´hydrodicentrine 1 (CI50 = 0.08 mg/ml) obtenue en faible quantite´.

Bignoniaceae Fernandoa madagascariensis Sprague (AR-Morondava-548) Phyllarthron bernierianum Seeman (PR/U-Toliara-036) Stereospermum euphoroides De Candolle (PR/UToliara-072) Stereospermum 6ariabile Perrier de la baˆthie(PR/ U-Toliara-040) Boraginaceae Cordia rothii Roemer & Schultes (PR/U-Morondava-018)

Alafia fuscata Pichon (AR-Andasibe-99) Pachypodium densiflorum Baker (PR/U-Toliara057) Pachypodium geayi Costantin & Blois (PR/UToliara-056) Ascle´piadaceae Ischnolepis tuberosa Jumelle & Perrier (PR/AR/ PhG-Isalo) Asteraceae Brachylaena ramiflora Humbert (PR/AR-Nosybe an’Ala-249) Centipeda orbicularis Lour. (AR/MR-Ambohidratrimo-01) Dicoma incana Baker & Hoffman (PR/AR/UAndraname-373) Mikania scandens Willdenow (PR-Andasibe-06)

Apocynaceae Cabucala madagascariensis De Candolle (APMorondava-01)

Nom scientifique (Identification de l’herbier de´pose´ a` l’IMRA)

Sans utilisation traditionnelle

De´coction: Contre l’e´pilepsie, les maux d’estomac, la 1.4/1.1 blennorragie, fe´brifuge, antipaludique, vermifuge. De´coction: contre les caries dentaires 4.9/2.3

Rz

F

De´coction: Contre le paludisme. De´coction: Contre les maladies ve´ne´riennes, la neurasthenie, antitussif, se´datif, fe´brifuge, fortifiant. De´coction: He´mostatique, cicatrisant, fe´brifuge. De´coction: Fortifiant, fe´brifuge.

De´coction: Hypotenseur,

ET F ET ET

F

31.9/21.6

Antagonisme

Additivite´

Non teste´

\50/\50 32.5/28.5

Non teste´

Additivite´

Additivite´

Additivite´

2.8/0.5

\50/\50

De´coction: Contre les maladies ve´ne´riennes, les mal- 18.6/13.0 adies mentales.

PA

\50/20.0

De´coction: Tonique amer, fe´brifuge.

PA

Additivite´

Additivite´

Non teste´

Additivite´

\50/\50

Toxique

PA

47.6/37.5

Non teste´ Additivite´

Additivite´

Combinaison avec la chloroquine

PA PA

CI50 mg/ml Ext. EtOH/Ext. CHCl3

De´coction: Traitement de la maladie de la moelle 1,3a e´pinie`re, des maux d’estomac, de la blennorragie, du rhumatisme, de la goutte, de l’alope´cie, vermifuge, tonique, diure´tique. Sans utilisation traditionnelle \50/\50 Sans utilisation traditionnelle \50/\50

F

Parties utilise´es Utilisations traditionnelles releve´es dans la litte´rature; mode de pre´paration.

Table 1 Utilisations traditionnelles des 50 plantes soumises a` un criblage pour la recherche d’activite´ antipaludique et d’effet potentialisateur de la chloroquine, valeurs de la CI50 de leurs extraits e´thanoliques et fractions chloroformiques et effets de la combinaison des fractions chloroformiques (ou extraits bruts alcaloı¨diques) avec la chloroquine

