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Effets de la stimulation sur la qualité ovocytaire
Gynécologie Obstétrique & Fertilité 35 (2007) 890–897 http://france.elsevier.com/direct/GYOBFE/
Douzièmes Journées nationales de la FFER (Amiens, 3–5 octobre 2007)
Effets de la stimulation sur la qualité ovocytaire Consequences of stimulation on oocyte quality P. Clément Unité de génétique et reproduction, laboratoire Clément, 8, avenue Henri-Barbusse, 93150 Le-Blanc-Mesnil, France Reçu le 2 juin 2007 ; accepté le 29 juin 2007 Disponible sur internet le 05 septembre 2007
Résumé En Assistance médicale à la procréation, les stimulations ovariennes présentent le risque d’hyperstimulation. Des approches de stimulations moins agressives sont proposées de façon à diminuer ce risque. La question se pose de savoir quelles sont les conséquences du type de stimulation sur la qualité ovocytaire, élément fondamental d’un développement embryonnaire précoce de qualité. La qualité ovocytaire peut être évaluée par différentes techniques directes ou indirectes, plus ou moins subjectives. Plusieurs études semblent montrer que la stimulation a une influence sur la qualité ovocytaire, notamment au niveau chromosomique, voire épigénétique. Il semble que des stimulations moins fortes (par exemple avec des protocoles antagonistes) sélectionnent certainement moins d’ovocytes, mais que ceux-ci sont en majorité de meilleure qualité et plus aptes à donner des embryons euploïdes permettant une grossesse évolutive. © 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Abstract In all IVF programs, ovarian stimulation may lead to a hyperstimulation syndrome. Mild ovarian stimulations are suggested to reduce this complication of infertility treatment. In this article, we wonder what the consequences of different stimulations are on oocytes quality. The quality of the oocyte being the major factor of the development of a good embryo, it can be evaluated by direct or indirect techniques. Some are subjective. Several studies seem to show that ovarian stimulation has an influence on oocye quality, especially at a chromosomic and perharps, epigenetic level. It seems that a mild stimulation (for example with GnRH antagonist) selects less oocytes but with a better quality and produces euploid embryos. The uterine transfer of this kind of embryo should lead to an ongoing pregnancy. © 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Assistance médicale à la procréation (AMP) ; Stimulation ovarienne ; Qualité ovocytaire ; Aneuploïdie ovocytaire et embryonnaire ; Épigenèse Keywords: Assisted reproductive techniques (ART); Ovarian stimulation; Oocyte quality; Oocyte and embryo aneuploidy; Epigenesis
1. Introduction Depuis plus de 20 ans et les débuts de la fécondation in vitro, différents protocoles sont utilisés en Assistance médicale à la procréation (AMP) pour traiter les patientes et obtenir une quantité suffisamment importante d’ovocytes, afin d’augmenter le nombre d’embryons, et ainsi les chances de grossesse. Ces protocoles de superovulation qui permettent de dépasser largement les processus physiologiques sont discutés depuis plusieurs années en raison des effets secondaires qu’ils peuvent
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entraîner, principalement le risque d’hyperstimulation [1]. Le critère de quantité d’ovocytes obtenu, qui était dans un premier temps considéré comme positif, a peu à peu laissé la place à la notion de qualité ovocytaire. À partir de ce critère, des réflexions sur le type de stimulation plus ou moins forte à utiliser en AMP se sont développées. À ce titre, l’arrivée des molécules antagonistes de la GnRH a permis d’avoir une nouvelle approche sur des protocoles de stimulations moins agressifs [2]. Un des critères majeurs, permettant de savoir si tel type de stimulation est bénéfique ou délétère pour l’ensemble du processus d’AMP, concerne la qualité ovocytaire, garante en partie de celle du développement embryonnaire et des chances d’obtenir une grossesse évolutive.
1297-9589/$ - see front matter © 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.gyobfe.2007.06.010
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2. Physiologie de la croissance ovocytaire La croissance et le développement ovocytaire sont intimement liés à la croissance folliculaire. L’initiation de la croissance folliculaire ne dépend pas des gonadotrophines, mais de facteurs locaux comme le SCF et son récepteur cKit, et le TGFbêta2. La croissance du follicule basal est également peu dépendante des gonadotrophines, mais de facteurs locaux comme, par exemple, le produit du gène GDF9. Chez une femme jeune, à chaque cycle, entre 10 et 30 ovocytes sont recrutés [3]. C’est uniquement à partir d’un certain stade de la croissance folliculaire, au moment où apparaissent des récepteurs aux gonadotrophines sur les cellules folliculaires, qu’intervient la FSH. Cette action commence au moment du recrutement folliculaire avec une cohorte de follicules gonadodépendants qui entrent en croissance. Puis, au moment de la sélection d’un follicule dominant de manière concomitante à une diminution du taux de FSH, les autres follicules subissent une atrésie avec un processus d’apoptose des ovocytes qu’ils contiennent. En cas de traitement par une FSH exogène, ce phénomène physiologique est débordé, permettant de faire échapper la majorité de ces follicules au phénomène de sélection et de dominance. La stimulation ovarienne par les FSH exogènes intervient donc à une phase relativement tardive du développement folliculaire. Parallèlement au développement folliculaire, a lieu le développement de l’ovocyte contenu dans le follicule ; les deux processus sont intimement liés en faisant intervenir des régulations paracrine et autocrine entre les cellules folliculaires et l’ovocyte [4]. La compétence ovocytaire est régulée à différents moments de la folliculogenèse, notamment la compétence à la reprise de la méiose (l’ovocyte étant bloqué en prophase de première division méiotique), mais aussi celle à la fécondation, impliquant, entre autre, le relargage des granules corticaux, les oscillations calciques [5] ; enfin, la compétence à assurer le développement embryonnaire précoce [6]. Les études des gènes de l’ovocyte et des cellules du cumulus, et surtout de leurs niveaux d’expression (transcriptome et protéome) sont informatives pour connaître la dépendance entre folliculogenèse et ovogenèse aux différents stades des croissances folliculaire et ovocytaire [7,8]. Les traitements de stimulations en AMP interviennent à un stade de l’ovogenèse où la qualité ovocytaire est déjà prédéterminée chez la patiente. Cette qualité ovocytaire peut être explorée de manière indirecte par le statut ovarien de la patiente grâce au bilan hormonal et échographique au troisième jour du cycle. Chez des patientes dites mauvaises répondeuses, les traitements de stimulation ovarienne n’amélioreront pas la qualité ovocytaire, même s’ils permettent d’obtenir un nombre plus ou moins satisfaisant d’ovocytes au moment de la ponction. Ces traitements, qui permettent de dépasser les phénomènes physiologiques, même s’ils interviennent assez tard dans la folliculogenèse, sont concomitants à des phénomènes métaboliques intenses au niveau des cellules folliculaires, des ovocytes et à des relations entre ces deux compartiments cellulaires. Ces
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modifications métaboliques seront fondamentales pour la suite de la croissance ovocytaire, la fécondation et le début du développement embryonnaire. Il est effectivement clairement défini que des éléments aussi importants que la modification de structure de la chromatine, la transcription (synthèse d’ARN messagers), la mise en place de l’empreinte parentale, la production de GSH, la phosphorylation des centrosomes, le réarrangement des microtubules, la compétence à la reprise de la méiose, la capacité aux oscillations calciques etc. sont acquis pendant les derniers stades de la maturation ovocytaire, à partir du stade de follicule antral [4]. Certains phénomènes métaboliques sont même très tardifs, comme par exemple la synthèse de glutathion qui servira à décondenser l’ADN du spermatozoïde et qui est LH dépendante ; sa synthèse étant activée par le pic de LH [9,10]. Il est donc justifié de se poser la question de savoir si les traitements de stimulations utilisés en AMP et notamment à trop fortes doses, peuvent être délétères pour la qualité ovocytaire. 