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Gamète mâle… un spermatozoïde ou une spermatide ?
Gyne´cologie Obste´trique & Fertilite´ 40 (2012) 671–674
Disponible en ligne sur
www.sciencedirect.com
Quarante-troisie`me Journe´e the´matique de la Socie´te´ franc¸aise d’e´tude de la fertilite´ (Paris, 15 mars 2012)
Game`te maˆle. . . un spermatozoı¨de ou une spermatide ? Male gamete. . . spermatozoon or spermatid? N. Rives *, J.-P. Milazzo, B. Arkoun, A. Travers, A. Perdrix, A. Bironneau, B. Mace´ Laboratoire de biologie de la reproduction, CECOS, EA 4308 « game´togene`se et qualite´ du Game`te », IRIB, Universite´ de Rouen, CHU hoˆpitaux de Rouen, CHU Charles-Nicolle, 1, rue de Germont, 76031 Rouen cedex, France
I N F O A R T I C L E
R E´ S U M E´
Historique de l’article : Rec¸u le 30 mai 2012 Accepte´ le 14 septembre 2012 Disponible sur Internet le 25 octobre 2012
La spermatogene`se normale re´sulte d’un e´quilibre entre les processus de prolife´ration cellulaire, de diffe´renciation cellulaire et d’apoptose qui inte´ressent les cellules somatiques et les cellules germinales. Les dysfonctionnements de la spermatogene`se peuvent eˆtre la re´sultante d’anomalies acquises ou constitutionnelles des spermatogonies souches voire des cellules somatiques. Pour pallier ces dysfonctionnements, il semble ne´cessaire de mettre en place des mesures pre´ventives de pre´servation des cellules germinales souches ou substitutives pour remplacer ces cellules germinales souches, la finalite´ e´tant de pouvoir reproduire in vivo ou in vitro le processus d’e´laboration des spermatozoı¨des. Nous aborderons dans cet article les diffe´rentes strate´gies expe´rimentales permettant d’envisager l’e´laboration de spermatozoı¨des, en dehors du processus physiologique, in vivo ou in vitro. ß 2012 Elsevier Masson SAS. Tous droits re´serve´s.
Mots cle´s : Cellules germinales souches Spermatide Spermatogene`se in vivo Spermatogene`se in vitro Spermatide Spermatozoı¨des
Keywords: Germinal stem cell In vivo spermatogenesis In vitro spermatogenesis Spermatid Spermatozoon
A B S T R A C T
Normal spermatogenesis results from a balance between process of cell proliferation, cell differentiation and apoptosis that concern somatic cells and germ cells. Dysfunction of spermatogenesis may be the result of constitutional or acquired abnormalities of spermatogonia stem cells or somatic cells. To overcome these problems, it seems necessary to implement preventive measures for germ stem cell preservation or substitute measures to replace them, the objective being to replicate in vivo or in vitro the process of spermatozoa production. This article will discuss the different experimental strategies for considering the in vivo or in vitro production of spermatozoa, outside the physiological process. ß 2012 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
1. Introduction Le testicule est le sie`ge de multiples e´tapes de maturation depuis la vie embryonnaire jusqu’a` la puberte´, dont le but est de mettre en place ces deux fonctions que sont la fonction endocrine (production des androge`nes testiculaires) et la fonction exocrine repre´sente´e par la spermatogene`se. La spermatogene`se normale re´sulte d’un e´quilibre entre les processus de prolife´ration, de diffe´renciation et d’apoptose qui inte´ressent les cellules somatiques (cellules de Sertoli, cellules de Leydig et cellules pe´ritubulaires) et les cellules germinales. Ces e´ve´nements vont survenir durant le de´veloppement du testicule depuis la pe´riode embryonnaire jusqu’a` la puberte´ et vont perdurer pour les cellules germinales pendant la phase de maturite´ du testicule qui
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (N. Rives). 1297-9589/$ – see front matter ß 2012 Elsevier Masson SAS. Tous droits re´serve´s. http://dx.doi.org/10.1016/j.gyobfe.2012.09.017
correspond pour la spermatogene`se a` la phase de maintien s’e´tendant de la puberte´ a` la se´nescence [1]. Les dysfonctionnements de la spermatogene`se peuvent eˆtre la re´sultante d’anomalies acquises (exposition a` des facteurs toxiques par exemple) ou constitutionnelles (ge´ne´tiques) des spermatogonies souches voire des cellules somatiques (cellules de Sertoli, cellules de Leydig). L’exposition a` des facteurs toxiques peut intervenir durant toute la pe´riode du de´veloppement du testicule et pendant sa phase de maturite´, avec pour conse´quence e´ventuelle l’absence ou la disparition des cellules germinales souches et une infertilite´ a` l’aˆge adulte. Pour pallier ces dysfonctionnements, il semble ne´cessaire de mettre en place des mesures pre´ventives de pre´servation des cellules germinales souches ou substitutives pour remplacer ces cellules germinales souches, la finalite´ e´tant de pouvoir reproduire in vivo ou in vitro le processus d’e´laboration des spermatozoı¨des [2]. De ce fait, la pre´servation de la fertilite´ masculine constitue une question d’actualite´ en me´decine de la reproduction. Elle
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peut eˆtre propose´e dans toutes les situations ou` la fertilite´ de l’homme risque d’eˆtre pre´mature´ment alte´re´e. Elle est principalement indique´e avant la mise en route du traitement du cancer. Cependant, elle peut avoir sa place dans les atteintes primitives de la spermatogonie souche pouvant aboutir a` une spermatogene`se de´ficiente qui risque de s’interrompre pre´mature´ment. Ainsi, de nouvelles strate´gies de pre´servation de la fertilite´ masculine se mettent en place comme la conge´lation du tissu testiculaire ou la conge´lation des cellules germinales souches [3,4]. Cependant, en l’absence de spermatogonies souches, d’autres strate´gies doivent eˆtre envisage´es pour obtenir des cellules germinales souches capables de se diffe´rencier en spermatozoı¨des. Nous aborderons dans cet article les diffe´rentes strate´gies expe´rimentales permettant d’envisager l’e´laboration de spermatozoı¨des, en dehors du processus physiologique, in vivo ou in vitro. 