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Burseaceae Commiphora bre6icalyx Perrier de la Baˆthie ARMorondava-575) Buxaceae Buxus madagascariensis Baillon (AR-Toliara601) Capparidaceae Capparis chrysomeia Bojer (PR/U-Sakaraha-078) Cratae6a excelsa Bojer (PR/U-Sakaraha-096) Celastraceae E6onymopsis longipes Perrier de la Baˆthie (ARMorondava-555) Cucurbitaceae Xerosicyos danguyi Humbert (PR/AR-Betioky375) Dichapetalaceae Dichapetalum thouarsianum Roemer & Schultes (PR-Andasibe-13) Euphorbiaceae Croton ho6arum Leandri (PR/AR-Ambohitan tely-09) Croton geayi Leandri (PR/U-Toliara-008) Gi6otia madagascariensis Baillon (AR-Moron dava-595) Phyllanthus decipiens var. antsihanakensis Leandri (PR-Ampanotoamazaina-08) Securinega perrieri Leandri (PR/AR-Betioky343) Fabaceae Chadsia gre6ei Drake del Castillo (MF-Toliara03) Lo6anafia mahafaliensis Peltier (PR/AR-An draname-339° Millettia per6illeana Viguier & Humbert (BRSoalary-07) Mundulea antanossarum Humbert (PR/U-To liara-030) Hamamelidaceae Dicoryphe 6iticoides Baker AR/JR-Ankaratra486) Hippocrateaceae Hippocratea angustipetala Perrier de la Baˆthie (PR/U-Toliara-013) Sans utilisation traditionnelle

Toxique De´coction: antipaludique De´coction: contre les sequelles du paludisme De´coction: antipaludique Sans utilisation traditionnelle

Sans utilisation traditionnelle Sans utilisation traditionnelle Mace´ration: ichtyotoxique De´coction: antipaludique

Sans utilisation traditionnelle

De´coction: contre la gale en traitement externe

ET

F ET PA ER ET

ET PA ER PA

ET

ET

38.8/28.7

17.6/12.8

3.5/1.1

16.8/9.7

Additivite´

Additivite´

Non teste´

Additivite´

Additivite´

Non teste´

\50/\50 8.7/5.7

Additivite´

Additivite´

Additivite´ Additivite´

Additivite´

Additivite´

Additivite´

35.3/31.4

3.6/1.6

5.5/3.8 \50/12.1

35.6/29.7

39.6/26.2

De´coction: Abortif, analge´sique, cicatrisant, odontal- 16.0/14.7 gique, vermifuge.

F

Antagonisme

\50/38.5

De´coction: contre les sequelles du paludisme

PA

Additivite´ Additivite´

\50/22.8 37.5/31.8

De´coction: contre les maux de teˆte. De´coction: Fortifiant.

PA ET

Non teste´

\50/\50

De´coction: Abortif, tonique amer, odontalgique, purgatif.

ET

Non teste´

\50/\40.8

Sans utilisation traditionnelle

ET

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Oncostemum capitatum Perrier de la Baˆthie (PR/ AR-Andasibe-183) Olacaceae Ximenia perrieri Cavaco & Keraudren (PR/ARBetioky-333) Rubiaceae Ixora leptoclada Drake del Castillo (PR/ARSakaraha-323) Psychotria bullata Bremekamp (PR/JPA-Andasibe-06) Schismatoclada farahimpensis Baker (PR/AR-Andasibe-244) Rutaceae Vepris ampody Perrier de la Baˆthie (PR-Andasibe-03)

De´coction: fortifiant

ET

18.5/11.8

Additivite´

Non teste´

\50/\50 De´coction: fe´brifuge, fortifiant

ET

Non teste´

\50/\50 De´coction: contre les douleurs lombaires

Non teste´

\50/37.9

F

Non teste´

\50/\50

Sans utilisation traditionnelle

Non teste´

\50/\50

PA

Non teste´

\50/\50

De´coction: traitement des maladies de la moelle e´pinie`re, ne´vrites, ne´vralgies, maux de ventre, douleurs articulaires, contre la syphilis, la blennorragie, la goutte, les bruˆlures, les ulce`res, vermifuge Sans utilisation traditionnelle

De´coction: purgatif, contre les maux des yeux

Non teste´

\50/\50

Additivite´

Antagonisme

Sans utilisation traditionnelle

PA

ET

32.3/26.8

Sans utilisation traditionnelle

De´coction: antidysente´rique, fortifiant, antipaludique, 1.7a adjuvant de la chloroquine. Sans utilisation traditionnelle 3.0a

Synergie

3.2a

De´coction: antipaludique

Non teste´

Additivite´

7.5/0.9

Sans utilisation traditionnelle

Combinaison avec la chloroquine

Additivite´

CI50 mg/ml Ext. EtOH/Ext. CHCl3

De´coction: traitement des maladies de la fontannelle, 8.7/4.9 contre l’ecze´ma, gale et ulce`re, antipaludique

Parties utilise´es Utilisations traditionnelles releve´es dans la litte´rature; mode de pre´paration.