3. Estimation de la qualité ovocytaire L’évaluation de la qualité de l’ovocyte chez la femme est assez difficile et le plus souvent assez subjective. Différentes méthodes d’évaluation peuvent être utilisées. Soit des méthodes non invasives comme l’observation de la morphologie de l’ovocyte au microscope ou à l’aide d’un polscope permettant d’observer le fuseau méiotique. Ces observations nécessitent que les ovocytes soient dénudés, ce qui, dans la pratique de l’AMP, n’est effectué qu’en cas de fécondation in vitro avec micro-injection ou a posteriori sur des ovocytes de fécondation in vitro sans micro-injection et non fécondés. De très nombreuses études, dans la littérature, ont évalué la morphologie des ovocytes et les résultats sont souvent contradictoires, dans la mesure où les critères restent subjectifs. Une étude multicentrique a étudié plus de 1900 ovocytes et a défini 18 paramètres morphologiques permettant de définir l’ovocyte idéal sur un plan morphologique [11]. En pratique, le pourcentage d’ovocytes idéaux était très variable en fonction des équipes (5 à 60 %), ce qui prouve le caractère subjectif de cette analyse. L’évaluation peut également être réalisée avec des méthodes invasives comme par exemple la biopsie du premier globule polaire permettant d’analyser le caractère euploïde de l’ovocyte. Même si la qualité morphologique de l’ovocyte peut faire partie des critères nous permettant de connaître le potentiel de développement embryonnaire [12], ces évaluations restent malgré tout partielles, dans la mesure où elles n’évaluent pas les données moléculaires (cytoplasmiques, génétiques et épigénétiques) de l’ovocyte. La qualité essentielle d’un ovocyte n’est pas d’avoir une morphologie qui nous semble bonne, mais de permettre une prise en charge efficace de la fécondation par un spermatozoïde, et un développement embryonnaire précoce de bonne qualité. Cette donnée est fondamentale dans l’évaluation de la qualité ovocytaire puisque la fécondation, la syngamie et les premières étapes du développement embryonnaire (au
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moins jusqu’au stade de l’activation du génome embryonnaire) dépendent en grande partie des ARN messagers présents dans l’ovocyte au moment de l’ovulation [13], permettant une régulation du métabolisme embryonnaire au cours des premiers stades du développement [14]. Il existe néanmoins une transcription du zygote au stade 2 pronuclei, mais celle-ci n’intéresse que les chromosomes sexuels, et notamment le gène SRY [15]. L’activation de la transcription du génome embryonnaire de l’embryon humain se fait au stade 4 — huit cellules [16]. L’évaluation de la qualité ovocytaire peut aussi être faite par une méthode indirecte non invasive permettant de connaître la compétence ovocytaire à assurer une fécondation et un développement embryonnaire de bonne qualité. Cette méthode peut consister à suivre le développement embryonnaire (qualité morphologique embryonnaire, cinétique de développement embryonnaire, développement jusqu’au stade blastocyste) après une fécondation in vitro. Une méthode invasive comme la biopsie de blastomère (diagnostic pré-implantatoire ou DPI) peut également être une évaluation indirecte afin de connaître le statut chromosomique de l’embryon. Cette méthode a été, entre autres, utilisée pour sélectionner les embryons euploïdes à transférer chez les patientes plus âgées chez qui, une moins bonne qualité ovocytaire, entraîne une augmentation du pourcentage d’embryons aneuploïdes (pouvant aller jusqu’à 100 % chez certaines patientes) et des échecs d’AMP [17,18]. Toutefois, ces méthodes d’évaluation de la qualité ovocytaire à travers le développement embryonnaire restent également partielles puisque celui-ci dépend également de la qualité du spermatozoïde à l’origine de cet embryon et certainement aussi, en partie, des conditions de cultures embryonnaires in vitro [13]. 4. Effet de la stimulation sur la qualité ovocytaire 4.1. Types de stimulation En fonction des indications, de nombreux protocoles de stimulation sont actuellement utilisés en AMP, que nous ne pouvons pas tous décrire ici. Pour répondre à la question de l’influence de la stimulation sur la qualité ovocytaire, et ce principalement dans le cadre d’un sujet plus général posant la question de savoir s’il faut stimuler plus ou moins, il semble que deux grands types de stimulation peuvent être pris en compte. Ce sont principalement les protocoles utilisant les agonistes de la GnRH, dits protocoles longs et certains protocoles utilisant les antagonistes de la GnRH qui permettent d’avoir des stimulations ovariennes moins fortes. 4.2. Conséquences sur la qualité ovocytaire 4.2.1. Aspect morphologique Les données morphologiques ovocytaires étant relativement subjectives, peu d’études ont cherché une relation entre type de stimulation et qualité morphologique ovocytaire, l’évaluation portant davantage sur la notion de qualité morphologique embryonnaire qui est plus facile à évaluer.
Une étude montre moins d’ovocytes avec anomalies cytoplasmiques après FSH HP (14,4 %) qu’après HMG (22,4 % : p = 0,02) [19]. Une autre étude ne montre pas de différence dans le taux d’ovocytes dysmorphiques entre HMG, FSH HP et FSHrec [20]. Ces deux études ne comparaient pas des protocoles de stimulation plus ou moins forts, mais des stimulations utilisant des molécules soit urinaires, soit recombinantes. Sur le plan morphologique, le seul critère considéré comme véritablement pathogène pour un ovocyte est la présence de vacuoles au niveau du cytoplasme, certainement, dans la majorité des cas, témoin d’un processus d’entrée en apoptose de l’ovocyte. En cas de stimulation par une FSH exogène, tous les follicules recrutés ne sont pas au même stade de maturation et le manque de vascularisation de certains follicules est probablement responsable d’une hypoxie entraînant un phénomène d’apoptose des ovocytes contenus dans ces follicules. Il est possible qu’une stimulation plus forte augmente ce phénomène. La présence de vacuoles dans le cytoplasme ovocytaire doit être considérée comme un élément défavorable pour la fécondation et le développement embryonnaire précoce [12]. Dans cette même étude, Ebner ne note pas de différence du taux d’ovocytes vacuolés en fonction du protocole de stimulation (protocole agoniste long versus protocole antagoniste), ce qui pourrait laisser penser que le niveau de stimulation n’influence pas le nombre d’ovocytes entrant dans ce processus apoptotique. Une autre étude montre qu’un taux d’estradiol élevé lié à un protocole de stimulation plus fort, peut être une des causes de la présence de certains types corrélée de vacuoles dans le cytoplasme ovocytaire, présence corrélée avec un taux de grossesse plus bas dans ce groupe [21]. L’évaluation de la qualité morphologique embryonnaire ne semble pas être un bon critère pour évaluer la qualité ovocytaire et une éventuelle influence de la stimulation sur celle-ci. En effet, d’une part la qualité embryonnaire est fonction de paramètres à la fois paternels et maternels [13], d’autre part, elle peut dans certains cas être un mauvais reflet de la compétence de l’embryon à poursuivre un développement embryonnaire. La morphologie embryonnaire n’est pas un bon témoin du statut chromosomique de l’embryon, ce statut étant nécessaire à un développement embryonnaire évolutif [22]. Un embryon aneuploïde peut, dans certains cas, présenter une morphologie qui semble normale au moins jusqu’au troisième jour après la fécondation chez l’homme. 4.2.2. Aspect chromosomique De la qualité chromosomique des gamètes dépendra le développement embryonnaire évolutif ; le taux d’avortement spontané étant principalement liés à des anomalies chromosomiques [23–25]. Même si l’âge de la patiente influence de manière prépondérante le taux d’anomalie chromosomique des ovocytes, il est important de savoir si la stimulation ovarienne peut, elle aussi, augmenter le risque de mal ségrégation méiotique ovocytaire. Bien que le mécanisme des aneuploïdies