2. Conservation des spermatogonies souches Les spermatogonies souches sont, du point de vue embryologique, issues des cellules germinales primordiales (CGP) de´rivant, elles-meˆmes, de l’e´piblaste. Apre`s colonisation des creˆtes ge´nitales, les CGP seront englobe´es par les cellules de Sertoli formant ainsi l’e´bauche des cordons se´minife`res, de´limite´s par une membrane basale. Les CGP vont alors se diffe´rencier en pre´spermatogonies encore appele´es gonocytes. Apre`s la naissance, les gonocytes se diffe´rencient en spermatogonies souches [5]. Entre la puberte´ et la se´nescence, les spermatogonies souches vont permettre la production de game`tes matures haploı¨des, les spermatozoı¨des. La diffe´renciation des cellules germinales souches en spermatozoı¨des est un processus biologique complexe regroupant trois e´tapes principales : la phase de multiplication ou prolife´ration des spermatogonies ; la me´iose qui met en jeu les spermatocytes I et II et dont la finalite´ est la production des cellules haploı¨des, les spermatides ; la spermiogene`se, phase de diffe´renciation et de maturation cellulaire des spermatides en spermatozoı¨des. La spermatogene`se a une dure´e fixe pour chacune des espe`ces mais variable d’une espe`ce a` l’autre (74 jours dans l’espe`ce humaine, 35 jours chez la souris) [6]. La re´gulation de la spermatogene`se de´passe le simple controˆle endocrinien exerce´ par l’axe hypothalomo-hypophyso-gonadique et implique un syste`me de re´gulation locale qui module les effets du syste`me endocrine. Cette re´gulation locale fait intervenir non seulement les contacts cellulaires (entre cellules de Leydig et cellules de Sertoli, entre cellules de Sertoli et cellules germinales, entre cellules germinales elles-meˆmes) mais aussi des facteurs de re´gulation a` action paracrine ou autocrine. Le testicule peut eˆtre expose´ a` des facteurs toxiques durant toute la pe´riode de son de´veloppement. Si l’exposition toxique a lieu entre la pe´riode infantile et l’aˆge adulte, le plus souvent lors de l’introduction de traitements gonadotoxiques (chimiothe´rapie, radiothe´rapie, chirurgie), la conge´lation du tissu testiculaire permettant de conserver les cellules germinales souches est un proce´de´ biologique qui permet d’envisager le pre´le`vement et la conservation de ce tissu avant l’exposition. La conge´lation du tissu testiculaire consiste a` conserver par conge´lation un ou plusieurs fragments de testicule issus d’un ou deux testicules. Cependant, cette activite´ reste confidentielle au niveau national, moins de dix centres re´alisent cette conservation de tissu testiculaire de manie`re syste´matique ainsi qu’au niveau international [4,7–9]. Le protocole de conge´lation propose´ est un protocole qui suivra une courbe de descente en tempe´rature lente et controˆle´e a` l’aide d’un appareil de conge´lation programmable [4,7–9]. La vitrification
du tissu testiculaire humain pre´pube`re a e´te´ rapporte´e de manie`re plus exceptionnelle [10]. 3. Devenir des spermatogonies souches congele´es Les spermatogonies souches de´congele´es devront subir un processus de maturation pour permettre la production de spermatozoı¨des. Ce processus de maturation pourrait se faire : in vitro par culture de spermatogonies souches isole´es ou par culture organotypique du tissu testiculaire ; in vivo par transplantation des spermatogonies souches dans les tubes se´minife`res des patients devenus ste´riles ou par greffe de fragments testiculaires [11]. 3.1. Maturation in vitro des spermatogonies souches La maturation in vitro des spermatogonies souches implique d’avoir recours a` des techniques de culture de cellules ou de tissus. Les cultures cellulaires sont re´alise´es en phase liquide ou en matrice 3 dimensions (3D) (gel d’agarose ou me´thylcelluose) [3]. Il peut s’agir d’une culture d’une suspension de cellules testiculaires, d’une fraction enrichie en spermatogonies souches ou en spermatocytes I apre`s tricellulaire. Les cultures peuvent eˆtre re´alise´es en pre´sence de cellules de Sertoli ou d’autres cellules somatiques nourricie`res. La multiplication in vitro de spermatogonies provenant de diffe´rentes espe`ces animales est actuellement possible. L’e´quipe de Kubota [12] a, par exemple, mis au point chez la souris un syste`me de culture utilisant des cellules nourricie`res (STO) et un certain nombre de facteurs de croissance (glial-cell-linederived neurotrophic factor [GDNF]), (GDNF-family receptor alpha1 [GFRalpha1]), (basic fibroblast groth factor [bFGF]) permettant de faire prolife´rer durant plus de six mois des cellules souches de la ligne´e germinale. Ces cellules apre`s culture conservent, par ailleurs, leur aptitude a` se diffe´rencier. En effet, une restauration naturelle de la fertilite´ a pu eˆtre obtenue apre`s transplantation dans les testicules de souris infertiles. Des re´sultats similaires ont e´te´ obtenus avec des cellules de rats en utilisant les meˆmes facteurs de croissance [13]. L’utilisation d’un tel syste`me de culture apparaıˆt comme tout a` fait envisageable afin de faire prolife´rer in vitro, des spermatogonies humaines. En revanche, la diffe´renciation comple`te des spermatogonies en spermatozoı¨des, en ayant recours a` des techniques de culture en phase liquide, n’a encore jamais e´te´ possible chez les mammife`res. Les meilleurs re´sultats ont pour l’instant e´te´ obtenus par culture de cellules germinales en pre´sence de cellules de Sertoli [14] ou de certains facteurs libe´re´s par celles-ci [15]. Chez la souris et le veau, une me´iose comple`te avec formation de spermatides rondes a ainsi pu eˆtre observe´e apre`s plusieurs mois de culture. Plus re´cemment, une diffe´renciation des cellules germinales pre´-me´iotiques de souris pre´pube`res en spermatides allonge´es a pu eˆtre obtenue en culture in vitro en matrice 3D (gel d’agarose ou me´thylcellulose) [3]. En revanche, chez