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La sculpture et l'infrastructure du sporoderme de Ginkgo biloba comparées à celles des enveloppes polliniques des cyccadales
Review of Palaeobotany and Palynology, 26 (1978): 363--387
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© Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam -- Printed in The Netherlands
LA SCULPTURE ET L'INFRASTRUCTURE DU SPORODERME DE GINKGO BILOBA COMPAREES tk CELLES DES ENVELOPPES POLLINIQUES DES CYCADALES
JEAN-CLAUDE A U D R A N ' et EDWIGE MASURE ~
Labratoire de Botanique, U.E.R. Sciences, 51062 Reims CJdex (France) Laboratoire de Micropal$ontologie, U.E.R. Sciences de la Terre, 4, Place Juss&u, 75230 Paris C$dex 05 (France) (Accept~ le 5 juillet, 1977)
ABSTRACT Audran, J.-C. et Masure, E., 1978. La sculpture et l'infrastructure du sporoderme de Ginkgo biloba compar~es ~ celles des enveloppes polliniques des Cycadales. (Sculpture and infrastructure of the Ginkgo biloba sporoderm compared to those of the cycad pollen wall.) Rev. Palaeobot. Palynol., 26: 363--387. The Ginkgo biloba sporoderm, when examined with transmission and scanning electron microscopes, shows a sculpture and a texture which are very different from those observed in cycads. (1) The ornamental units are "rugules" which are evenly dispersed over the pollen grain surface except on the germinal zone which is decorated with " v e r r u c o f d e " components mixed with a few ridges. (2) The exine is composed of a tripartite sexine, the middle zone of which is full of irregular pits, and of a thick and strongly lamellated nexine. RI~SUMI~ Chez le Ginkgo biloba, le sporoderme examin~ en microscopie ~lectronique ~ transmission et ~ balayage poss~de des motifs sculpturaux et une configuration texturale qui se rdv~lent trbs diffdrents de ceux observds chez les Cycadales. (1) Les motifs ~l~mentaires de l'ornementation sont des rugules dispers~es uniform~ment sur le pourtour du grain de pollen ~ l'exception de la zone germinale, d~cor~e d'~i~ments verrucofdes m~l~s ~ quelques rides. (2) L'exine est constitute d'une sexine tripartite dont la zone moyenne est creus~e de cavit~s irr~guli~res et d'une nexine ~paisse, fortement lamellaris~e. INTRODUCTION
Lorsque l'on observe ~ l'~chelle de la microscopie optique des grains de pollen de Cycadales et de G. biloba, recueillis au moment de l'anth~se et
' Les observations en M.E.T. ont ~t~ faites par J.C. Audran, celles en M.E.B. par E. Masure.
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months simplement entre lame et lamelle dans une goutte d'eau, on constate qu'ils apparaissent identiques tant par leur forme, comparable ~ celle de grains d e caf~, que par leurs dimensions. Toutefois, l'analyse de l'ornementation de la surface exinique, ainsi que celle des variations d'~paisseur et de la compacit~ texturale de l'exine, permet ~ un observateur attentif et exp~riment~ de diff~rencier ces deux types de grains de pollen. Ce qui precede conduit, t o u t naturellement, h s'interroger sur la nature exacte de l'organisation morphologique et topographique des enveloppes polliniques, et plus particuli~rement de l'exine, des grains de pollen des Pr~spermaphytes; probl~mes qui demeurent hors du champs d'investigation de la microscopie optique du fait m~me des limites impos~es par la finesse des structures ~ analyser et ~ comparer. Deux hypotheses sont alors envisager: -- soit que le sporoderme des Pr~spermaphytes est b~ti sur un m~me schema, c o m m e semble le sugg~rer l'identit~ morphologique de ces grains de pollen, et, dans ce cas, les l~g~res differences qui permettent leur reconnaissance ne seraient que de simples variations compos~es sur un th~me commun; -- soit, au contraire, qu'il se pr~sente avec une architecture diff~rente selon qu'il appartient au pollen des Cycadales et des Ginkgoales, ce que pourraient traduire alors les quelques differences entrevues; dans ce dernier cas, la forme similaire qu'affectent ces grains de pollen ne serait qu'une simple convergence. Qu'en est-il r~ellement? C'est pour repondre a cette question que nous rapportons ici les r~sultats et les conclusions auxquels nous sommes parvenus apr~s analyse, ~ l'~chelle de la microscopie ~lectronique, du sporoderme de G. biloba. MI~THODOLOGIE
Materiel. Les grains de pollen de G. biloba ont ~t~ recueillis au m o m e n t de l'anth~se sur un arbre se d~veloppant dans les jardins du Museum d'Histoires Naturelles de Paris. Techniques. Les protocoles techniques sont identiques ~ ceux que nous avons employ~s dans un travail ant~rieur pour l'~tude en microscopie ~lectronique des sporodermes de quelques Cycadales (Audran et Masure, 1976, 1977). Terminologie. Afin de pouvoir comparer nos r~sultats ~ ceux de nos pr~d~cesseurs, ainsi qu'~ ceux que nous avons recueillis chez les Cycadales, la qualification des diff~rents niveaux du sporoderme du G. biloba se fera dans le cadre de la terminologie d~finie par Erdtman (1966). Toutefois, cette terminologie sera simplifi~e ~ ses termes principaux de mani~re ~ ~viter toute ambiguitY. Ainsi, pour l'exine, elle sera r~duite aux termes essentiels suivants: sexine et nexine, auxquels nous adjoindrons un chiffre arabe ou une lettre pour d~finir leurs subdivisions (Fig.3a).