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de l’ovocyte soit encore assez mal compris aujourd’hui, l’augmentation d’aneuploïdie dans les ovocytes plus âgés pourrait être liée à un asynchronisme de maturation entre le cytoplasme et le noyau [26]. Une hypothèse pourrait être que la stimulation ovarienne, en accélérant la maturation ovocytaire, peut éventuellement augmenter le risque d’asynchronisme de maturation entre le cytoplasme et le noyau, augmentant ainsi le risque d’aneuploïdie. Des études sur la souris sont discordantes en ce qui concerne les risques de mal ségrégation méiotique en relation avec la stimulation ovarienne. Certaines études ne montrent pas de différences dans le risque de non-disjonction des chromosomes chez la souris après stimulation ou en absence de stimulation [27,28]. D’autres études montrent une augmentation des non-disjonctions chromosomiques après stimulation ovarienne [29,30]. Dans une autre étude sur la souris, le taux de nondisjonction augmente, mais seulement après plusieurs stimulations ovariennes, principalement entre deux et quatre stimulations [31]. Il a été montré que des modifications dans la régulation hormonale au moment des derniers stades de la folliculogenèse entraînent une augmentation du risque de non-disjonction chromosomique pour l’ovocyte [32], la stimulation hormonale pouvant être elle-même en cause dans cette augmentation [33]. À la suite de ces études impliquant la stimulation ovarienne dans un éventuel risque d’augmentation de l’aneuploïdie des ovocytes, il était intéressant de voir si des stimulations plus douces (ou moins agressives) pouvaient diminuer ce risque. L’utilisation des antagonistes apporte la possibilité d’une stimulation plus douce, et permettent de diminuer les effets secondaires de la stimulation, et notamment le risque d’hyperstimulation [2,34]. Les protocoles de stimulations utilisant des antagonistes de la GnRH pouvaient donc permettre d’étudier les éventuels bénéfices d’une stimulation moins agressive sur le risque d’aneuploïdie des ovocytes contenus dans les follicules ainsi stimulés. Les études directes sur les ovocytes des patientes étant difficiles, différentes études ont effectué des comparaisons sur les taux d’aneuploïdies des embryons obtenus après des protocoles longs (utilisant des agonistes de la GnRH) et des protocoles moins agressifs utilisant des antagonistes de la GnRH. Une étude randomisée [35] incluant 111 patientes de moins de 38 ans, avec un statut ovarien à j3 favorable (fondé sur la FSH et l’inhibine B) ; celui-ci permettant de diminuer le risque d’augmentation d’aneuploïdie lié à l’âge ovarien. Les partenaires de ces patientes ont des spermes avec une numération supérieure à cinq millions par millitre ce qui, là aussi, diminue, sans l’exclure complètement, le risque d’aneuploïdie de l’embryon ayant pour origine le spermatozoïde. La randomisation sépare les couples entre ceux qui reçoivent une stimulation classique par protocole long avec agoniste de la GnRH et ceux qui reçoivent une stimulation dite douce avec l’utilisation d’un antagoniste de la GnRH. Une analyse par hybridation in situ des embryons (FISH) utilisant les sondes des chromosomes 1, 7, 13, 15, 16, 18, 21, 22, X et Y permet d’analyser, d’une part, un blastomère pour 98 embryons dans le groupe agoniste et pour 96 embryons
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dans le groupe antagoniste, et d’autre part, deux blastomères pour 61 embryons dans le groupe agoniste et 47 embryons dans le groupe antagoniste. Les résultats de la FISH montrent 38 % (61/159) d’embryons normaux sur le plan chromosomique dans le groupe agoniste et 50 % (71/143) d’embryons normaux dans le groupe antagoniste. Cette différence significative semble montrer une influence du type de stimulation sur l’aneuploïdie des embryons. Dans le groupe antagoniste, le nombre d’embryons aneuploïdes est corrélé avec le nombre total d’embryons, ce qui n’est pas le cas dans le groupe agoniste. C’est-à-dire que dans le groupe antagoniste, moins il y a d’embryons dans une tentative, moins le pourcentage d’embryons aneuploïdes est élevé. D’ailleurs, dans ce groupe, la majorité des grossesses obtenues le sont avec des femmes qui ont eu moins de quatre ovocytes recueillis à la ponction. Ce n’est pas le cas dans le groupe agoniste où une faible quantité d’ovocytes recueillis n’entraîne pas une diminution du pourcentage d’aneuploïdie. Dans ce cas, cette faible quantité d’ovocytes est plutôt le témoin d’une moindre qualité ovocytaire due à cause d’ovocytes âgés. On ne note pas de différence entre les deux groupes pour le taux de fécondation et le taux de clivage. Le nombre d’embryons totaux obtenu est donc supérieur dans le groupe agoniste puisqu’il y a davantage d’ovocytes au moment de la ponction, mais le nombre d’embryons euploïdes est en définitive identique dans les deux groupes. Cette étude montre que le nombre total d’embryons obtenu n’est pas forcément un critère de qualité de la tentative d’AMP, à partir du moment où une plus grande partie de ces embryons est aneuploïde et inaptes à se développer pour donner une grossesse évolutive. Si l’on observe les résultats uniquement des embryons pour lesquels deux blastomères ont été analysés, on constate que les anomalies sont en majorité des anomalies chromosomiques de l’embryon en mosaïque, c’est-à-dire que sur les deux blastomères analysés, seul l’un des deux est porteur de l’anomalie. Ces anomalies en mosaïques ne peuvent s’expliquer que par des anomalies d’origine mitotique, ayant eu lieu après la fécondation. En effet, une anomalie chromosomique touchant l’ovocyte entraînerait des aneuploïdies de toutes les cellules de l’embryon, sauf dans les cas où il y aurait des corrections d’aneuploïdies de certaines cellules. En cas de protocole long de stimulation avec des antagonistes, il y a une mise au repos complet de l’axe hypothalamus–hypophyse–gonades, puis utilisation de plus fortes doses de FSH exogènes. Ces doses importantes de FSH exogènes permettent le recrutement d’une quantité plus importante d’ovocytes, dont certains n’auraient pas terminé leur maturation cytoplasmique (comprenant la synthèse complète des ARN messagers, y compris la polyadénylation de ces ARN) au moment de la ponction ovocytaire. Or, pendant les premiers stades du développement embryonnaire (jusqu’à j3 chez l’Homme), le métabolisme embryonnaire utilise presque uniquement les ARNm apportés par l’ovocyte. Parmi les protéines traduites à partir de ceux-ci (traduction en protéine nécessitant une polyadénylation des ARNm), certaines permettent de réguler les mécanismes mito-
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tiques des divisions embryonnaires. En cas d’immaturité cytoplasmique, ces protéines sont en quantité insuffisante et les ségrégations des chromosomes pendant les mitoses se font mal, entraînant ainsi des anomalies chromosomiques de l’embryon en mosaïque. Récemment, une relation directe a été montrée entre certains défauts moléculaires de l’ovocyte et une augmentation de l’incidence des erreurs de ségrégation mitotique chez l’embryon. En effet, chez la souris, l’inactivation d’une protéine appartenant au complexe synaptonémal (SYCP3) méiotique entraîne des anomalies pendant la méiose ovocytaire, mais également pendant les premières divisions mitotiques embryonnaires [36]. Cela peut expliquer qu’une immaturité moléculaire cytoplasmique peut entraîner un défaut de méiose avec aneuploïdie de l’ovocyte, mais également des défauts de ségrégation des chromosomes au moment des mitoses des cellules embryonnaires, et cela même si l’ovocyte à l’origine de cet embryon est euploïde. Dans cette étude [35], Baart et al. concluent que pendant un cycle naturel, un follicule dominant est sélectionné (dans l’espèce humaine) et qu’une stimulation douce se rapproche davantage du mécanisme physiologique avec la sélection de quelques follicules dominants qui ont une bonne maturité cytoplasmique. Ce, à la différence d’une stimulation avec agoniste du GnRH qui entraîne une mise au repos de l’axe hypothalamus–hypophyse–ovaires et une sélection de follicules à différents stades de maturation. La stimulation avec un protocole long recrute certainement trop de follicules, y compris des follicules contenant des ovocytes non compétents sur le plan moléculaire au moment de la ponction ovocytaire, et qui ne permettent pas une bonne prise en charge des premières mitoses embryonnaires. Le nombre d’ovocytes ponctionnés et le nombre d’embryons obtenus doivent rester un critère relatif de qualité de la tentative d’AMP dans la mesure où certains de ces embryons peuvent être aneuploïdes donc inaptes à un développement embryonnaire. Le critère de qualité à retenir devrait être le nombre d’embryons euploïdes obtenu. Les études comparant protocole avec agonistes et ceux avec antagonistes doivent également tenir compte de l’effet direct éventuel de ces deux molécules sur l’ovaire. Or, on sait que chez certaines femmes, existent des récepteurs aux agonistes dans l’ovaire, ce qui peut entraîner des modifications physiologiques de celui-ci. Le passage chez ces patientes de l’agoniste à l’antagoniste augmente ainsi le taux d’obtention de blastocystes et le taux de grossesse [37]. Cela étant, l’aneuploïdie d’un embryon ne dépend pas seulement du statut chromosomique de l’ovocyte, mais aussi de celui du spermatozoïde. Or, dans une population de couples infertiles, même lorsque l’indication principale semble être féminine, on ne peut pas exclure l’existence d’une augmentation des anomalies chromosomiques au niveau des gamètes mâles, et ce même si les paramètres du spermogramme semblent normaux. Plusieurs études montrent que des échecs de développement embryonnaire précoce et des échecs d’implantation peuvent être liés à des augmentations du taux d’aneuploïdie des spermatozoïdes [38,39].