l’homme, la plupart des essais de maturation in vitro en phase liquide n’a pas e´te´ re´alise´e a` partir de spermatogonies, mais a` partir de cellules en cours de me´iose provenant de patients adultes pre´sentant une azoospermie. Dans ces conditions un ache`vement de la me´iose et parfois une spermiogene`se partielle ont e´te´ obtenus. Certaines anomalies ont toutefois e´te´ observe´es, telle qu’une acce´le´ration de la cine´tique de diffe´renciation [16], ou bien, l’obtention d’embryons pre´sentant de nombreuses anomalies chromosomiques apre`s micro-injection de cellules germinales humaines mature´es in vitro. Enfin, une autre e´tude [17] a permis de montrer qu’il e´tait possible d’obtenir une prolife´ration et une diffe´renciation in vitro des spermatogonies humaines. Apre`s prolife´ration, les spermatogonies ont e´te´ encapsule´es avec des cellules de Sertoli des patients dans de l’alginate de calcium. Une
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me´iose comple`te a ainsi pu eˆtre obtenue avec formation de spermatides rondes. Ces cellules haploı¨des ont enfin e´te´ utilise´es en AMP. Des embryons ont e´te´ obtenus, mais pas d’implantation. Cette dernie`re e´tude apparaıˆt comme particulie`rement prometteuse, meˆme si les re´sultats demandent a` eˆtre conforte´s par des travaux similaires. Ainsi dans le cadre des e´tudes re´alise´es avec des cellules humaines des anomalies susceptibles de compromettre la qualite´ des game`tes ont e´te´ observe´es. La culture de tubes se´minife`res ou de fragments de tissu testiculaire immature peut e´galement eˆtre re´alise´e en phase liquide sur membrane poreuse ou en phase solide 3D (matrice ou gel d’agarose). Les cultures en phase liquide s’effectuent sur une courte pe´riode dans la mesure ou` ces conditions aboutissent audela` de 15 jours a` une ne´crose intense du tissu par de´faut d’oxyge´nation lie´e le plus souvent a` une impossibilite´ de controˆler l’immersion du tissu dans le milieu de culture. Cependant, ce type de culture peut conduire a` un de´but de diffe´renciation des spermatogonies chez le rat [18] et la souris [19] en spermatocytes I. La culture organotypique en phase solide de gel d’agarose a permis a` partir de tissu testiculaire de souris pre´pube`res frais ou de´congele´ d’obtenir une production de spermatozoı¨des. Les spermatozoı¨des obtenus ont e´te´ utilise´s en fe´condation in vitro par microinjection, aboutissant a` la production d’une descendance viable. En revanche, le rendement d’un tel proce´de´ reste faible et la reproductibilite´ e´galement [20]. 3.2. Maturation in vivo des cellules germinales La maturation in vivo consiste a` reproduire une spermatogene`se in vivo apre`s transplantation des spermatogonies souches dans les tubes se´minife`res ou apre`s greffe de fragments de tissu testiculaire le plus souvent pre´pube`re. La maturation in vivo peut avoir lieu chez l’individu lui-meˆme ou en utilisant un animal hoˆte (xe´no-transplantation ou xe´nogreffe). De nombreux essais de transplantations ou de xe´nogreffe ont e´te´ re´alise´s dans ce sens a` partir de tissu testiculaire pre´pube`re frais ou congele´ provenant de diffe´rentes espe`ces de mammife`res. Ces essais ont ge´ne´ralement e´te´ effectue´s sur des souris immunode´ficentes afin de pre´venir une e´ventuelle re´action immunitaire de rejet du greffon. Dans le cadre de la transplantation de cellules germinales, un enrichissement de la suspension de spermatogonies a` injecter a parfois pu eˆtre obtenu a` l’aide de techniques de tri cellulaire ou de prolife´ration cellulaire in vitro. La xe´no-transplantation des cellules germinales a, tout d’abord, permis d’obtenir d’excellents re´sultats avec obtention d’une spermatogene`se comple`te lorsque les cellules injecte´es appartenaient a` une espe`ce phyloge´ne´tiquement proche de celle de l’animal receveur. Des spermatides rondes ou allonge´es ainsi que des spermatozoı¨des ont ainsi pu eˆtre utilise´s en fe´condation in vitro par micro-injection permettant la production d’une descendance viable. La xe´no-transplantation de cellules germinales donne, en revanche, des re´sultats moins satisfaisants lorsque les cellules germinales injecte´es proviennent d’espe`ces phyloge´ne´tiquement trop e´loigne´es de celle de l’animal receveur, avec au minimum une survie des spermatogonies sans prolife´ration ou diffe´renciation pour les primates ou l’homme ou au mieux une colonisation des tubes se´minife`res associe´e uniquement a` une prolife´ration des spermatogonies sans diffe´renciation pour les autres mammife`res [21]. On peut donc supposer que les cellules de Leydig et les cellules de Sertoli des souris receveuses soient incapables d’interagir avec des spermatogonies provenant d’espe`ces phyloge´ne´tiquement trop e´loigne´es. La xe´nogreffe de fragments de tissus testiculaires pre´pube`res donne des re´sultats plus satisfaisants [21]. Ces xe´no-greffes sont re´alise´es soient en orthotopique (sur un des testicules de l’animal receveur ou bien sur le site de pre´le`vement apre`s castration),
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soient en he´te´rotopique (sur une autre partie du corps de l’animal, ge´ne´ralement au niveau du dos). Une spermatogene`se comple`te a ainsi pu eˆtre observe´e apre`s xe´no-greffe tissulaire en he´te´rotopique chez la souris de fragments de tissu testiculaire provenant de nombreuses espe`ces de mammife`res non primates. Pour certaines de ces e´tudes, les greffons ont e´te´ dissocie´s permettant de re´cupe´rer des spermatozoı¨des qui ont ensuite e´te´ utilise´s afin de tester leur pouvoir fe´condant. Des naissances ont en effet pu eˆtre obtenues apre`s micro-injection des spermatozoı¨des mature´s in vivo chez la souris. Chez les singes, des re´sultats plus contraste´s ont e´te´ observe´s selon l’espe`ce utilise´e, avec une absence de spermatogene`se chez l’ouistiti, une spermatogene`se partielle ou comple`te chez le singe macaque rhe´sus. Dans le