365 HISTORIQUE Les donn~es concernant la composition ornementale et structurale du sporoderme du G. biloba sont peu nombreuses. Elles proviennent essentiellement d'observations faites en microscopie optique (cf.revues de Wodehouse, 1935; d'Erdtman, 1965, 1972; et de Masure, 1976), desquelles il ressort que les grains de pollen d~shydrat~s sont morphologiquement similaires ~ ceux des Cycadales. Toutefois, la sexine plus ~paisse que la nexine, apparait de texture plus compacte que celle des Cycadales. En microscopie ~lectronique, Ueno (1960b) d~crit, sur des coupes ultrafines de grains de pollen non ac6tolys~s, la structure de l'exine de G. biloba. I1 montre ainsi, apr~s avoir rappel~ la ressemblance morphologique des pollens secs du G. biloba ~ ceux des Cycadales, que la sexine "consists of a system of densely crowded bodies, 1.2 to 2.0 pm thick, gradually merging into the remarkable structure of the sexine". La sexine est ~pineuse. L'auteur conclut en soul:gnant que la sexine du G. biloba est tr~s diff~rente de celle du Cycas. De m~me, Yamazaki et Takeoka (1962), ~ l'aide de r~pliques au carbone, ont pu montrer que l'ornementation de l'exine est tr6s diff6rente de celle des Cycadales et consiste sur la face distale en de petites rides irr~guli6res, hautes de 0,1 ~ 0,2 pm auxquelles se m~lent, sur la zone aperturale, des ornementations verrucoi'des. Enfin, en 1974, Rhor analyse bri~vement les modalit~s de la g~n~se des enveloppes polliniques du G. biloba. En ce qui concerne l'infrastructure du sporoderme du pollen mfir, cet auteur rapporte, en plus des faits precedents, les pr~cisions suivantes: -- la sexine d6veloppe consid~rablement son 6paisseur aux d~pens de la r6gion "columellaire" qui n'est plus repr~sent~e que par de larges piliers bordant des tunnels parfois reli~s ~ l'ext~rieur; la surface de la sexine et les cavit~s de la "bacula" sont recouvertes par une pellicule tr~s fine, de densit~ diff~rente et de nature imprecise; la sporopoll~nine de la sexine a un aspect finemerit granuleux et homog~ne dans route son ~paisseur; la nexine est de structure lamellaire; l'intine apparai't comme une couche claire de faible ~paisseur; -- enfin, au niveau du sillon germinal l'exine ne serait plus constitute que par la nexine et la "foot layer", le tectum et la "bacula" ayant disparu. -
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RESULTATS Apr6s avoir bri~vement rappel6 qu'elles sont les caract~ristiques des grains de pollen du G. biloba, observes en microscopie optique (M.O.), nous d~crirons successivement l'ornementation de la surface de l'exine teUe qu'elle se r6v~le en microscopie 61ectronique ~ balayage (M.E.B.), puis l'organisation structurale du sporoderme telle qu'elle apparm~t sur des coupes ultrafines analys6es en microscopie ~lectronique ~ transmission (M.E.T.) et sur des fractureg observ~es en M.E.B.
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367 I. G ~ n ~ r a l i t ~ s L e s g r a i n s d e p o l l e n t u r g e s c e n t s o n t u n e f o r m e s u b s p h ~ r i q u e ( P l a n c h e I, 1). Au cours de la d~shydratation, l'aire germinative, de plus faible rdsistance et s u b e l l i p t i q u e , s ' e f f o n d r e e n i n d u i s a n t la f o r m e c l a s s i q u e d e s m o n o s u l q u d s ( P l a n c h e I, 2 ) . E n t r e l e s d e u x f o r m e s i d d a l e s , l a s p h e r e e t l ' e l l i p s o f d e ,
E X P L I C A T I O N S DES P L A N C H E S Techniques: M.O. : pollen non a c d t o l y s ~ - Planche I, 1--3; M.E.B.: pollen non ac~tolys~ -- Planche I, 4--5, Planche II, 1--8; M.E.T.: pollen non ac~tolys~, fix~ par le G l u t / O s O 4 et contrast~ par le KMnO 4 - - Planches III--VI. Abr$viations: C = c6t~; Ca = cavitd; CP = cellule prothallienne; CR = cellule reproductrice; C T = cellule t u b e ; I = intine; La = lamellarisation; L = l~vres du sillon; N = nexine; P D = p a l e distal; PE = p o n t exinique; PG = p a l e germinal; PP = p a l e p r o x i m a l ; S = sexine; S I = sexine I; S H = sexine II: S I I I = sexine III.