Dans ces conditions, la seule solution pour connaître l’effet direct éventuel de la stimulation sur la qualité chromosomique de l’ovocyte est de faire une analyse de celui-ci. Cette technique invasive existe et est proposée par certaines équipes pour analyser la contribution chromosomique maternelle à des échecs d’implantation et de développement embryonnaire. La technique consiste à prélever le premier globule polaire et à l’analyser par hybridation in situ en fluorescence (FISH) en utilisant des sondes spécifiques de plusieurs chromosomes afin d’évaluer le statut chromosomique de l’ovocyte au moment de la ponction (donc au stade de métaphase II) et de transférer uniquement les embryons provenant des ovocytes euploïdes. Cette technique de diagnostic préconceptionnel (DPC), même si elle ne permet pas d’analyser toutes les causes d’aneuploïdie d’un embryon, comme nous l’avons vu précédemment, permet d’analyser l’ovocyte en métaphase II qui a reçu l’ensemble du traitement de stimulation ovocytaire. À ce stade de métaphase II, l’aneuploïdie de l’ovocyte peut avoir deux causes ; soit un phénomène de non-disjonction des chromosomes au moment de la première division méiotique avec formation du premier globule polaire, soit un phénomène de séparation prématurée des chromatides sœurs qui a normalement lieu au moment de la deuxième division méiotique, c’est-à-dire pour l’ovocyte au moment de la fécondation entraînant la formation du deuxième globule polaire. L’équipe de J. Selva, à Poissy, qui réalise ce diagnostic préconceptionnel, a recherché dans une étude non encore publiée, s’il pouvait y avoir un marqueur d’aneuploïdie de l’ovocyte dans le fluide folliculaire. Cette étude a été réalisée chez des femmes de plus de 36 ans avec comme indication des échecs d’implantation (plus de dix embryons transférés sans grossesse). Dans chaque liquide folliculaire ponctionné indépendamment, ont été dosés les marqueurs suivants : FSH, LH, progestérone, estradiol et AMH. Pour les quatre derniers marqueurs, il n’y avait aucune corrélation entre leurs taux dans le fluide folliculaire et l’aneuploïdie de l’ovocyte contenu dans ce même follicule. En revanche, le taux de FSH est significativement augmenté dans les liquides folliculaires qui contiennent des ovocytes aneuploïdes, l’augmentation étant même corrélée au nombre d’anomalies chromosomiques de l’ovocyte. Ces anomalies ont principalement pour cause une séparation prématurée des chromatides sœurs. Cette étude semble confirmer le fait que la FSH influence la configuration du fuseau méiotique [40] et que des valeurs élevées de FSH in vitro augmentent le risque d’aneuploïdie [41]. Ces études, si elles sont confirmées, montreraient une relation directe entre le taux de FSH dans le liquide folliculaire et le risque d’aneuploïdie de l’ovocyte et pourraient expliquer, au moins en partie, les résultats trouvés dans l’étude de Baart citée plus haut sur la stimulation douce (mild stimulation). On ne peut toutefois pas exclure que ces données puissent être liées, au moins en partie, au statut ovarien de ces femmes de plus de 36 ans qui présentent des échecs d’implantation embryonnaire. La seule solution pour répondre clairement à cette question serait de faire une étude randomisée sur des ovocytes de femmes jeunes en AMP, ce qui est bien sûr impossible pour des raisons éthiques,
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puisque dans ce cas, l’indication de diagnostic préconceptionnel ne se pose pas. Il faudrait également définir un seuil de FSH intrafolliculaire au-delà duquel le risque d’aneuploïdie peut augmenter. Cela étant, un taux trop faible de FSH intrafolliculaire peut entraîner une insuffisance de quantité d’estradiol, or l’estradiol a été montré chez la brebis comme augmentant la synthèse des enzymes de réparation de l’ADN et de manière dose-dépendante ; l’efficacité de ces enzymes étant fondamentale pour le développement embryonnaire précoce [42]. 4.2.3. Aspect épigénétique Plusieurs auteurs ont récemment décrit la possibilité d’une relation entre les procédures d’AMP et la naissance d’enfants atteints de pathologies liées à des dysfonctionnements de l’empreinte génomique [43–46]. Les phénomènes d’empreintes sont liés à des mécanismes de méthylation et de déméthylation de l’ADN, et de nombreux gènes soumis à empreinte ont un rôle dans le développement embryonnaire. L’empreinte génomique est fortement remaniée pendant la gamétogenèse et d’une manière assez différente dans le temps entre les gamétogenèses mâles et femelles. Dans le cas de l’ovogenèse, les mécanismes de modifications de l’empreinte de certains gènes (IGF2R, SNRPN, PEG1, PEG3) sont effectués au moment où l’ovocyte est arrêté en prophase I et pendant la transition entre le follicule primordial et le follicule antral [47]. Même si cette étude a été réalisée chez la souris, les mécanismes de mise en place de l’empreinte génomique semblent très conservés chez l’homme comme le montre l’analyse de la méthylation du gène SNRPN [48]. Ces phénomènes ont donc lieu dans une période de croissance ovocytaire. Il est donc justifié de se poser la question d’un éventuel retentissement d’une superovulation sur les mécanismes d’empreinte génomique [49]. Une étude récente [50] analyse la méthylation de quatre gènes soumis à empreinte sur des ovocytes obtenus par stimulation ovocytaire chez la souris et chez la femme. Trois gènes soumis à empreinte maternelle (PEG1, LIT1 et ZAC) et un gène soumis à empreinte paternelle (H19) sont analysés aux différents stades ovocytaires ; dans l’ovaire néonatal chez la souris et dans l’ovaire adulte soit après ovulation naturelle, soit après stimulation ovarienne. Il existe des régions de méthylation différentielles (DMR) qui sont non méthylées dans les ovocytes d’ovaires néonatals, puis qui acquièrent la méthylation pour les gènes soumis à empreinte maternelle pendant la maturation folliculaire, mais qui restent non méthylées pour les gènes soumis à empreinte paternelle quel que soit le stade de l’ovocyte. Pendant les différents stades de maturation ovocytaire, il y a donc un changement d’expression de gènes, dont certains (comme DNMT3 qui synthétisent l’ADN méthyle transférase) sont nécessaires à l’établissement de l’empreinte génomique [51]. L’étude de Sato et al. [50] montre qu’en cas de stimulation ovocytaire, il y a un gain de méthylation de H19 et une perte de méthylation de PEG1, cela par rapport à une absence de stimulation. La stimulation ovocytaire pourrait donc être res-
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ponsable de modification des phénomènes de mise en place de l’empreinte génomique pendant l’ovogenèse. Il n’y a pas de preuve formelle que ces modifications du profil de méthylation pendant la stimulation ovarienne soient la conséquence de celle-ci ou plutôt liées à l’âge de patiente, voire peut-être même inversement la cause de l’infertilité. L’étude de Sato et al. conclut également que la question se pose en ce qui concerne les ovocytes immatures (vésicules germinatives et ovocytes I) qui sont utilisés en maturation in vitro et pour lesquels l’empreinte génomique n’est pas complètement mise en place. Ces études devront être complétées afin de préciser quel peut être le retentissement de la stimulation ovarienne sur les phénomènes d’empreintes génomiques et les risques éventuels associés à ces modifications. Ces différentes notions sont en faveur d’une influence de la stimulation sur la qualité de l’ovocyte, même si celle-ci est déjà fortement liée à des caractéristiques dépendantes de l’âge de la patiente ou de son statut ovarien. L’avenir de la stimulation ovarienne est peut-être dans une prise en charge des patientes par une stimulation à la carte en fonction de la patiente, en intégrant les notions de pharmacogénomique en rapport avec le profil de réceptivité de chaque patiente à un traitement. Il est effectivement possible, voire souhaitable, de faire une stimulation douce chez une femme qui possède une bonne fonction ovarienne. Ce n’est pas le cas chez une patiente dite mauvaise répondeuse, chez qui une stimulation avec des fortes doses de FSH est nécessaire pour obtenir la croissance de quelques follicules et quelques ovocytes qui sont malheureusement en majorité de mauvaise qualité. Il est néanmoins probable que les fortes doses, nécessaires à l’obtention d’un nombre suffisant de follicules à ponctionner dans ces situations, n’améliorent pas la qualité des ovocytes de ces femmes, raison pour laquelle certaines équipes reviennent dans ces situations vers des cycles spontanés. Des essais d’amélioration de la qualité ovocytaire ont aussi été faits avec un certain succès, par exemple avec l’utilisation de la GH (growth hormone), de manière à améliorer les taux de grossesse chez des patientes présentant des ovocytes dysmorphiques ou chez des patientes de plus de 40 ans [52]. Peut-être sera-t-il possible à l’avenir d’avoir à notre disposition des molécules nous permettant d’améliorer la qualité ovocytaire, sur le plan moléculaire, au moment d’une stimulation ou du moins de diminuer les effets nocifs de cette stimulation sur les ovocytes ? 5. Conclusion Même si la qualité ovocytaire est déjà en grande partie prédéterminée par le statut ovarien de la patiente, il est certain que la stimulation ovarienne a des conséquences sur cette qualité. Les différentes études dont nous avons parlé sont en faveur d’une influence du type de stimulation (plus ou moins forte) sur le statut chromosomique de l’ovocyte confirmé par le taux d’aneuploïdie plus faible des embryons obtenus après une stimulation plus douce. Même s’il n’y a pas encore de preuve certaine, il est également probable que les stimulations