cas de cette dernie`re e´tude, des spermatozoı¨des ont e´te´ re´cupe´re´s puis injecte´s dans des ovocytes de singe aboutissant a` des embryons jusqu’au stade de blastocyste [21]. Les essais de xe´no-greffe a` partir de pre´le`vements humains ont, tout d’abord, e´te´ re´alise´s en utilisant des fragments de tissu testiculaire provenant de patients adultes pre´sentant ou non une azoospermie. Ces premie`res e´tudes ont permis de montrer que quelques spermatogonies e´taient capables de survivre durant plusieurs mois. Toutefois, une re´gression des tubes avec fibrose de la paroi des tubes se´minife`res ainsi qu’une disparition progressive des cellules germinales ont ge´ne´ralement e´te´ observe´es [21]. De meilleurs re´sultats ont e´te´ obtenus en utilisant du tissu fœtal provenant d’avortements. En effet, quatre a` cinq mois apre`s la transplantation, une augmentation de la taille des greffons ainsi qu’une maturation des tubes avec migration des cellules germinales souches et des cellules de Sertoli vers la membrane basale, ont pu eˆtre observe´es. La diffe´rentiation des spermatogonies n’a cependant pas e´te´ obtenue [22]. Enfin, une bonne pre´servation des tubes et de la capacite´ des spermatogonies a` prolife´rer a e´galement pu eˆtre observe´e au bout de trois semaines sur des greffons provenant d’enfants pre´sentant une cryptorchidie [23]. Ainsi, la maturation in vivo de spermatogonies humaines apre`s xe´no-transplantation chez la souris n’est pas envisageable dans la mesure ou` l’homme et la souris sont phyloge´ne´tiquement trop e´loigne´s. En revanche meˆme si elle n’a pas encore e´te´ possible, la maturation in vivo apre`s xe´no-greffe de fragments de tissu testiculaire pre´pube`re pourrait permettre d’obtenir des spermatozoı¨des utilisables afin de restaurer la fertilite´ des patients. En effet, dans le cas de la xe´no-greffe tissulaire, la niche cellulaire de la cellule germinale souche est pre´serve´e. De plus, une spermatogene`se comple`te a de´ja` e´te´ possible pour de nombreuses espe`ces de mammife`res et e´galement chez un primate le singe macaque rhe´sus. 3.3. Quand les spermatogonies souches n’existent pas ou n’existent plus ! Si les cellules germinales souches subissent une exposition toxique in utero ou si le dysfonctionnement de la spermatogene`se est constitutionnel, aucune mesure pre´ventive n’est envisageable a` l’heure actuelle pour pre´server ces cellules germinales. Pour remplacer les cellules germinales souches, il semble alors ne´cessaire de pouvoir ge´ne´rer in vitro des cellules germinales souches a` partir d’autres cellules souches comme les cellules souches embryonnaires totipotentes [24], les cellules souches adultes pluripotentes/multipotentes [25] ou les cellules pluripotentes induites (iPS) obtenues par reprogrammation cellulaire le plus souvent a` partir de fibroblastes [26]. L’utilisation des cellules souches embryonnaires soule`ve de nombreuses questions e´thiques et obligerait dans le contexte d’une production de cellules germinales dont le patrimoine ge´ne´tique serait celui de l’individu de passer par une e´tape de clonage non pas reproductif mais the´rapeutique pour obtenir des
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cellules souches embryonnaires, non envisageable a` l’heure actuelle. Cependant, chez la souris, il faut noter que des spermatozoı¨des ont pu eˆtre obtenus in vitro apre`s induction des cellules embryonnaires souches par l’acide re´tinoı¨que. Les cellules haploı¨des obtenues sont capables apre`s fe´condation de conduire a` la formation de blastocystes et d’une descendance viable [24]. L’utilisation de cellules souches adultes ou la ge´ne´ration de cellules pluripotentes induites (iPS) offre des perspectives inte´ressantes. En effet, les cellules iPS humaines semblent capables in vitro de se diffe´rencier en cellules germinales primordiales (CGP) puis en cellules me´iotiques et post-me´iotiques haploı¨des exprimant l’acrosine comme cela est observe´ dans les spermatides chez l’homme. Ces re´sultats indiquent que les cellules iPS humaines de´rive´es de reprogrammation des cellules somatiques adultes peuvent former des cellules germinales [26]. 4. Conclusion Dans les processus de maturation in vitro ou in vivo des cellules germinales souches, quelle que soit l’origine de ces cellules germinales souches, il est difficile de de´finir si les cellules haploı¨des produites correspondent a` une spermatide allonge´e ou un spermatozoı¨de. La qualite´ des cellules haploı¨des produites devra eˆtre ve´rifie´e sur le plan ge´ne´tique et e´pige´ne´tique ainsi que sur la descendance obtenue. L’utilisation de tels syste`mes de maturation soule`ve ne´anmoins un certain nombre de questions a` la fois scientifiques et e´thiques. Ils peuvent cependant fournir des mode`les d’e´tude cliniques originaux sur la formation et la pathologie de la ligne´e germinale maˆle humaine avec des applications the´rapeutiques potentielles. De´claration d’inte´reˆts Les auteurs de´clarent ne pas avoir de conflits d’inte´reˆts en relation avec cet article. Re´fe´rences [1] Rey RA, Musse M, Venara M, Chemes HE. Ontogeny of the androgen receptor expression in the fetal and postnatal testis: its relevance on Sertoli cell maturation and the onset of adult spermatogenesis. Microsc Res Tech 2009;72(11):787–95. [2] Stukenborg JB, Colo´n E, So¨der O. Ontogenesis of testis development and function in humans. Sex Dev 2010;4(4–5):199–212. [3] Stukenborg JB, Schlatt S, Simoni M, Yeung CH, Elhija MA, Luetjens CM, et al. New horizons for in vitro spermatogenesis? An update on novel three-dimensional culture systems as tools for meiotic and post-meiotic differentiation of testicular germ cells. Mol Hum Reprod 2009;15(9):521–9. [4] Wyns C, Curaba M, Petit S, Vanabelle B, Laurent P, Wese JF, et al. Management of fertility preservation in prepubertal patients: 5 years’ experience at the Catholic University of Louvain. Hum Reprod 2011;26(4):737–47.