EXPLANATIONS OF PLATES Me thods: O.M.: non-acetolysed pollen grains -- Plate I, 1--3; B.E.M.: non-acetolysed pollen grains - - P l a t e I, 4--5, Plate II, 1--8; T.E.M. : non-acetolysed pollen grains, fixed by G l u t / O s O 4 and c o n t r a s t e d by KMnO 4 - - Plates III--VI. L i s t o f abbreviations: C = side; Ca = pit; CP = prothallial cell; CR = generative cell; C T = t u b e cell; I = intine; La = lamellation; L = edges of furrow; N = nexine; P D = distal pole; P E = bridge of exine; P G = germinal pole; PP = proximal pole; S = sexine; S I = sexine I; S / / = sexine II; S I I I = sexine III.
PLANCHE I 1. Pollen turgescent en vue longitudinale en bout. R e m a r q u e r les variations d'~paisseur de l'exine sur le p o u r t o u r du grain de pollen. × 1000. 2. Pollen d~shydrat~; r e m a r q u e r les l~vres e x t e r n e s festonn~es du sulcus. × 1000. 3. Pollen ~ c o n t o u r et sulcus subpolygonals. × 1000. 4. Vue polaire distal~ d ' u n grain d o n t les l~vres du sulcus se rejoignent. × 2000. 5. Vue polaire distale d ' u n grain, x 1500. 6. D~tail de l ' o r n e m e n t a t i o n . Crates courtes et serr~es. × 10.000. 7. D~tail de I ' o r n e m e n t a t i o n . Crates allong~es et dispers~es. × 10.000. 8. D~tail de l ' o r n e m e n t a t i o n aperturale (~l~ments verrucofdes) et structure de l'exine au niveau du sulcus. × 10.000. 9. D~tall de l ' o r n e m e n t a t i o n aperturale; ~l~ments verrucofdes plus riches. X 5000. PLATE
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1. Turgescent pollen grain seen in longitudinal view. Notice the variation o f the sexine thickness around the pollen grain. × 1000. 2. Deshydrated pollen grain; notice the o u t e r scalloped edge o f sulcus. × 1000. 3. S u b p o l y g o n a l c o n t o u r o f pollen grain and sulcus. X 1000. 4. Polar distal view o f a pollen grain whose sulcus edges are contiguous. X 2000. 5. Polar distal view o f a pollen grain. × 1500. 6. Detail o f the o r n a m e n t a t i o n . S h o r t crests closely, packed together, x 10,000. 7. Detail o f the o r n a m e n t a t i o n . Long and dispersed crests, x 10,000. 8. Detail o f the apertural o r n a m e n t a t i o n and exine structure at the sulcus level. × 10,000. 9. Detail o f the apertural o r n a m e n t a t i o n , x 5000.
368 existent une multitude d'interm~diaires d~form~s. A l'extr~me, certains pollens pr~sentent un contour polygonal ~ angles arrondis (Planche I, 3). G~n~ralement, les extr~mit~s de l'ellipse sont aigu~s, mais peuvent s'arrondir. Les mesures effectu~es sur 200 grains ont donn~ les r~sultats suivants: L = 25 t~m (33 pm) 47 p m ; l = 17 t~m (24,5 pm) 33 gm. Modes L = 35 um, l ~ 22 tzm. R a p p o r t L/l = 1,3. Au niveau du pSle proximal, l'exine mesure I pm. Au sommet des faces lat~rales, elle s'~largit jusqu'~ 1,5 pm, pour s'amincir consid~rablement au niveau du pSle v~g~tatif et atteindre 0,3--0,5 pm. L'~paississement de l'exine au sommet des faces lat~rales se traduit en vue polaire distale par un bourrelet festonn~ qui souligne le sulcus (Planche I, 2). II. La sculpture exinique Le relief de la surface exinique qui caract~rise les r~gions extracolpales diff~re tr~s nettement de celui correspondant ~ la r~gion germinale. L 'ornementation du pSle proximal et des faces lat~rales Les clich6s (Planche I, 4,5) montrent que les motifs 616mentaires de l'ornementation sont des crfites ou rugules ~ relief aigu d61imit6es par une forte rupture de pente. Ces crfites se dispersent uniform6ment sur le pourtour du grain de pollen. Deux types d'ornementation fond6s sur les variations de l'allongement des crfites ont 6t6 r6pertori6s. Certains grains de pollen pr6sentent des crates courtes et serr6es (Planche I, 6), tandis que d'autres poss6dent des crates plus longues et espac~es. (Planche I, 7). L 'ornementation de l'aire germinative L'aire aperturale est orn6e d'616ments verrucofdes dont la forme peut varier (Planche I, 8) m~16s quelquefois $ des rides (Planche I, 9). III. Structure et stratification des enveloppes polliniques Nous rapporterons t o u t d'abord, les r6sultats acquis sur des grains de pollen normalement conform6s, puis ceux recueillis sur certaines structures polliniques aberrantes que nous avons eu l'occasion de rencontrer, toujours en petit nombre, durant nos observations. Le sporoderme des grains de pollen normaux Nos r~sultats ont ~t~ obtenus essentiellement sur des grains de pollen non ac~tolys~s, nous les compl~terons par quelques donn~es acquises sur des grains de pollen ac~tolys~s.