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ovariennes puissent avoir des conséquences sur le profil épigénétique de l’ovocyte. La notion de qualité d’une tentative d’AMP ne doit pas prendre en compte le nombre total d’ovocytes et d’embryons obtenus, mais le nombre d’ovocytes donnant des embryons aptes à s’implanter, à permettre une grossesse évolutive et la naissance d’enfants bien portants. Ces types d’ovocytes et d’embryons ne sont pas facilement différenciables des autres, mais le fait de stimuler moins, en plus du fait de diminuer les risques d’hyperstimulation de la femme, semble être le garant pour en obtenir un pourcentage plus important. Les possibilités de recherche sur l’embryon, données par la Loi de bioéthique du 6 août 2004, permettront certainement aussi de répondre de manière plus scientifique à ces différentes questions, pour le bien des enfants qui seront issus de l’Assistance médicale à la procréation. Références [1] [2] [3] [4] [5]
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Douzièmes Journées nationales de la FFER (Amiens, 3–5 octobre 2007)
Effets de la stimulation sur la qualité ovocytaire Consequences of stimulation on oocyte quality P. Clément Unité de génétique et reproduction, laboratoire Clément, 8, avenue Henri-Barbusse, 93150 Le-Blanc-Mesnil, France Reçu le 2 juin 2007 ; accepté le 29 juin 2007 Disponible sur internet le 05 septembre 2007
Résumé En Assistance médicale à la procréation, les stimulations ovariennes présentent le risque d’hyperstimulation. Des approches de stimulations moins agressives sont proposées de façon à diminuer ce risque. La question se pose de savoir quelles sont les conséquences du type de stimulation sur la qualité ovocytaire, élément fondamental d’un développement embryonnaire précoce de qualité. La qualité ovocytaire peut être évaluée par différentes techniques directes ou indirectes, plus ou moins subjectives. Plusieurs études semblent montrer que la stimulation a une influence sur la qualité ovocytaire, notamment au niveau chromosomique, voire épigénétique. Il semble que des stimulations moins fortes (par exemple avec des protocoles antagonistes) sélectionnent certainement moins d’ovocytes, mais que ceux-ci sont en majorité de meilleure qualité et plus aptes à donner des embryons euploïdes permettant une grossesse évolutive. © 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Abstract In all IVF programs, ovarian stimulation may lead to a hyperstimulation syndrome. Mild ovarian stimulations are suggested to reduce this complication of infertility treatment. In this article, we wonder what the consequences of different stimulations are on oocytes quality. The quality of the oocyte being the major factor of the development of a good embryo, it can be evaluated by direct or indirect techniques. Some are subjective. Several studies seem to show that ovarian stimulation has an influence on oocye quality, especially at a chromosomic and perharps, epigenetic level. It seems that a mild stimulation (for example with GnRH antagonist) selects less oocytes but with a better quality and produces euploid embryos. The uterine transfer of this kind of embryo should lead to an ongoing pregnancy. © 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Assistance médicale à la procréation (AMP) ; Stimulation ovarienne ; Qualité ovocytaire ; Aneuploïdie ovocytaire et embryonnaire ; Épigenèse Keywords: Assisted reproductive techniques (ART); Ovarian stimulation; Oocyte quality; Oocyte and embryo aneuploidy; Epigenesis
1. Introduction Depuis plus de 20 ans et les débuts de la fécondation in vitro, différents protocoles sont utilisés en Assistance médicale à la procréation (AMP) pour traiter les patientes et obtenir une quantité suffisamment importante d’ovocytes, afin d’augmenter le nombre d’embryons, et ainsi les chances de grossesse. Ces protocoles de superovulation qui permettent de dépasser largement les processus physiologiques sont discutés depuis plusieurs années en raison des effets secondaires qu’ils peuvent
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entraîner, principalement le risque d’hyperstimulation [1]. Le critère de quantité d’ovocytes obtenu, qui était dans un premier temps considéré comme positif, a peu à peu laissé la place à la notion de qualité ovocytaire. À partir de ce critère, des réflexions sur le type de stimulation plus ou moins forte à utiliser en AMP se sont développées. À ce titre, l’arrivée des molécules antagonistes de la GnRH a permis d’avoir une nouvelle approche sur des protocoles de stimulations moins agressifs [2]. Un des critères majeurs, permettant de savoir si tel type de stimulation est bénéfique ou délétère pour l’ensemble du processus d’AMP, concerne la qualité ovocytaire, garante en partie de celle du développement embryonnaire et des chances d’obtenir une grossesse évolutive.
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2. Physiologie de la croissance ovocytaire La croissance et le développement ovocytaire sont intimement liés à la croissance folliculaire. L’initiation de la croissance folliculaire ne dépend pas des gonadotrophines, mais de facteurs locaux comme le SCF et son récepteur cKit, et le TGFbêta2. La croissance du follicule basal est également peu dépendante des gonadotrophines, mais de facteurs locaux comme, par exemple, le produit du gène GDF9. Chez une femme jeune, à chaque cycle, entre 10 et 30 ovocytes sont recrutés [3]. C’est uniquement à partir d’un certain stade de la croissance folliculaire, au moment où apparaissent des récepteurs aux gonadotrophines sur les cellules folliculaires, qu’intervient la FSH. Cette action commence au moment du recrutement folliculaire avec une cohorte de follicules gonadodépendants qui entrent en croissance. Puis, au moment de la sélection d’un follicule dominant de manière concomitante à une diminution du taux de FSH, les autres follicules subissent une atrésie avec un processus d’apoptose des ovocytes qu’ils contiennent. En cas de traitement par une FSH exogène, ce phénomène physiologique est débordé, permettant de faire échapper la majorité de ces follicules au phénomène de sélection et de dominance. La stimulation ovarienne par les FSH exogènes intervient donc à une phase relativement tardive du développement folliculaire. Parallèlement au développement folliculaire, a lieu le développement de l’ovocyte contenu dans le follicule ; les deux processus sont intimement liés en faisant intervenir des régulations paracrine et autocrine entre les cellules folliculaires et l’ovocyte [4]. La compétence ovocytaire est régulée à différents moments de la folliculogenèse, notamment la compétence à la reprise de la méiose (l’ovocyte étant bloqué en prophase de première division méiotique), mais aussi celle à la fécondation, impliquant, entre autre, le relargage des granules corticaux, les oscillations calciques [5] ; enfin, la compétence à assurer le développement embryonnaire précoce [6]. Les études des gènes de l’ovocyte et des cellules du cumulus, et surtout de leurs niveaux d’expression (transcriptome et protéome) sont informatives pour connaître la dépendance entre folliculogenèse et ovogenèse aux différents stades des croissances folliculaire et ovocytaire [7,8]. Les traitements de stimulations en AMP interviennent à un stade de l’ovogenèse où la qualité ovocytaire est déjà prédéterminée chez la patiente. Cette qualité ovocytaire peut être explorée de manière indirecte par le statut ovarien de la patiente grâce au bilan hormonal et échographique au troisième jour du cycle. Chez des patientes dites mauvaises répondeuses, les traitements de stimulation ovarienne n’amélioreront pas la qualité ovocytaire, même s’ils permettent d’obtenir un nombre plus ou moins satisfaisant d’ovocytes au moment de la ponction. Ces traitements, qui permettent de dépasser les phénomènes physiologiques, même s’ils interviennent assez tard dans la folliculogenèse, sont concomitants à des phénomènes métaboliques intenses au niveau des cellules folliculaires, des ovocytes et à des relations entre ces deux compartiments cellulaires. Ces