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I N F O A R T I C L E
R E´ S U M E´
Historique de l’article : Rec¸u le 30 mai 2012 Accepte´ le 14 septembre 2012 Disponible sur Internet le 25 octobre 2012
La spermatogene`se normale re´sulte d’un e´quilibre entre les processus de prolife´ration cellulaire, de diffe´renciation cellulaire et d’apoptose qui inte´ressent les cellules somatiques et les cellules germinales. Les dysfonctionnements de la spermatogene`se peuvent eˆtre la re´sultante d’anomalies acquises ou constitutionnelles des spermatogonies souches voire des cellules somatiques. Pour pallier ces dysfonctionnements, il semble ne´cessaire de mettre en place des mesures pre´ventives de pre´servation des cellules germinales souches ou substitutives pour remplacer ces cellules germinales souches, la finalite´ e´tant de pouvoir reproduire in vivo ou in vitro le processus d’e´laboration des spermatozoı¨des. Nous aborderons dans cet article les diffe´rentes strate´gies expe´rimentales permettant d’envisager l’e´laboration de spermatozoı¨des, en dehors du processus physiologique, in vivo ou in vitro. ß 2012 Elsevier Masson SAS. Tous droits re´serve´s.
Mots cle´s : Cellules germinales souches Spermatide Spermatogene`se in vivo Spermatogene`se in vitro Spermatide Spermatozoı¨des
Keywords: Germinal stem cell In vivo spermatogenesis In vitro spermatogenesis Spermatid Spermatozoon
A B S T R A C T
Normal spermatogenesis results from a balance between process of cell proliferation, cell differentiation and apoptosis that concern somatic cells and germ cells. Dysfunction of spermatogenesis may be the result of constitutional or acquired abnormalities of spermatogonia stem cells or somatic cells. To overcome these problems, it seems necessary to implement preventive measures for germ stem cell preservation or substitute measures to replace them, the objective being to replicate in vivo or in vitro the process of spermatozoa production. This article will discuss the different experimental strategies for considering the in vivo or in vitro production of spermatozoa, outside the physiological process. ß 2012 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
1. Introduction Le testicule est le sie`ge de multiples e´tapes de maturation depuis la vie embryonnaire jusqu’a` la puberte´, dont le but est de mettre en place ces deux fonctions que sont la fonction endocrine (production des androge`nes testiculaires) et la fonction exocrine repre´sente´e par la spermatogene`se. La spermatogene`se normale re´sulte d’un e´quilibre entre les processus de prolife´ration, de diffe´renciation et d’apoptose qui inte´ressent les cellules somatiques (cellules de Sertoli, cellules de Leydig et cellules pe´ritubulaires) et les cellules germinales. Ces e´ve´nements vont survenir durant le de´veloppement du testicule depuis la pe´riode embryonnaire jusqu’a` la puberte´ et vont perdurer pour les cellules germinales pendant la phase de maturite´ du testicule qui
* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (N. Rives). 1297-9589/$ – see front matter ß 2012 Elsevier Masson SAS. Tous droits re´serve´s. http://dx.doi.org/10.1016/j.gyobfe.2012.09.017
correspond pour la spermatogene`se a` la phase de maintien s’e´tendant de la puberte´ a` la se´nescence [1]. Les dysfonctionnements de la spermatogene`se peuvent eˆtre la re´sultante d’anomalies acquises (exposition a` des facteurs toxiques par exemple) ou constitutionnelles (ge´ne´tiques) des spermatogonies souches voire des cellules somatiques (cellules de Sertoli, cellules de Leydig). L’exposition a` des facteurs toxiques peut intervenir durant toute la pe´riode du de´veloppement du testicule et pendant sa phase de maturite´, avec pour conse´quence e´ventuelle l’absence ou la disparition des cellules germinales souches et une infertilite´ a` l’aˆge adulte. Pour pallier ces dysfonctionnements, il semble ne´cessaire de mettre en place des mesures pre´ventives de pre´servation des cellules germinales souches ou substitutives pour remplacer ces cellules germinales souches, la finalite´ e´tant de pouvoir reproduire in vivo ou in vitro le processus d’e´laboration des spermatozoı¨des [2]. De ce fait, la pre´servation de la fertilite´ masculine constitue une question d’actualite´ en me´decine de la reproduction. Elle
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peut eˆtre propose´e dans toutes les situations ou` la fertilite´ de l’homme risque d’eˆtre pre´mature´ment alte´re´e. Elle est principalement indique´e avant la mise en route du traitement du cancer. Cependant, elle peut avoir sa place dans les atteintes primitives de la spermatogonie souche pouvant aboutir a` une spermatogene`se de´ficiente qui risque de s’interrompre pre´mature´ment. Ainsi, de nouvelles strate´gies de pre´servation de la fertilite´ masculine se mettent en place comme la conge´lation du tissu testiculaire ou la conge´lation des cellules germinales souches [3,4]. Cependant, en l’absence de spermatogonies souches, d’autres strate´gies doivent eˆtre envisage´es pour obtenir des cellules germinales souches capables de se diffe´rencier en spermatozoı¨des. Nous aborderons dans cet article les diffe´rentes strate´gies expe´rimentales permettant d’envisager l’e´laboration de spermatozoı¨des, en dehors du processus physiologique, in vivo ou in vitro. 