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(a) Pollen non ac$tolysb L'exine. La coupe axiale d'un grain de pollen examin6 en M.E.B., montre n e t t e m e n t les variations d'6paisseur de l'exine, particuli6rement l'6paississement de celle-ci au niveau des 16vres du sillon (Planche II, 1). En M.E.T., sur coupe ultrafine, cette exine apparai't d'embl6e compos6e de deux couches (Planche III, 1). L'une externe, h6t6rog6ne et de forte densit6, la sexine, et l'autre interne, d'apparence homog6ne et de plus faible densit6 correspondant ~ la nexine. D6crivons les successivement telles qu'elles se pr6sentent tout d'abord sur la base prothallienne et les faces lat6rales du grain de pollen o5 eUes sont les plus complexes, puis au pale germinal oO elles se simplifient.
(1) Structure de l'exine sur la base prothallienne et les cSt~s du grain de pollen. La sexine. Elle se r~v~le constitute de trois strates (Planche II, 2; Planche III, 2): -- l'une externe, la sexine I, de texture homog~ne et dont l'~paisseur relativement importante n'est pas constante. Elle ~met vers l'ext~rieur de petites projections en forme d'~pines, de taille variable et qui conf~rent ~ son profil un aspect en dents de scie. Remarquons ~ ce propos, que le relief exinique peut ~tre selon les grains de pollen, soit tr~s accuse, soit plus ou moins f o r t e m e n t ~mouss~ (Planche III, 3--4). une strate moyenne, la sexine II, qui, en coupe axiale, apparai't compos~e de piliers. Ceux-ci, de taille et de forme irr~guli~res sont en continuit~ avec la sexine I. Ils d~limitent des cavit~s d'aspect tr~s variable pouvant communiquer avec l'ext~rieur par des interruptions plus ou moins localis~es de la sexine (Planche II, 8; Planche III, 5). Sur des coupes tangentielles, on constate que les piliers sont, en fair, la trace de cloisons dispos~es perpendiculairement la surface de l'exine et dessinant un r~seau grossier (Planche IV, 1). enfin, une strate interne, la sexine III (Planche III, 2--5) en continuit~ avec la base des cloisons de la sexine II et reposant sur la nexine. Cette strate est g~n~ralement mince, mais elle peut, localement, acqu~rir un fort d~veloppement. La nexine. On distingue: une zone transparente aux ~lectrons et d'~paisseur uniforme qui limite ext~rieurement la nexine. C'est sur elle que repose la sexine III (Planche IV, 2). une strate interne (nexine B) d'apparence homog~ne et dans laquelle on observe des syst~mes lamellaires tout ~ fait comparables ~ ceux d~crits dans la nexine des Cycadales (Planche IV, 3). Cette configuration de l'exine se transforme localement dans la zone de passage c5t~-pSle germinal par: une augmentation importante du volume des cavit~s de la sexine II (Planche II, 2; Planche IV, 4--5; Planche V, 1); et un d~veloppement considerable de la nexine qui apparaft enti~rement constitu~e de longs syst~mes de lamelles dispos~es parall~lement les unes aux autres (Planche IV, 4--5; Planche V. 1 }. -
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371 Par c o n t r e , l ' e x i n e ne se m o d i f i e pas dans la z o n e de passage base-cbt~, c o m m e c ' e s t le cas d~j~ d~crit chez les Cycadales. (2) S t r u c t u r e de l ' e x i n e au pble germinal
La sexine. Elle est r~duite ~ sa strate externe, sexine I, qui repose ainsi d i r e c t e m e n t sur la nexine. C e t t e strate, d'ailleurs, s'est f o r t e m e n t amincie et se r~v~le c o n s t i t u t e par la j u x t a p o s i t i o n de petits amas arrondis ext6rieurem e n t (Planche II, 6; P l a n c h e V, 1). La nexine. Elle a p p a r a f t avec la m ~ m e c o n f o r m a t i o n que sur la base et les cbt~s, et f o r m e d o n c , d u fait de l ' a m i n c i s s e m e n t de la sexine, l'essentiel de l ' e x i n e au pble germinal (Planche III, 1; Planche V, 1).
L'intine. Elle est d'~paisseur r e l a t i v e m e n t c o n s t a n t e sur le p o u r t o u r d u grain de pollen, sauf au pble germinal off elle s'~paissit q u e l q u e peu. Elle se r~v~le t r a n s p a r e n t e a u x ~lectrons et de t e x t u r e h o m o g ~ n e sur l ' e n s e m b l e de son ~paisseur (Planche III, 1). Les parois s q u e l e t t i q u e s des ceUules r e p r o d u c t r i c e et p r o t h a l l i e n n e se r a t t a c h e n t i n d ~ p e n d a m m e n t ~ l ' i n t i n e situ~e sur la partie inf~rieure des faces lat~rales.
(b ) Pollen ac~tolys~ Apr~s ac~tolyse, le s p o r o d e r m e se t r o u v e r~duit ~ son exine, l'intine ~tant t o t a l e m e n t d~truite quelle que soit sa p o s i t i o n sur le p o u r t o u r d u pollen. L ' e m p l o i de l ' a c ~ t o l y s e m~nag~e ne f o u r n i t pas d ' i n d i c a t i o n s nouvelles. PLANCHE II 1. Coupe axiale. Remarquer les variations d'~paisseur de l'exine. × 4000. 2. D4tail de la structure de l'exine au sommet des faces lat~rales ou l~vres du sillon. × 10.000. 3. D~tail de la structure de l'exine au niveau de l'aire germinative. × 10.000. 4. Grain de pollen assoei~s en t~trade. Remarquer les points exiniques qui les relient (fl~ehes). X 1500. 5. D~tail de l'ornementation d'un grain de pollen anormal. X 5000. 6. D~tail de la structure de l'exine au niveau du sillon. Remarquer les interruptions de la sexine I et la nexine. × 10.000. 7. Pollen anormal en vue polaire distale. × 2000. 8. D~tail de l'architecture exinique au sommet des faces lat~rales. X 15.000. PLATE II 1. Axial section. Notice the variations of the exine thickness. × 4000.