Hypericaceae Psorospermum androsaemifolium Baker (AR/PR- ET Morarano-Chrome-661) Lauraceae Ocotea lae6is Kostermans (PR/AR-Andasibe-177) ET Loganiaceae Strychnos sp (Tsivoanino) (AR/MA-Morondava- ET, F 01) Meliaceae Malleastrum boi6iniana Leroy (PR/U-Toliara-088) ET Menispermaceae Burasaia madagascariensis Thouars (PR-Andasibe-ER 07) Triclisia macrocarpa Baillon (JPA/MRET Ankarafantsika-01) Monimiaceae Tambourissa rota Baker (AR-Andasibe-612) ET Myrsinaceae Embelia concinna De Candolle (PR/AR-Betioky- PA 331)

Nom scientifique (Identification de l’herbier de´pose´ a` l’IMRA)

Table 1 (suite)

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Sans utilisation traditionnelle Sans utilisation traditionnelle De´coction: fe´brifuge

Sans utilisation traditionnelle

ET ET ET

PA

a

F, feuilles; ET, e´corces de tige; ER, e´corces de racines; PA, parties ae´riennes; Rz, Rhizomes. Extrait brut alcaloı¨dique.

Vepris fitora6ina Perrier de la Baˆthie (PR-Anda sibe-04) Vepris macrophylla Verdoorn (PR-Andasibe-05) Zanthoxylum tsihanimposa Perrier de la Baˆthie (PR/AR-Andasibe-189) Sphaerosepalaceae Rhopalocarpus lucidus Bojer (PR/AR-Sakaraha314) 16.7/10.5

20.9/15.4 \50/\50

22.0/17.8

Additivite´

Additivite´ Antagonisme

Additivite´

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Burasaia madagascariensis est la plante la plus anciennement utilise´e a` Madagascar pour traiter le paludisme. La burasaine, revendique´e comme e´tant le nitrate de palmatine 2, a e´te´ identifie´e comme e´tant le principe actif de la plante(Rakoto-Ratsimamanga et al., 1969). La CI50 de la burasaine trouve´e dans nos expe´riences est de 0.40 mg/ml. L’onopordopicrine 3 (CI50 =0.51 mg/ml) isole´e pour la premie`re fois de Brachylaena ramiflora a e´te´ identifie´e comme principe actif de cette plante tandis que pour Phyllarthron bernierianum, l’activ-

ite´ antiplasmodiale de l’extrait chloroformique a e´te´ localise´e dans la fraction peu polaire d’aspect huileux (CI50 = 0.11 mg/ml) contenant principalement des phthalates d’apre`s l’analyse en RMN.

3.3. Effet de la combinaison Concernant l’e´valuation de l’action modulatrice des plantes teste´es vis-a`-vis de la chloroquine, 30 extraits chloroformiques et quatre extraits alcaloı¨diques ont e´te´ respectivement combine´s a` la

Fig. 1. Structure chimique des mole´cules identifie´es.

P. Rasoanai6o et al. / Journal of Ethnopharmacology 64 (1999) 117–126 Table 2 CI50 et CI90 des constituants bioactifs identifie´s a` partir de cinq plantes ayant montre´ une activite´ antiplasmodiale in vitro significative Plantes actives

Constituants bioactifs CI50/CI90 (mg/ml)

O. lae6is B. madagascariensis B. ramiflora M. antanossarum P. bernierianum

De´hydrodicentrine 1 Palmatine 2

0.08/0.18 0.40/1.50

Onopordopicrine 3 Fraction huileuse peu polaire Fraction peu polaire contenant des phthalates Chloroquine