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modifications métaboliques seront fondamentales pour la suite de la croissance ovocytaire, la fécondation et le début du développement embryonnaire. Il est effectivement clairement défini que des éléments aussi importants que la modification de structure de la chromatine, la transcription (synthèse d’ARN messagers), la mise en place de l’empreinte parentale, la production de GSH, la phosphorylation des centrosomes, le réarrangement des microtubules, la compétence à la reprise de la méiose, la capacité aux oscillations calciques etc. sont acquis pendant les derniers stades de la maturation ovocytaire, à partir du stade de follicule antral [4]. Certains phénomènes métaboliques sont même très tardifs, comme par exemple la synthèse de glutathion qui servira à décondenser l’ADN du spermatozoïde et qui est LH dépendante ; sa synthèse étant activée par le pic de LH [9,10]. Il est donc justifié de se poser la question de savoir si les traitements de stimulations utilisés en AMP et notamment à trop fortes doses, peuvent être délétères pour la qualité ovocytaire. 3. Estimation de la qualité ovocytaire L’évaluation de la qualité de l’ovocyte chez la femme est assez difficile et le plus souvent assez subjective. Différentes méthodes d’évaluation peuvent être utilisées. Soit des méthodes non invasives comme l’observation de la morphologie de l’ovocyte au microscope ou à l’aide d’un polscope permettant d’observer le fuseau méiotique. Ces observations nécessitent que les ovocytes soient dénudés, ce qui, dans la pratique de l’AMP, n’est effectué qu’en cas de fécondation in vitro avec micro-injection ou a posteriori sur des ovocytes de fécondation in vitro sans micro-injection et non fécondés. De très nombreuses études, dans la littérature, ont évalué la morphologie des ovocytes et les résultats sont souvent contradictoires, dans la mesure où les critères restent subjectifs. Une étude multicentrique a étudié plus de 1900 ovocytes et a défini 18 paramètres morphologiques permettant de définir l’ovocyte idéal sur un plan morphologique [11]. En pratique, le pourcentage d’ovocytes idéaux était très variable en fonction des équipes (5 à 60 %), ce qui prouve le caractère subjectif de cette analyse. L’évaluation peut également être réalisée avec des méthodes invasives comme par exemple la biopsie du premier globule polaire permettant d’analyser le caractère euploïde de l’ovocyte. Même si la qualité morphologique de l’ovocyte peut faire partie des critères nous permettant de connaître le potentiel de développement embryonnaire [12], ces évaluations restent malgré tout partielles, dans la mesure où elles n’évaluent pas les données moléculaires (cytoplasmiques, génétiques et épigénétiques) de l’ovocyte. La qualité essentielle d’un ovocyte n’est pas d’avoir une morphologie qui nous semble bonne, mais de permettre une prise en charge efficace de la fécondation par un spermatozoïde, et un développement embryonnaire précoce de bonne qualité. Cette donnée est fondamentale dans l’évaluation de la qualité ovocytaire puisque la fécondation, la syngamie et les premières étapes du développement embryonnaire (au
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moins jusqu’au stade de l’activation du génome embryonnaire) dépendent en grande partie des ARN messagers présents dans l’ovocyte au moment de l’ovulation [13], permettant une régulation du métabolisme embryonnaire au cours des premiers stades du développement [14]. Il existe néanmoins une transcription du zygote au stade 2 pronuclei, mais celle-ci n’intéresse que les chromosomes sexuels, et notamment le gène SRY [15]. L’activation de la transcription du génome embryonnaire de l’embryon humain se fait au stade 4 — huit cellules [16]. L’évaluation de la qualité ovocytaire peut aussi être faite par une méthode indirecte non invasive permettant de connaître la compétence ovocytaire à assurer une fécondation et un développement embryonnaire de bonne qualité. Cette méthode peut consister à suivre le développement embryonnaire (qualité morphologique embryonnaire, cinétique de développement embryonnaire, développement jusqu’au stade blastocyste) après une fécondation in vitro. Une méthode invasive comme la biopsie de blastomère (diagnostic pré-implantatoire ou DPI) peut également être une évaluation indirecte afin de connaître le statut chromosomique de l’embryon. Cette méthode a été, entre autres, utilisée pour sélectionner les embryons euploïdes à transférer chez les patientes plus âgées chez qui, une moins bonne qualité ovocytaire, entraîne une augmentation du pourcentage d’embryons aneuploïdes (pouvant aller jusqu’à 100 % chez certaines patientes) et des échecs d’AMP [17,18]. Toutefois, ces méthodes d’évaluation de la qualité ovocytaire à travers le développement embryonnaire restent également partielles puisque celui-ci dépend également de la qualité du spermatozoïde à l’origine de cet embryon et certainement aussi, en partie, des conditions de cultures embryonnaires in vitro [13]. 4. Effet de la stimulation sur la qualité ovocytaire 4.1. Types de stimulation En fonction des indications, de nombreux protocoles de stimulation sont actuellement utilisés en AMP, que nous ne pouvons pas tous décrire ici. Pour répondre à la question de l’influence de la stimulation sur la qualité ovocytaire, et ce principalement dans le cadre d’un sujet plus général posant la question de savoir s’il faut stimuler plus ou moins, il semble que deux grands types de stimulation peuvent être pris en compte. Ce sont principalement les protocoles utilisant les agonistes de la GnRH, dits protocoles longs et certains protocoles utilisant les antagonistes de la GnRH qui permettent d’avoir des stimulations ovariennes moins fortes. 4.2. Conséquences sur la qualité ovocytaire 4.2.1. Aspect morphologique Les données morphologiques ovocytaires étant relativement subjectives, peu d’études ont cherché une relation entre type de stimulation et qualité morphologique ovocytaire, l’évaluation portant davantage sur la notion de qualité morphologique embryonnaire qui est plus facile à évaluer.
Une étude montre moins d’ovocytes avec anomalies cytoplasmiques après FSH HP (14,4 %) qu’après HMG (22,4 % : p = 0,02) [19]. Une autre étude ne montre pas de différence dans le taux d’ovocytes dysmorphiques entre HMG, FSH HP et FSHrec [20]. Ces deux études ne comparaient pas des protocoles de stimulation plus ou moins forts, mais des stimulations utilisant des molécules soit urinaires, soit recombinantes. Sur le plan morphologique, le seul critère considéré comme véritablement pathogène pour un ovocyte est la présence de vacuoles au niveau du cytoplasme, certainement, dans la majorité des cas, témoin d’un processus d’entrée en apoptose de l’ovocyte. En cas de stimulation par une FSH exogène, tous les follicules recrutés ne sont pas au même stade de maturation et le manque de vascularisation de certains follicules est probablement responsable d’une hypoxie entraînant un phénomène d’apoptose des ovocytes contenus dans ces follicules. Il est possible qu’une stimulation plus forte augmente ce phénomène. La présence de vacuoles dans le cytoplasme ovocytaire doit être considérée comme un élément défavorable pour la fécondation et le développement embryonnaire précoce [12]. Dans cette même étude, Ebner ne note pas de différence du taux d’ovocytes vacuolés en fonction du protocole de stimulation (protocole agoniste long versus protocole antagoniste), ce qui pourrait laisser penser que le niveau de stimulation n’influence pas le nombre d’ovocytes entrant dans ce processus apoptotique. Une autre étude montre qu’un taux d’estradiol élevé lié à un protocole de stimulation plus fort, peut être une des causes de la présence de certains types corrélée de vacuoles dans le cytoplasme ovocytaire, présence corrélée avec un taux de grossesse plus bas dans ce groupe [21]. L’évaluation de la qualité morphologique embryonnaire ne semble pas être un bon critère pour évaluer la qualité ovocytaire et une éventuelle influence de la stimulation sur celle-ci. En effet, d’une part la qualité embryonnaire est fonction de paramètres à la fois paternels et maternels [13], d’autre part, elle peut dans certains cas être un mauvais reflet de la compétence de l’embryon à poursuivre un développement embryonnaire. La morphologie embryonnaire n’est pas un bon témoin du statut chromosomique de l’embryon, ce statut étant nécessaire à un développement embryonnaire évolutif [22]. Un embryon aneuploïde peut, dans certains cas, présenter une morphologie qui semble normale au moins jusqu’au troisième jour après la fécondation chez l’homme. 4.2.2. Aspect chromosomique De la qualité chromosomique des gamètes dépendra le développement embryonnaire évolutif ; le taux d’avortement spontané étant principalement liés à des anomalies chromosomiques [23–25]. Même si l’âge de la patiente influence de manière prépondérante le taux d’anomalie chromosomique des ovocytes, il est important de savoir si la stimulation ovarienne peut, elle aussi, augmenter le risque de mal ségrégation méiotique ovocytaire. Bien que le mécanisme des aneuploïdies