2. Detail of the exine structure at the edge of the furrow. × 10,000. 3. Detail of exine structure in the germinal zone. × 10,000. 4. Pollen grain associated in a tetrad. Notice the exine bridges (arrows). × 1500. 5. Detail of the ornamentation of a pollen grain. × 5000. 6. Detail of the exine structure at the furrow level. Notice the interruption of the sexine I and the nexine. × 10,000. 7. Abnormal pollen grain seen in polar distal view. × 2000. 8. Detail of the exine structure at the top of lateral faces. × 15,000.
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PLANCHE III
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La configuration de la sexine demeure inchang~e, par contre les syst~mes lamellaires de la nexine sont rendus plus accessibles &l'observation. Soulignons que la prise " d u colorant" de la M.E. sur les exines ac~tolys~es se fait tr~s mal. Malgr~ cela, la sexine se r~v~le toujours plus contrast~e que la nexine.
Le sporoderme de quelques grains de pollen aberrants Les formations polliniques aberrantes les plus fr~quemment observ~es peuvent ~tre r~unies en deux types.
(a) Grains de pollen associ$s en t~trade La photo prise en M.E.B. fournit un excellent exemple de grains de pollen group,s par quatre (Planche II, 4). On constate que ces grains de pollen dont les faces germinales sont tourn~es vers l'ext~rieur, sont associ~s dans la position qu'ils poss~daient initialement dans la t~trade, dont ils sont issus. Ils sont r~unis les uns aux autres par des ponts exiniques dont le nombre et l'importance sont variables. Par ailleurs, la sculpture (Planche II, 5) de l'exine de ces pollens se r~v~le tr~s ~mouss~e et apparaft, de ce fait, tr~s diff~rente de celle d~crite pour les grains de pollen normaux. Sur les coupes ultrafines pratiqu~es sur ces constructions polliniques, on remarque que la disposition g~n~rale des constituants du sporoderme n'est pas modifi~e (Planche V, 2--3). La stratification, la structure et la texture des diff~rents niveaux exiniques, en particulier, sont similaires ~ celles observ~es dans l'exine des grains de pollen de constitution normale. Sur ces images, la nature des jonctions ~tablies entre les diff~rents grains de pollen devient apparente. Ces liaisons dont les photos fournissent quelques uns des n o m b r e u x aspects qu'elles peuvent affecter, sont constitutes par la PLANCHE III 1.
Coupe axiale. Noter la forte r~duction de l'exine au p61e germinal et sa compacit~ sur l'ensemble du pourtour du grain de pollen. X 6000. 2. Sporodermes des faces lat~rales. La sexine et la nexine sont nettement individualis~es. La face externe de la sexine est h~riss~e d'ornements aigus. X 22.000. 3--4. Deux aspects des variations du relief ornemental (fl~ches). × 11.000. 5. Sporoderme des faces lat~rales. Les cavit~s de la sexine communiquent avec l'ext~rieur par de fins canalicules (fl~ches). x 22.000. PLATE III 1.
Axial section. Notice the strong decrease of the exine in the germinal zone and its compactness around the pollen grain, x 6000. 2. Sporoderms of the lateral faces. The sexine and the nexine are clearly identified. The external face of the sexine bristles with sharp ornaments. × 22,000. 3--4. Two views of ornamental relief variations, x 11,000. 5. Sporoderm of the lateral faces. The sexine pits communicate with the outside by small canalicules, x 22,000.
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sexine et plus particuli~rement la sexine I (Planche V, 2--3). Ces portions de sexine mises en c o m m u n entre les grains de pollen adjacents d~terminent ainsi une cohesion extr~mement rigide de l'ensemble des grains de pollen associ~s. Enfin, nous noterons aussi le caract~re estomp~ des pro~minences de la surface exinique (Planche V, 3).
(b ) Grains de pollen pr~sentant une malformation texturale et structurale de l'exine Commentons les deux aspects que nous avons observ6s et qui sont respectivement illustr6s par les figures 1, 2 et 3 de la Planche VI. Premier aspect (Planche VI, 1). Sur ce grain de pollen, l'exine apparai't dans son ensemble pros de deux fois plus @aisse qu'une exine normale. La sexine et la nexine sont toujours bien identifiables mais avec les differences suivantes: La sexine: Elle est une fois et demi plus ~paisse que dans le grain de pollen normal et se r~v~le tr~s compacte. Elle apparai't sur les coupes ultrafines, c o m m e compos~e de blocs de sporopoll~nine de taille et de forme irr~guli~res, tass6s plus ou moins fortement les uns contre les autres selon leur position stratigraphique. Les diff6rentes strates de la sexine d~crites pr~c~demment sont encore d~celables, bien que tr~s modifi~es. Sexine I: elle forme une strate compacte, aux limites irr~guli~res. Sa surface pr~sente un profil tr~s tourment~ off l'on observe encore quelques rares pro~minences ~pineuses. La sculpture de ce pollen doit ~tre fortement perturb~e. Sexine II: le volume des cavit6s constituant ce niveau est r6duit ~ l'extr~me et celles-ci apparaissent sous la forme de fins canalicules. Sexine III: elle est fragmentaire et de faible @aisseur. La nexine est pros de quatre fois plus ~paisse que la normale et sa texture est relativement homog~ne. Les syst~mes lamellaires y sont plus rares. PLANCHE IV 1.