2. Conservation des spermatogonies souches Les spermatogonies souches sont, du point de vue embryologique, issues des cellules germinales primordiales (CGP) de´rivant, elles-meˆmes, de l’e´piblaste. Apre`s colonisation des creˆtes ge´nitales, les CGP seront englobe´es par les cellules de Sertoli formant ainsi l’e´bauche des cordons se´minife`res, de´limite´s par une membrane basale. Les CGP vont alors se diffe´rencier en pre´spermatogonies encore appele´es gonocytes. Apre`s la naissance, les gonocytes se diffe´rencient en spermatogonies souches [5]. Entre la puberte´ et la se´nescence, les spermatogonies souches vont permettre la production de game`tes matures haploı¨des, les spermatozoı¨des. La diffe´renciation des cellules germinales souches en spermatozoı¨des est un processus biologique complexe regroupant trois e´tapes principales : la phase de multiplication ou prolife´ration des spermatogonies ; la me´iose qui met en jeu les spermatocytes I et II et dont la finalite´ est la production des cellules haploı¨des, les spermatides ; la spermiogene`se, phase de diffe´renciation et de maturation cellulaire des spermatides en spermatozoı¨des. La spermatogene`se a une dure´e fixe pour chacune des espe`ces mais variable d’une espe`ce a` l’autre (74 jours dans l’espe`ce humaine, 35 jours chez la souris) [6]. La re´gulation de la spermatogene`se de´passe le simple controˆle endocrinien exerce´ par l’axe hypothalomo-hypophyso-gonadique et implique un syste`me de re´gulation locale qui module les effets du syste`me endocrine. Cette re´gulation locale fait intervenir non seulement les contacts cellulaires (entre cellules de Leydig et cellules de Sertoli, entre cellules de Sertoli et cellules germinales, entre cellules germinales elles-meˆmes) mais aussi des facteurs de re´gulation a` action paracrine ou autocrine. Le testicule peut eˆtre expose´ a` des facteurs toxiques durant toute la pe´riode de son de´veloppement. Si l’exposition toxique a lieu entre la pe´riode infantile et l’aˆge adulte, le plus souvent lors de l’introduction de traitements gonadotoxiques (chimiothe´rapie, radiothe´rapie, chirurgie), la conge´lation du tissu testiculaire permettant de conserver les cellules germinales souches est un proce´de´ biologique qui permet d’envisager le pre´le`vement et la conservation de ce tissu avant l’exposition. La conge´lation du tissu testiculaire consiste a` conserver par conge´lation un ou plusieurs fragments de testicule issus d’un ou deux testicules. Cependant, cette activite´ reste confidentielle au niveau national, moins de dix centres re´alisent cette conservation de tissu testiculaire de manie`re syste´matique ainsi qu’au niveau international [4,7–9]. Le protocole de conge´lation propose´ est un protocole qui suivra une courbe de descente en tempe´rature lente et controˆle´e a` l’aide d’un appareil de conge´lation programmable [4,7–9]. La vitrification
du tissu testiculaire humain pre´pube`re a e´te´ rapporte´e de manie`re plus exceptionnelle [10]. 3. Devenir des spermatogonies souches congele´es Les spermatogonies souches de´congele´es devront subir un processus de maturation pour permettre la production de spermatozoı¨des. Ce processus de maturation pourrait se faire : in vitro par culture de spermatogonies souches isole´es ou par culture organotypique du tissu testiculaire ; in vivo par transplantation des spermatogonies souches dans les tubes se´minife`res des patients devenus ste´riles ou par greffe de fragments testiculaires [11]. 3.1. Maturation in vitro des spermatogonies souches La maturation in vitro des spermatogonies souches implique d’avoir recours a` des techniques de culture de cellules ou de tissus. Les cultures cellulaires sont re´alise´es en phase liquide ou en matrice 3 dimensions (3D) (gel d’agarose ou me´thylcelluose) [3]. Il peut s’agir d’une culture d’une suspension de cellules testiculaires, d’une fraction enrichie en spermatogonies souches ou en spermatocytes I apre`s tricellulaire. Les cultures peuvent eˆtre re´alise´es en pre´sence de cellules de Sertoli ou d’autres cellules somatiques nourricie`res. La multiplication in vitro de spermatogonies provenant de diffe´rentes espe`ces animales est actuellement possible. L’e´quipe de Kubota [12] a, par exemple, mis au point chez la souris un syste`me de culture utilisant des cellules nourricie`res (STO) et un certain nombre de facteurs de croissance (glial-cell-linederived neurotrophic factor [GDNF]), (GDNF-family receptor alpha1 [GFRalpha1]), (basic fibroblast groth factor [bFGF]) permettant de faire prolife´rer durant plus de six mois des cellules souches de la ligne´e germinale. Ces cellules apre`s culture conservent, par ailleurs, leur aptitude a` se diffe´rencier. En effet, une restauration naturelle de la fertilite´ a pu eˆtre obtenue apre`s transplantation dans les testicules de souris infertiles. Des re´sultats similaires ont e´te´ obtenus avec des cellules de rats en utilisant les meˆmes facteurs de croissance [13]. L’utilisation d’un tel syste`me de culture apparaıˆt comme tout a` fait envisageable afin de faire prolife´rer in vitro, des spermatogonies humaines. En revanche, la diffe´renciation comple`te des spermatogonies en spermatozoı¨des, en ayant recours a` des techniques de culture en phase liquide, n’a encore jamais e´te´ possible chez les mammife`res. Les meilleurs re´sultats ont pour l’instant e´te´ obtenus par culture de cellules germinales en pre´sence de cellules de Sertoli [14] ou de certains facteurs libe´re´s par celles-ci [15]. Chez la souris et le veau, une me´iose comple`te avec formation de spermatides rondes a ainsi pu eˆtre observe´e apre`s plusieurs mois de culture. Plus re´cemment, une diffe´renciation des cellules germinales pre´-me´iotiques de souris pre´pube`res en spermatides allonge´es a pu eˆtre obtenue en culture in vitro en matrice 3D (gel d’agarose ou me´thylcellulose) [3]. En revanche, chez l’homme, la plupart des essais de maturation in vitro en phase liquide n’a pas e´te´ re´alise´e a` partir de spermatogonies, mais a` partir de cellules en cours de me´iose provenant de patients adultes pre´sentant une azoospermie. Dans ces conditions un ache`vement de la me´iose et parfois une spermiogene`se partielle ont e´te´ obtenus. Certaines anomalies ont toutefois e´te´ observe´es, telle qu’une acce´le´ration de la cine´tique de diffe´renciation [16], ou bien, l’obtention d’embryons pre´sentant de nombreuses anomalies chromosomiques apre`s micro-injection de cellules germinales humaines mature´es in vitro. Enfin, une autre e´tude [17] a permis de montrer qu’il e´tait possible d’obtenir une prolife´ration et une diffe´renciation in vitro des spermatogonies humaines. Apre`s prolife´ration, les spermatogonies ont e´te´ encapsule´es avec des cellules de Sertoli des patients dans de l’alginate de calcium. Une