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de l’ovocyte soit encore assez mal compris aujourd’hui, l’augmentation d’aneuploïdie dans les ovocytes plus âgés pourrait être liée à un asynchronisme de maturation entre le cytoplasme et le noyau [26]. Une hypothèse pourrait être que la stimulation ovarienne, en accélérant la maturation ovocytaire, peut éventuellement augmenter le risque d’asynchronisme de maturation entre le cytoplasme et le noyau, augmentant ainsi le risque d’aneuploïdie. Des études sur la souris sont discordantes en ce qui concerne les risques de mal ségrégation méiotique en relation avec la stimulation ovarienne. Certaines études ne montrent pas de différences dans le risque de non-disjonction des chromosomes chez la souris après stimulation ou en absence de stimulation [27,28]. D’autres études montrent une augmentation des non-disjonctions chromosomiques après stimulation ovarienne [29,30]. Dans une autre étude sur la souris, le taux de nondisjonction augmente, mais seulement après plusieurs stimulations ovariennes, principalement entre deux et quatre stimulations [31]. Il a été montré que des modifications dans la régulation hormonale au moment des derniers stades de la folliculogenèse entraînent une augmentation du risque de non-disjonction chromosomique pour l’ovocyte [32], la stimulation hormonale pouvant être elle-même en cause dans cette augmentation [33]. À la suite de ces études impliquant la stimulation ovarienne dans un éventuel risque d’augmentation de l’aneuploïdie des ovocytes, il était intéressant de voir si des stimulations plus douces (ou moins agressives) pouvaient diminuer ce risque. L’utilisation des antagonistes apporte la possibilité d’une stimulation plus douce, et permettent de diminuer les effets secondaires de la stimulation, et notamment le risque d’hyperstimulation [2,34]. Les protocoles de stimulations utilisant des antagonistes de la GnRH pouvaient donc permettre d’étudier les éventuels bénéfices d’une stimulation moins agressive sur le risque d’aneuploïdie des ovocytes contenus dans les follicules ainsi stimulés. Les études directes sur les ovocytes des patientes étant difficiles, différentes études ont effectué des comparaisons sur les taux d’aneuploïdies des embryons obtenus après des protocoles longs (utilisant des agonistes de la GnRH) et des protocoles moins agressifs utilisant des antagonistes de la GnRH. Une étude randomisée [35] incluant 111 patientes de moins de 38 ans, avec un statut ovarien à j3 favorable (fondé sur la FSH et l’inhibine B) ; celui-ci permettant de diminuer le risque d’augmentation d’aneuploïdie lié à l’âge ovarien. Les partenaires de ces patientes ont des spermes avec une numération supérieure à cinq millions par millitre ce qui, là aussi, diminue, sans l’exclure complètement, le risque d’aneuploïdie de l’embryon ayant pour origine le spermatozoïde. La randomisation sépare les couples entre ceux qui reçoivent une stimulation classique par protocole long avec agoniste de la GnRH et ceux qui reçoivent une stimulation dite douce avec l’utilisation d’un antagoniste de la GnRH. Une analyse par hybridation in situ des embryons (FISH) utilisant les sondes des chromosomes 1, 7, 13, 15, 16, 18, 21, 22, X et Y permet d’analyser, d’une part, un blastomère pour 98 embryons dans le groupe agoniste et pour 96 embryons
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dans le groupe antagoniste, et d’autre part, deux blastomères pour 61 embryons dans le groupe agoniste et 47 embryons dans le groupe antagoniste. Les résultats de la FISH montrent 38 % (61/159) d’embryons normaux sur le plan chromosomique dans le groupe agoniste et 50 % (71/143) d’embryons normaux dans le groupe antagoniste. Cette différence significative semble montrer une influence du type de stimulation sur l’aneuploïdie des embryons. Dans le groupe antagoniste, le nombre d’embryons aneuploïdes est corrélé avec le nombre total d’embryons, ce qui n’est pas le cas dans le groupe agoniste. C’est-à-dire que dans le groupe antagoniste, moins il y a d’embryons dans une tentative, moins le pourcentage d’embryons aneuploïdes est élevé. D’ailleurs, dans ce groupe, la majorité des grossesses obtenues le sont avec des femmes qui ont eu moins de quatre ovocytes recueillis à la ponction. Ce n’est pas le cas dans le groupe agoniste où une faible quantité d’ovocytes recueillis n’entraîne pas une diminution du pourcentage d’aneuploïdie. Dans ce cas, cette faible quantité d’ovocytes est plutôt le témoin d’une moindre qualité ovocytaire due à cause d’ovocytes âgés. On ne note pas de différence entre les deux groupes pour le taux de fécondation et le taux de clivage. Le nombre d’embryons totaux obtenu est donc supérieur dans le groupe agoniste puisqu’il y a davantage d’ovocytes au moment de la ponction, mais le nombre d’embryons euploïdes est en définitive identique dans les deux groupes. Cette étude montre que le nombre total d’embryons obtenu n’est pas forcément un critère de qualité de la tentative d’AMP, à partir du moment où une plus grande partie de ces embryons est aneuploïde et inaptes à se développer pour donner une grossesse évolutive. Si l’on observe les résultats uniquement des embryons pour lesquels deux blastomères ont été analysés, on constate que les anomalies sont en majorité des anomalies chromosomiques de l’embryon en mosaïque, c’est-à-dire que sur les deux blastomères analysés, seul l’un des deux est porteur de l’anomalie. Ces anomalies en mosaïques ne peuvent s’expliquer que par des anomalies d’origine mitotique, ayant eu lieu après la fécondation. En effet, une anomalie chromosomique touchant l’ovocyte entraînerait des aneuploïdies de toutes les cellules de l’embryon, sauf dans les cas où il y aurait des corrections d’aneuploïdies de certaines cellules. En cas de protocole long de stimulation avec des antagonistes, il y a une mise au repos complet de l’axe hypothalamus–hypophyse–gonades, puis utilisation de plus fortes doses de FSH exogènes. Ces doses importantes de FSH exogènes permettent le recrutement d’une quantité plus importante d’ovocytes, dont certains n’auraient pas terminé leur maturation cytoplasmique (comprenant la synthèse complète des ARN messagers, y compris la polyadénylation de ces ARN) au moment de la ponction ovocytaire. Or, pendant les premiers stades du développement embryonnaire (jusqu’à j3 chez l’Homme), le métabolisme embryonnaire utilise presque uniquement les ARNm apportés par l’ovocyte. Parmi les protéines traduites à partir de ceux-ci (traduction en protéine nécessitant une polyadénylation des ARNm), certaines permettent de réguler les mécanismes mito-
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tiques des divisions embryonnaires. En cas d’immaturité cytoplasmique, ces protéines sont en quantité insuffisante et les ségrégations des chromosomes pendant les mitoses se font mal, entraînant ainsi des anomalies chromosomiques de l’embryon en mosaïque. Récemment, une relation directe a été montrée entre certains défauts moléculaires de l’ovocyte et une augmentation de l’incidence des erreurs de ségrégation mitotique chez l’embryon. En effet, chez la souris, l’inactivation d’une protéine appartenant au complexe synaptonémal (SYCP3) méiotique entraîne des anomalies pendant la méiose ovocytaire, mais également pendant les premières divisions mitotiques embryonnaires [36]. Cela peut expliquer qu’une immaturité moléculaire cytoplasmique peut entraîner un défaut de méiose avec aneuploïdie de l’ovocyte, mais également des défauts de ségrégation des chromosomes au moment des mitoses des cellules embryonnaires, et cela même si l’ovocyte à l’origine de cet embryon est euploïde. Dans cette étude [35], Baart et al. concluent que pendant un cycle naturel, un follicule dominant est sélectionné (dans l’espèce humaine) et qu’une stimulation douce se rapproche davantage du mécanisme physiologique avec la sélection de quelques follicules dominants qui ont une bonne maturité cytoplasmique. Ce, à la différence d’une stimulation avec agoniste du GnRH qui entraîne une mise au repos de l’axe hypothalamus–hypophyse–ovaires et une sélection de follicules à différents stades de maturation. La stimulation avec un protocole long recrute certainement trop de follicules, y compris des follicules contenant des ovocytes non compétents sur le plan moléculaire au moment de la ponction ovocytaire, et qui ne permettent pas une bonne prise en charge des premières mitoses embryonnaires. Le nombre d’ovocytes ponctionnés et le nombre d’embryons obtenus doivent rester un critère relatif de qualité de la tentative d’AMP dans la mesure où certains de ces embryons peuvent être aneuploïdes donc inaptes à un développement embryonnaire. Le critère de qualité à retenir devrait être le nombre d’embryons euploïdes obtenu. Les études comparant protocole avec agonistes et ceux avec antagonistes doivent également tenir compte de l’effet direct éventuel de ces deux molécules sur l’ovaire. Or, on sait que chez certaines femmes, existent des récepteurs aux agonistes dans l’ovaire, ce qui peut entraîner des modifications physiologiques de celui-ci. Le passage chez ces patientes de l’agoniste à l’antagoniste augmente ainsi le taux d’obtention de blastocystes et le taux de grossesse [37]. Cela étant, l’aneuploïdie d’un embryon ne dépend pas seulement du statut chromosomique de l’ovocyte, mais aussi de celui du spermatozoïde. Or, dans une population de couples infertiles, même lorsque l’indication principale semble être féminine, on ne peut pas exclure l’existence d’une augmentation des anomalies chromosomiques au niveau des gamètes mâles, et ce même si les paramètres du spermogramme semblent normaux. Plusieurs études montrent que des échecs de développement embryonnaire précoce et des échecs d’implantation peuvent être liés à des augmentations du taux d’aneuploïdie des spermatozoïdes [38,39].