0.51/1.22 0.21/0.70

Compose´ de re´fe´rence

0.11/0.26

0.11/0.23

chloroquine et leur interaction a e´te´ e´value´e par la me´thode de l’isobologramme. Les re´sultats sont consigne´s dans le Tableau 1, colonne 4. Il ressort de cette e´tude que, seul l’extrait brut alcaloı¨dique de Strychnos sp. (nom vernaculaire Tsi6oanino) a montre´ une action potentialisatrice significative vis-a`-vis de la chloroquine. La se´paration chromatographique de cet extrait a permis d’isoler la spermostrychnine 4, la strychnospermine 5, la 3methoxy-spermostrychnine 6, la 11-methoxy,12hydroxy-spermostrychnine 7 et la diaboline 8 qui, vis-a`-vis de la chloroquine, ont tous montre´ une activite´ synergique. Ceci a e´te´ mise en e´vidence par l’allure concave des courbes d’isobologramme indiquant clairement une interaction synergique (Fig. 2). Par contre, un effet antagoniste de la chloroquine, mise en e´vidence sans ambiguı¨te´ par l’allure convexe de la courbe d’isobologramme (Fig. 2), a e´te´ observe´ pour la palmatine 2.

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articles qui soulignent l’importance de l’ethnopharmacologie dans la de´couverte de nouvelles mole´cules bioactives. La plante la plus active, M. antanosarum, est d’ailleurs issue de la me´decine traditionnelle. Elle a e´te´ recommande´e pour e´tude scientifique par un dispensaire du Sud de Madagascar qui l’utilise pour traiter le paludisme. Aucun constituant bioactif n’a e´te´ isole´ jusqu’a` pre´sent de cette plante. Mais le re´sultat le plus inattendu de notre e´tude est la mise en e´vidence de l’activite´ antiplasmodiale prononce´e de la de´hydrodicentrine 1 appartenant a` la famille chimique des de´hydroaporphines. La pre´sence de la double liaison confe`re a` la mole´cule une structure phe´nanthre´nique et ceci devrait jouer un roˆle cle´ dans l’activite´ biologique. La structure phe´nanthre´nique des de´hydroaporphines rappelle celle de l’halofantrine, et il est probable que cette similitude de structure chimique serait partiellement responsable de leur activite´ antipaludique. Cependant, l’hypothe`se de mole´cule intercalante de l’ADN comme cela a e´te´ rapporte´ dans le cas de la cryptole´pine n’est pas a` exclure (Kirby et al., 1995). A notre connaissance, c’est la premie`re fois qu’une activite´ antiplasmodiale prononce´e a e´te´ de´tecte´e chez les de´hydroaporphines. Etant facilement synthe´tisable, les de´hydroaporphines me´ritent une attention particulie`re comme antipaludiques potentiels.

4. Discussion Plantes (15) utilise´es en me´decine traditionnelle malgache pour le traitement du paludisme (Rasoanaivo et al., 1992) ont e´te´ se´lectionne´es dans cette e´tude. 7 (46.6%) ont montre´ une activite´ antiplasmodiale in vitro significative. Si, avec ce re´sultat, on conside`re l’ensemble des 12 plantes actives, 58.3% sont issues de la me´decine traditionnelle, et ceci rejoint les conclusions de plusieurs

Fig. 2. Isobologrammes d’interaction entre la chloroquine et respectivement l’extrait brut alcaloı¨dique de Strychnos sp. Ainsi que trois constituants, diaboline, spermostrychimie et 11-Ome-12-OH-spermostrychnine, utilisant la souche chloroquino-re´sistante FCM29.