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me´iose comple`te a ainsi pu eˆtre obtenue avec formation de spermatides rondes. Ces cellules haploı¨des ont enfin e´te´ utilise´es en AMP. Des embryons ont e´te´ obtenus, mais pas d’implantation. Cette dernie`re e´tude apparaıˆt comme particulie`rement prometteuse, meˆme si les re´sultats demandent a` eˆtre conforte´s par des travaux similaires. Ainsi dans le cadre des e´tudes re´alise´es avec des cellules humaines des anomalies susceptibles de compromettre la qualite´ des game`tes ont e´te´ observe´es. La culture de tubes se´minife`res ou de fragments de tissu testiculaire immature peut e´galement eˆtre re´alise´e en phase liquide sur membrane poreuse ou en phase solide 3D (matrice ou gel d’agarose). Les cultures en phase liquide s’effectuent sur une courte pe´riode dans la mesure ou` ces conditions aboutissent audela` de 15 jours a` une ne´crose intense du tissu par de´faut d’oxyge´nation lie´e le plus souvent a` une impossibilite´ de controˆler l’immersion du tissu dans le milieu de culture. Cependant, ce type de culture peut conduire a` un de´but de diffe´renciation des spermatogonies chez le rat [18] et la souris [19] en spermatocytes I. La culture organotypique en phase solide de gel d’agarose a permis a` partir de tissu testiculaire de souris pre´pube`res frais ou de´congele´ d’obtenir une production de spermatozoı¨des. Les spermatozoı¨des obtenus ont e´te´ utilise´s en fe´condation in vitro par microinjection, aboutissant a` la production d’une descendance viable. En revanche, le rendement d’un tel proce´de´ reste faible et la reproductibilite´ e´galement [20]. 3.2. Maturation in vivo des cellules germinales La maturation in vivo consiste a` reproduire une spermatogene`se in vivo apre`s transplantation des spermatogonies souches dans les tubes se´minife`res ou apre`s greffe de fragments de tissu testiculaire le plus souvent pre´pube`re. La maturation in vivo peut avoir lieu chez l’individu lui-meˆme ou en utilisant un animal hoˆte (xe´no-transplantation ou xe´nogreffe). De nombreux essais de transplantations ou de xe´nogreffe ont e´te´ re´alise´s dans ce sens a` partir de tissu testiculaire pre´pube`re frais ou congele´ provenant de diffe´rentes espe`ces de mammife`res. Ces essais ont ge´ne´ralement e´te´ effectue´s sur des souris immunode´ficentes afin de pre´venir une e´ventuelle re´action immunitaire de rejet du greffon. Dans le cadre de la transplantation de cellules germinales, un enrichissement de la suspension de spermatogonies a` injecter a parfois pu eˆtre obtenu a` l’aide de techniques de tri cellulaire ou de prolife´ration cellulaire in vitro. La xe´no-transplantation des cellules germinales a, tout d’abord, permis d’obtenir d’excellents re´sultats avec obtention d’une spermatogene`se comple`te lorsque les cellules injecte´es appartenaient a` une espe`ce phyloge´ne´tiquement proche de celle de l’animal receveur. Des spermatides rondes ou allonge´es ainsi que des spermatozoı¨des ont ainsi pu eˆtre utilise´s en fe´condation in vitro par micro-injection permettant la production d’une descendance viable. La xe´no-transplantation de cellules germinales donne, en revanche, des re´sultats moins satisfaisants lorsque les cellules germinales injecte´es proviennent d’espe`ces phyloge´ne´tiquement trop e´loigne´es de celle de l’animal receveur, avec au minimum une survie des spermatogonies sans prolife´ration ou diffe´renciation pour les primates ou l’homme ou au mieux une colonisation des tubes se´minife`res associe´e uniquement a` une prolife´ration des spermatogonies sans diffe´renciation pour les autres mammife`res [21]. On peut donc supposer que les cellules de Leydig et les cellules de Sertoli des souris receveuses soient incapables d’interagir avec des spermatogonies provenant d’espe`ces phyloge´ne´tiquement trop e´loigne´es. La xe´nogreffe de fragments de tissus testiculaires pre´pube`res donne des re´sultats plus satisfaisants [21]. Ces xe´no-greffes sont re´alise´es soient en orthotopique (sur un des testicules de l’animal receveur ou bien sur le site de pre´le`vement apre`s castration),
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soient en he´te´rotopique (sur une autre partie du corps de l’animal, ge´ne´ralement au niveau du dos). Une spermatogene`se comple`te a ainsi pu eˆtre observe´e apre`s xe´no-greffe tissulaire en he´te´rotopique chez la souris de fragments de tissu testiculaire provenant de nombreuses espe`ces de mammife`res non primates. Pour certaines de ces e´tudes, les greffons ont e´te´ dissocie´s permettant de re´cupe´rer des spermatozoı¨des qui ont ensuite e´te´ utilise´s afin de tester leur pouvoir fe´condant. Des naissances ont en effet pu eˆtre obtenues apre`s micro-injection des spermatozoı¨des mature´s in vivo chez la souris. Chez les singes, des re´sultats plus contraste´s ont e´te´ observe´s selon l’espe`ce utilise´e, avec une absence de spermatogene`se chez l’ouistiti, une spermatogene`se partielle ou comple`te chez le singe macaque rhe´sus. Dans le cas de cette dernie`re e´tude, des spermatozoı¨des ont e´te´ re´cupe´re´s puis injecte´s dans des ovocytes de singe aboutissant a` des embryons jusqu’au stade de blastocyste [21]. Les essais de xe´no-greffe