Dans ces conditions, la seule solution pour connaître l’effet direct éventuel de la stimulation sur la qualité chromosomique de l’ovocyte est de faire une analyse de celui-ci. Cette technique invasive existe et est proposée par certaines équipes pour analyser la contribution chromosomique maternelle à des échecs d’implantation et de développement embryonnaire. La technique consiste à prélever le premier globule polaire et à l’analyser par hybridation in situ en fluorescence (FISH) en utilisant des sondes spécifiques de plusieurs chromosomes afin d’évaluer le statut chromosomique de l’ovocyte au moment de la ponction (donc au stade de métaphase II) et de transférer uniquement les embryons provenant des ovocytes euploïdes. Cette technique de diagnostic préconceptionnel (DPC), même si elle ne permet pas d’analyser toutes les causes d’aneuploïdie d’un embryon, comme nous l’avons vu précédemment, permet d’analyser l’ovocyte en métaphase II qui a reçu l’ensemble du traitement de stimulation ovocytaire. À ce stade de métaphase II, l’aneuploïdie de l’ovocyte peut avoir deux causes ; soit un phénomène de non-disjonction des chromosomes au moment de la première division méiotique avec formation du premier globule polaire, soit un phénomène de séparation prématurée des chromatides sœurs qui a normalement lieu au moment de la deuxième division méiotique, c’est-à-dire pour l’ovocyte au moment de la fécondation entraînant la formation du deuxième globule polaire. L’équipe de J. Selva, à Poissy, qui réalise ce diagnostic préconceptionnel, a recherché dans une étude non encore publiée, s’il pouvait y avoir un marqueur d’aneuploïdie de l’ovocyte dans le fluide folliculaire. Cette étude a été réalisée chez des femmes de plus de 36 ans avec comme indication des échecs d’implantation (plus de dix embryons transférés sans grossesse). Dans chaque liquide folliculaire ponctionné indépendamment, ont été dosés les marqueurs suivants : FSH, LH, progestérone, estradiol et AMH. Pour les quatre derniers marqueurs, il n’y avait aucune corrélation entre leurs taux dans le fluide folliculaire et l’aneuploïdie de l’ovocyte contenu dans ce même follicule. En revanche, le taux de FSH est significativement augmenté dans les liquides folliculaires qui contiennent des ovocytes aneuploïdes, l’augmentation étant même corrélée au nombre d’anomalies chromosomiques de l’ovocyte. Ces anomalies ont principalement pour cause une séparation prématurée des chromatides sœurs. Cette étude semble confirmer le fait que la FSH influence la configuration du fuseau méiotique [40] et que des valeurs élevées de FSH in vitro augmentent le risque d’aneuploïdie [41]. Ces études, si elles sont confirmées, montreraient une relation directe entre le taux de FSH dans le liquide folliculaire et le risque d’aneuploïdie de l’ovocyte et pourraient expliquer, au moins en partie, les résultats trouvés dans l’étude de Baart citée plus haut sur la stimulation douce (mild stimulation). On ne peut toutefois pas exclure que ces données puissent être liées, au moins en partie, au statut ovarien de ces femmes de plus de 36 ans qui présentent des échecs d’implantation embryonnaire. La seule solution pour répondre clairement à cette question serait de faire une étude randomisée sur des ovocytes de femmes jeunes en AMP, ce qui est bien sûr impossible pour des raisons éthiques,
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puisque dans ce cas, l’indication de diagnostic préconceptionnel ne se pose pas. Il faudrait également définir un seuil de FSH intrafolliculaire au-delà duquel le risque d’aneuploïdie peut augmenter. Cela étant, un taux trop faible de FSH intrafolliculaire peut entraîner une insuffisance de quantité d’estradiol, or l’estradiol a été montré chez la brebis comme augmentant la synthèse des enzymes de réparation de l’ADN et de manière dose-dépendante ; l’efficacité de ces enzymes étant fondamentale pour le développement embryonnaire précoce [42]. 4.2.3. Aspect épigénétique Plusieurs auteurs ont récemment décrit la possibilité d’une relation entre les procédures d’AMP et la naissance d’enfants atteints de pathologies liées à des dysfonctionnements de l’empreinte génomique [43–46]. Les phénomènes d’empreintes sont liés à des mécanismes de méthylation et de déméthylation de l’ADN, et de nombreux gènes soumis à empreinte ont un rôle dans le développement embryonnaire. L’empreinte génomique est fortement remaniée pendant la gamétogenèse et d’une manière assez différente dans le temps entre les gamétogenèses mâles et femelles. Dans le cas de l’ovogenèse, les mécanismes de modifications de l’empreinte de certains gènes (IGF2R, SNRPN, PEG1, PEG3) sont effectués au moment où l’ovocyte est arrêté en prophase I et pendant la transition entre le follicule primordial et le follicule antral [47]. Même si cette étude a été réalisée chez la souris, les mécanismes de mise en place de l’empreinte génomique semblent très conservés chez l’homme comme le montre l’analyse de la méthylation du gène SNRPN [48]. Ces phénomènes ont donc lieu dans une période de croissance ovocytaire. Il est donc justifié de se poser la question d’un éventuel retentissement d’une superovulation sur les mécanismes d’empreinte génomique [49]. Une étude récente [50] analyse la méthylation de quatre gènes soumis à empreinte sur des ovocytes obtenus par stimulation ovocytaire chez la souris et chez la femme. Trois gènes soumis à empreinte maternelle (PEG1, LIT1 et ZAC) et un gène soumis à empreinte paternelle (H19) sont analysés aux différents stades ovocytaires ; dans l’ovaire néonatal chez la souris et dans l’ovaire adulte soit après ovulation naturelle, soit après stimulation ovarienne. Il existe des régions de méthylation différentielles (DMR) qui sont non méthylées dans les ovocytes d’ovaires néonatals, puis qui acquièrent la méthylation pour les gènes soumis à empreinte maternelle pendant la maturation folliculaire, mais qui restent non méthylées pour les gènes soumis à empreinte paternelle quel que soit le stade de l’ovocyte. Pendant les différents stades de maturation ovocytaire, il y a donc un changement d’expression de gènes, dont certains (comme DNMT3 qui synthétisent l’ADN méthyle transférase) sont nécessaires à l’établissement de l’empreinte génomique [51]. L’étude de Sato et al. [50] montre qu’en cas de stimulation ovocytaire, il y a un gain de méthylation de H19 et une perte de méthylation de PEG1, cela par rapport à une absence de stimulation. La stimulation ovocytaire pourrait donc être res-
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ponsable de modification des phénomènes de mise en place de l’empreinte génomique pendant l’ovogenèse. Il n’y a pas de preuve formelle que ces modifications du profil de méthylation pendant la stimulation ovarienne soient la conséquence de celle-ci ou plutôt liées à l’âge de patiente, voire peut-être même inversement la cause de l’infertilité. L’étude de Sato et al. conclut également que la question se pose en ce qui concerne les ovocytes immatures (vésicules germinatives et ovocytes I) qui sont utilisés en maturation in vitro et pour lesquels l’empreinte génomique n’est pas complètement mise en place. Ces études devront être complétées afin de préciser quel peut être le retentissement de la stimulation ovarienne sur les phénomènes d’empreintes génomiques et les risques éventuels associés à ces modifications. Ces différentes notions sont en faveur d’une influence de la stimulation sur la qualité de l’ovocyte, même si celle-ci est déjà fortement liée à des caractéristiques dépendantes de l’âge de la patiente ou de son statut ovarien. L’avenir de la stimulation ovarienne est peut-être dans une prise en charge des patientes par une stimulation à la carte en fonction de la patiente, en intégrant les notions de pharmacogénomique en rapport avec le profil de réceptivité de chaque patiente à un traitement. Il est effectivement possible, voire souhaitable, de faire une stimulation douce chez une femme qui possède une bonne fonction ovarienne. Ce n’est pas le cas chez une patiente dite mauvaise répondeuse, chez qui une stimulation avec des fortes doses de FSH est nécessaire pour obtenir la croissance de quelques follicules et quelques ovocytes qui sont malheureusement en majorité de mauvaise qualité. Il est néanmoins probable que les fortes doses, nécessaires à l’obtention d’un nombre suffisant de follicules à ponctionner dans ces situations, n’améliorent pas la qualité des ovocytes de ces femmes, raison pour laquelle certaines équipes reviennent dans ces situations vers des cycles spontanés. Des essais d’amélioration de la qualité ovocytaire ont aussi été faits avec un certain succès, par exemple avec l’utilisation de la GH (growth hormone), de manière à améliorer les taux de grossesse chez des patientes présentant des ovocytes dysmorphiques ou chez des patientes de plus de 40 ans [52]. Peut-être sera-t-il possible à l’avenir d’avoir à notre disposition des molécules nous permettant d’améliorer la qualité ovocytaire, sur le plan moléculaire, au moment d’une stimulation ou du moins de diminuer les effets nocifs de cette stimulation sur les ovocytes ? 5. Conclusion Même si la qualité ovocytaire est déjà en grande partie prédéterminée par le statut ovarien de la patiente, il est certain que la stimulation ovarienne a des conséquences sur cette qualité. Les différentes études dont nous avons parlé sont en faveur d’une influence du type de stimulation (plus ou moins forte) sur le statut chromosomique de l’ovocyte confirmé par le taux d’aneuploïdie plus faible des embryons obtenus après une stimulation plus douce. Même s’il n’y a pas encore de preuve certaine, il est également probable que les stimulations
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ovariennes puissent avoir des conséquences sur le profil épigénétique de l’ovocyte. La notion de qualité d’une tentative d’AMP ne doit pas prendre en compte le nombre total d’ovocytes et d’embryons obtenus, mais le nombre d’ovocytes donnant des embryons aptes à s’implanter, à permettre une grossesse évolutive et la naissance d’enfants bien portants. Ces types d’ovocytes et d’embryons ne sont pas facilement différenciables des autres, mais le fait de stimuler moins, en plus du fait de diminuer les risques d’hyperstimulation de la femme, semble être le garant pour en obtenir un pourcentage plus important. Les possibilités de recherche sur l’embryon, données par la Loi de bioéthique du 6 août 2004, permettront certainement aussi de répondre de manière plus scientifique à ces différentes questions, pour le bien des enfants qui seront issus de l’Assistance médicale à la procréation. Références [1] [2] [3] [4] [5]
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