Coupe orient6e parall~lement ~ la surface du grain de pollen. Les cloisons limitant les cavit6s de la sexine dessinent un r~seau grossier, x 22.000. 2--3. Sporodermes des faces lat4rales. La nexine est s~par6e de la sexine par une fine ligne blanche (fl~ches). Des lignes blanches identiques sont aussi observables au sein de la nexine (fl~ches doubles). X 11.000. 4--5. Sporodermes de la zone de passage c6t6---pSle germinal. Coupes axiale et subtangentielle montrant le fort d6veloppement des cavit4s de la sexine et l'importante lamellarisation de la nexine. X 22.000. PLATE IV 1. Subtangential section. The walls of the sexine pits form a coarse network, x 22,000. 2--3. Sporoderm of lateral faces. The nexine is separated from the sexine by a thin white line (arrows). Identical white lines are also observed in the nexine (double arrows). X 11,000. 4--5. Sporoderms of the edge of the furrow. Axial and subtangential sections showing the strong development of the sexine pits and the large lamellated nexine, x 22,000.
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Deuxi~me aspect (Planche VI, 2, 3). Dans ce deuxi~me type, la configuration g~n~rale de l'exine se r~v~le d'embl~e inhabituelle. Comme dans le cas pr~c~demment d~crit, la nexine est @aisse et relativement homog~ne. Par contre, la sexine est b~tie sur un module tr~s different dont la sexine I constitue la partie la plus importante. Celle-ci est en effet compos~e par l'alternance de r~gions, d'~tendues variables, peu ~paisses, au relief moutonn~ et de zones fortement saillantes, en forme de d6me et dont les dimentions limit~es sont relativement homog~nes sur l'ensemble du grain de pollen. Sous la sexine I, on observe une tr~s fine sexine II dont les cloisons en continuit~ avec la sexine I semblent par endroit reposer directement sur la nexine. C'est qu'en effet, la sexine III est irr~guli~rement d~velopp~e, voire souvent inexistante (Planche VI, 2). En conclusion, l'ensemble des r~sultats que nous venons d'acqu~rir sur l'organisation du sporoderme de G. biloba permet d~s maintenant: -- de d~finir la disposition infrastructurale et la configuration texturale des diff~rentes enveloppes polliniques c onstitutives ( Fig. 1 ); -- d'~tablir les relations entre l'ornementation superfici~lle de l'exine et son infrastructure sous-jacente (Fig.2). DISCUSSION
I. Confrontations de nos rdsultats & ceux de nos pr~decesseurs Selon Ueno (1960a) l'ornementation superficielle de l'exine serait de type ~pineux. Cette m~prise vient du fait que cet auteur n'a pu ~tudier que des coupes ultrafines sur lesquelles effectivement, c o m m e le montrent aussi nos ~lectronographies, l'image du relief exinique apparaft bien sous l'aspect d'une s~rie de pointes. En r~alit~, l'emploi du M.E.B. r~v~le que ces projections ~pineuses repr~sentent les coupes de rides ou crates dispos~es irr~guli~rement sur l'exine. Nos r~sultats concordent donc avec ceux de Yamazaki et Takeoka (1962) obtenus par la m~thode des empreintes. Par ailleurs, ils les PLANCHE V 1.
Modification de la structure e x i n i q u e dans la zone de passage c6t~--sillon germinal. Au niveau du p61e germinal, la sexine est r~duite & sa strate externe, x 35.000. 2--3. Grains de pollen group4s en t~trade. Seule la strate e x t e r n e de la sexine c o n t r i b u e & la f o r m a t i o n des p o n t s exiniques reliant les grains de pollen entre eux. L ' o r n e m e n t a tion de ces grains de pollen est faiblement d~velopp4e (fl~ches). x 7000. PLATE V 1.
Modification o f the exine structure at the edge of the furrow. At the germinal zone, the sexine is reduced to its external stratum. X 35,000. 2--3. Pollen grains associated in a tetrad. The external stratum of the sexine alone contributes to the f o r m a t i o n of exine bridges. The o r n a m e n t a t i o n of this pollen grain is p o o r l y developed (arrows). × 7000.
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® @ Fig.1. Repr6sentation semi-sch~matique d'une coupe radiale du sporoderme du grain de pollen de Ginkgo biloba, vue en microscopie ~lectronique ~ transmission. Fig.1. Diagrammatic representation of a radial section of a Ginkgo biloba sporoderm pollen grain seen by transmission electron microscopy.
compl~tent car nous avons d6cel6 sur les ~chantillons de pollen analys6s une double variation morphologique du motif ornemental affectant la longueur et l'importance du relief des rugules. Pourquoi de telles modifications? Si les causes [probablement d'ordre g~n~tique (Heslop-Harrison, 1971b)] modifiant PLANCHE VI 1.