a` partir de pre´le`vements humains ont, tout d’abord, e´te´ re´alise´s en utilisant des fragments de tissu testiculaire provenant de patients adultes pre´sentant ou non une azoospermie. Ces premie`res e´tudes ont permis de montrer que quelques spermatogonies e´taient capables de survivre durant plusieurs mois. Toutefois, une re´gression des tubes avec fibrose de la paroi des tubes se´minife`res ainsi qu’une disparition progressive des cellules germinales ont ge´ne´ralement e´te´ observe´es [21]. De meilleurs re´sultats ont e´te´ obtenus en utilisant du tissu fœtal provenant d’avortements. En effet, quatre a` cinq mois apre`s la transplantation, une augmentation de la taille des greffons ainsi qu’une maturation des tubes avec migration des cellules germinales souches et des cellules de Sertoli vers la membrane basale, ont pu eˆtre observe´es. La diffe´rentiation des spermatogonies n’a cependant pas e´te´ obtenue [22]. Enfin, une bonne pre´servation des tubes et de la capacite´ des spermatogonies a` prolife´rer a e´galement pu eˆtre observe´e au bout de trois semaines sur des greffons provenant d’enfants pre´sentant une cryptorchidie [23]. Ainsi, la maturation in vivo de spermatogonies humaines apre`s xe´no-transplantation chez la souris n’est pas envisageable dans la mesure ou` l’homme et la souris sont phyloge´ne´tiquement trop e´loigne´s. En revanche meˆme si elle n’a pas encore e´te´ possible, la maturation in vivo apre`s xe´no-greffe de fragments de tissu testiculaire pre´pube`re pourrait permettre d’obtenir des spermatozoı¨des utilisables afin de restaurer la fertilite´ des patients. En effet, dans le cas de la xe´no-greffe tissulaire, la niche cellulaire de la cellule germinale souche est pre´serve´e. De plus, une spermatogene`se comple`te a de´ja` e´te´ possible pour de nombreuses espe`ces de mammife`res et e´galement chez un primate le singe macaque rhe´sus. 3.3. Quand les spermatogonies souches n’existent pas ou n’existent plus ! Si les cellules germinales souches subissent une exposition toxique in utero ou si le dysfonctionnement de la spermatogene`se est constitutionnel, aucune mesure pre´ventive n’est envisageable a` l’heure actuelle pour pre´server ces cellules germinales. Pour remplacer les cellules germinales souches, il semble alors ne´cessaire de pouvoir ge´ne´rer in vitro des cellules germinales souches a` partir d’autres cellules souches comme les cellules souches embryonnaires totipotentes [24], les cellules souches adultes pluripotentes/multipotentes [25] ou les cellules pluripotentes induites (iPS) obtenues par reprogrammation cellulaire le plus souvent a` partir de fibroblastes [26]. L’utilisation des cellules souches embryonnaires soule`ve de nombreuses questions e´thiques et obligerait dans le contexte d’une production de cellules germinales dont le patrimoine ge´ne´tique serait celui de l’individu de passer par une e´tape de clonage non pas reproductif mais the´rapeutique pour obtenir des
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cellules souches embryonnaires, non envisageable a` l’heure actuelle. Cependant, chez la souris, il faut noter que des spermatozoı¨des ont pu eˆtre obtenus in vitro apre`s induction des cellules embryonnaires souches par l’acide re´tinoı¨que. Les cellules haploı¨des obtenues sont capables apre`s fe´condation de conduire a` la formation de blastocystes et d’une descendance viable [24]. L’utilisation de cellules souches adultes ou la ge´ne´ration de cellules pluripotentes induites (iPS) offre des perspectives inte´ressantes. En effet, les cellules iPS humaines semblent capables in vitro de se diffe´rencier en cellules germinales primordiales (CGP) puis en cellules me´iotiques et post-me´iotiques haploı¨des exprimant l’acrosine comme cela est observe´ dans les spermatides chez l’homme. Ces re´sultats indiquent que les cellules iPS humaines de´rive´es de reprogrammation des cellules somatiques adultes peuvent former des cellules germinales [26]. 4. Conclusion Dans les processus de maturation in vitro ou in vivo des cellules germinales souches, quelle que soit l’origine de ces cellules germinales souches, il est difficile de de´finir si les cellules haploı¨des produites correspondent a` une spermatide allonge´e ou un spermatozoı¨de. La qualite´ des cellules haploı¨des produites devra eˆtre ve´rifie´e sur le plan ge´ne´tique et e´pige´ne´tique ainsi que sur la descendance obtenue. L’utilisation de tels syste`mes de maturation soule`ve ne´anmoins un certain nombre de questions a` la fois scientifiques et e´thiques. Ils peuvent cependant fournir des mode`les d’e´tude cliniques originaux sur la formation et la pathologie de la ligne´e germinale maˆle humaine avec des applications the´rapeutiques potentielles. De´claration d’inte´reˆts Les auteurs de´clarent ne pas avoir de conflits d’inte´reˆts en relation avec cet article. Re´fe´rences [1] Rey RA, Musse M, Venara M, Chemes HE. Ontogeny of the androgen receptor expression in the fetal and postnatal testis: its relevance on Sertoli cell maturation and the onset of adult spermatogenesis. Microsc Res Tech 2009;72(11):787–95. [2] Stukenborg JB, Colo´n E, So¨der O. Ontogenesis of testis development and function in humans. Sex Dev 2010;4(4–5):199–212. [3] Stukenborg JB, Schlatt S, Simoni M, Yeung CH, Elhija MA, Luetjens CM, et al. New horizons for in vitro spermatogenesis? An update on novel three-dimensional culture systems as tools for meiotic and post-meiotic differentiation of testicular germ cells. Mol Hum Reprod 2009;15(9):521–9. [4] Wyns C, Curaba M, Petit S, Vanabelle B, Laurent P, Wese JF, et al. Management of fertility preservation in prepubertal patients: 5 years’ experience at the Catholic University of Louvain. Hum Reprod 2011;26(4):737–47.
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