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P. Rasoanai6o et al. / Journal of Ethnopharmacology 64 (1999) 117–126

B. ramiflora a plusieurs utilisations en me´decine traditionnelle malgache. L’onopordopicrine 3 a e´te´ isole´e ici pour la premie`re fois de cette espe`ce. Des activite´s cytotoxiques, antibacte´riennes et antifongiques ont e´te´ rapporte´es pour ce produit (Lonergan et al., 1992). Il est probable que l’activite´ antiplasmodiale observe´e in vitro pour le compose´ trois serait due a` sa cytotoxicite´. Concernant l’effet de la combinaison des extraits avec la chloroquine, seul Strychnos sp. a montre´ une action synergique vis-a`-vis de la chloroquine, activite´ retrouve´e chez trois constituants alcaloı¨diques. Ce re´sultat rame`ne donc a` trois le type d’alcaloı¨des de Strychnos qui inversent la chloroquino-re´sistance: type Nb-C(3)-seco repre´sente´ par la strychnobrasiline, type Nb-C(21) secocurinane repre´sente´ par la malagashanine et type spermostrychnine (Rasoanaivo et al., 1996). Pareille diversite´ structurale offre un cas inte´ressant d’e´tudes de relation structure-activite´. Quant a` B. madagascariensis, nous l’avons e´tudie´ dans le pre´sent travail, non pas pour son activite´ antipaludique de´ja` connue, mais plutoˆt pour une action potentialisatrice e´ventuelle sugge´re´e par son emploi empirique comme adjuvant de la chloroquine (Rakoto-Ratsimamanga et al., 1969). Cependant, un effet antagoniste de la chloroquine a e´te´ observe´ pour la palmatine 2, principal constituant actif de la plante. Deux re´sultats pertinents issus de cette e´tude sont exploite´s actuellement dans un travail d’e´quipe pluridisciplinaire. La premie`re partie de ce travail concerne la synthe`se de plusieurs de´rive´s de de´hydroaporphines dans le but de de´gager une mole´cule ayant le meilleur profil pharmacologique pour e´tudes plus approfondies. La seconde partie se rapporte a` l’e´tude de relations structure-activite´ des diffe´rents alcaloı¨des modulateurs de la chloroquinore´sistance isole´s de Strychnos ainsi que de leurs de´rive´s he´misynthe´tiques.

Remerciements Ce travail a e´te´ soutenu par l’Agence francophone pour l’Enseignement supe´rieur et la Recherche (AUPELF-UREF) dans le cadre d’une Action de Recherche concerte´e (Convention ARC n°X/710.04/palu. 95/IMRA-PR) du Fonds francophone de la Recherche.

Re´fe´rences Berenbaum, M.C., 1989. What is synergy? Pharmacological Reviews 41, 93 – 141. Desjardins, R.E., Canfield, C.J., Haynes, J.D., Chulay, J.D., 1979. Quantitative assessment of antimalarial activity in vitro by an automated dilution technique. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 16, 710 – 718. Jensen, J.B., Trager, W., 1977. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. Journal of Parasitology 63, 883 – 886. Kirby, G.C., Paine, A., Warhurst, D.C., Noamese, B.K., Phillipson, J.D., 1995. In vitro and in vivo antimalarial activity of cryptolepine, a plant-derived indoloquinoline. Phytotherapy Research 9, 359 – 363. Lonergan, G., Routsi, E., Georgiadis, T., Agelis, G., Hondrelis, J., Matsoukas, J., Larsen, L.K., Caplan, F.R., 1992. Isolation, NMR studies, and biological activities of onopordopicrin from Centaurea sonchifolia. Journal of Natural Products 55, 225 – 228. Rasoanaivo, P., Petitjean, A., Ratsimamanga-Urverg, S., Rakoto-Ratsimamanga, A., 1992. Medicinal plants used to treat malaria in Madagascar. Journal of Ethnopharmacology 37, 117 – 127. Rasoanaivo, P., Ratsimamanga-Urverg, S., Frappier, F., 1996. Re´sultats re´cents sur la pharmacodynamie d’alcaloı¨des de Strychnos malgaches. Cahiers Sante´ 6, 249 – 253. Rakoto-Ratsimamanga, A., Boiteau, P., Mouton, M., (1969) Ele´ments de Pharmacope´e Malagasy, Tome I, Tananarive, 172 – 193. WHO (1996). World malaria situation in 1993, Weekly Epidemiological Record, 3, 17 – 22; 4, 25 – 29; 5, 37 – 39; 6, 41 – 48.