Exine aberrante dont la sexine apparaft compos6e de granules de sporopoll6nine dens(!ment agglom6r6s (fl6ches). × 16.000. 2--3. Exine aberrante. L'ornementation de la surface pollinique est totalement modifi6e. X 25.000 et X 11.000. PLATE VI Abnormal exine whose sexine is composed of densely packed sporopollenin granules (arrows). X 16,000. 2--3. Abnormal exines. The ornamentation of the exine surface is totally modified. X 25,000 and × 11,000. 1.
380 sillon
qerminal
M. E. T.
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Fig.2. R e l a t i o n s e n t r e l ' o r n e m e n t a t i o n et F i n f r a s t r u c t u r e sous-jacente d e l ' e x i n e d u p o l l e n de Ginkgo biloba (N = n e x i n e ; S = sexine). Fig.2. R e l a t i o n s b e t w e e n t h e o r n a m e n t a t i o n a n d t h e u n d e r l y i n g i n f r a s t r u c t u r e o f t h e e x i n e o f t h e Ginkgo biloba p o l l e n grain ( N = n e x i n e ; S = sexine).
la densit~ de la r~partition et la longueur des crates sont difficilement pr~hensibles, celles entrai'nant le caracthre ~mouss~ du relief exinique d'un certain pourcentage de grains de pollen dans les lots examines, peuvent trouver un d~but d'explication. En effet, chez G. biloba (Rhor, 1974), ~ l'inverse de ce que nous avons pu observer chez les Cycadales (Audran, non publiC), l'exine ne s'41abore pas en totalitd au sein de la t~trade. La sculpture exinique, en particulier, n'apparai't, d'apr~s les images fournies par l'auteur, que sur les grains de pollen; les microspores n'ayant qu'une ~bauche d'ornementation. On peut donc valablement avancer que les grains de pollen ornementation r~duite ne sont que des microspores ayant cess~, pour une cause ignor~e, d'~voluer. On remarquera ~ ce propos, que les ~difices polliniques group,s en t~trades et provenant sans doute, c o m m e chez les Cycadales, d'une anomalie du d4roulement des mitoses m~iotiques (Audran,
381 1969), sont caract~ris~s aussi par une ornementation ~ peine marquee. Ces groupements aberrants au sein du pollen de G. biloba s'apparentent aux t~trades acalymm~es d~finies par Van Campo et Guinet (1961) et Roland (1971). La cohesion de ces ensembles est assur~e, c o m m e cela a ~t~ aussi rapport~ pour les t~trades polliniques de Typha latifolia (Skvarla et Larson 1963), et de certaines Onagrac~es (Skvarla et al., 1975), par des r~gions d'importance variable de la couche externe de l'exine mises en c o m m u n entre les monades contigiies. En ce qui concerne l'infrastructure et la texture des enveloppes polliniques du G. biloba nos r~sultats: -- s'opposent ~ ceux de Ueno (1960b) sur les deux points suivants: Selon cet auteur, la sexine serait constitute par: "A system of densely crowded bodies" et poss~derait ainsi une texture grenue iVan Campo et Lugardon, 1973). Les images que nous fournissons ainsi que celles de Rhor {1974) m o n t r e n t au contraire que la sexine est constitute d'une substance homog~ne se subdivisant en trois niveauxo Toutefois, nous avons observ~ quelques grains de pollen d o n t l'exine, de construction aberrante, poss~dait une sexine effectivement b~tie c o m m e le d~crit Ueno. Une telle disposition de la zone m o y e n n e de l'exine ~voque la texture infratectale grenue Observ~e par Le Thomas et Lugardon (1976) chez certaines Annonac~es. L'apparition de cette texture infratectale grenue sur un pollen o~ elle n'existe pas normalement souligne le caract~re versatile des processus morphog~n~tiques ~ l'origine des principales couches de l'exine. Par ailleurs, ces granules formant la sexine se m~leraient intimement ~ la nexine. Or, sur nos ~lectronographies, sexine et nexine forment deux ensembles n e t t e m e n t tranch~s, tant sur le plan structural (texture homog~ne et lamellaire) que sur celui de la densit~ aux ~lectrons; la sexine ~tant plus dense que la nexine. s'accordent avec ceux de R h o r (1974). N~anmoins l'interpr~tation que nous donnons de la structure de l'exine sur la zone germinale diff~re de cet auteur. En effet, nous consid~rons que la partie de la sexine qui subsiste sur le sillon, correspond ~ la sexine I e t non ~ la sexine II (nomm~e " f o o t layer" par Rhor). Pour justifier notre position, nous avancerons les arguments suivants: Le premier est d'ordre morphologique. En effet, l'ornementation de cette surface exinique est constitute en partie des m~mes ~l~ments sculpturaux que celle des r~gions intercolpales; Le second est d'ordre morphog~n~tique. Si, c o m m e le d~crit Rhor, la " f o o t layer" (sexine III) se forme ~ partir de la base des bacules selon le m~me principe que celui qui preside ~ la formation du m~me niveau du sporoderme des Spermaphytes, nous concevons real sa presence sur le sillon 1~ ot~ justement, les bacules sont absentes. Comme nous, Ueno admet que c'est l'ectosexine (sexine I selon notre terminologie) qui recouvre, avec la nexine, le sillon. Enfin, il est ~ noter qu'aucun des auteurs precedents n'a signal~ la transformation structurale de la nexine dans la zone de passage cSte--sommet -
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382
qui confute pourtant ~ celle-ci une configuration tr~s originale et qui n'est pas sans ~voquer la structure de la nexine localis~e autour du pore des grains de pollen de Poa annua, dans les jeunes stades de sa formation (Rowley, 1964). II. Comparaison de la sculpture et de la structure du sporoderme du G. biloba celle du sporoderme des cycadales (a) Lorsque l'on compare les coupes pratiqu~es dans un sporoderme de Cycadale (cf. Audran et Masure 1976) ~ celles pratiqu~es au m~me endroit dans le sporoderme du G. biloba (Fig.l), on remarque d'embl~e que ceux-ci sont toujours constitu~s de trois couches distinctes: une externe, h~t~rog~ne et de forte ~paisseur qui conf~re ~ l'exine ses principales caract~ristiques. Elle est qualifi~e de sexine. -- une moyenne, plus discrete, homog~ne et lamellaire, nomm~e nexine; Ces deux couches, plus ou moins ac~tor~sistantes, forment l'exine. -- enfin, une interne ac~tosoluble et en contact direct avec le contenu cellulaire du grain de pollen, c'est l'intine. Toutefois, cette ressemblance structurale demeure tr~s superficielle car la texture, la disposition et l'organisation des diff~rents niveaux composant ces couches, et en particulier l'externe, apparaissent fondamentalement diff~rentes. Confrontons les r~sultats obtenus sur la structure de l'exine du pollen de G. biloba ~ ceux ayant permis pr~c~demment de d~finir le schema g~n~ral de la conformation de l'exine des Cycadales (Audran et Masure, 1976). -
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La structure du sporoderme des faces lat~rales ou de la base prothallienne On constate alors, d'embl~e, un certain nombre de differences importantes que nous allons passer maintenant en revue et qui affectent la composition de: La sexine. Elle est essentiellement l'objet de deux modifications qui ~ elles seules opposent l'exine du pollen du G. biloba ~ celle des pollens des Cycadales. Ce sont: l'absence de logettes r~guli~res, qui ici sont remplac~es par des cavit~s de volume r~duit et de c o n t o u r irr~gulier d~finissant un r~seau grossier et formant ainsi une sexine II tr~s compacte. Cette compacit~ de l'exine est encore rehauss~e par la presence d'une sexine fortement d~velopp~e. la presence d'un niveau forme ~ la base de la sexine par la fusion lat~rale des extr~mit~s des murets limitant le r~seau de la sexine II. Hormis le cas du genre Zamia (Audran et Masure, 1977), o~ sur le pSle prothallien du grain de pollen une ~bauche de fusion lat~rale des bases des cloisons des logettes en une strate discontinue a pu ~tre observ~e, une telle sous-couche n'existe pas chez les Cycadales. Cette strate appartient r~ellement ~ la sexine car elle r~agit ~ l'ac~tolyse et aux fixateurs, en particulier le permanganate de potassium, c o m m e le f o n t les sexines I e t II. -
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383 a)
Cycadales
Ginkgoaies
II
,~EX INE
INTINE
~zone/ qerminale
Fig.3. Schemas r~capitulatifs de la composition du sporoderme (a) et de l'organisation des enveloppes pollinique au niveau de la zone germinale (b) chez les Cycadales et le Ginkgo biloba (ZG = zone germinale). Fig.3. Recapitulative diagrams of the sporoderm composition (a) and of the pollen wall organization at the germinal zone level (b) of the cycads and Ginkgo biloba (ZG = germinal zone). De ce fair, la sexine chez les Ginkgoales a p p a r a f t c o m p o s ~ e de trois strates au lieu de d e u x chez les Cycadales (Fig.3a).
La nexine. Les d i f f e r e n c e s y s o n t m o i n s sensibles et l ' o n n o t e r a s i m p l e m e n t : - - sa f o r t e ~paisseur. Par e x e m p l e la n e x i n e d u G. biloba est u n tiers d e fois plus ~paisse que la n e x i n e de Ceratozamia mexicana o u de Dioon edule et elle est d e u x fois plus ~paisse q u e celle de Stangeria paradoxa. son a b o n d a n t e lamellarisation. Les syst~mes lamellaires ~tant ~ la fois plus n o m b r e u x et plus longs. -
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L'intine. Elle a, c o n t r a i r e m e n t ~ celle des Cycadales, u n e ~paisseur u n i f o r m e .
384 L'organisation du sporoderme au niveau de la zone germinale (Fig.3b) Observ~ en microscopie optique ou en microscopie ~lectronique ~ balayage au faible grossissement, le sillon germinal du pollen du G. biloba a une configuration ellipsofdale similaire ~ celui des Cycadales. I1 est en effet situ~ au pSle distal et se d~prime fortement lorsque le pollen est d~shydrat~. Cette ressemblance morphologique cache en fait de profondes differences structurales qui se marquent uniquement au niveau de la conformation de l'exine. On constate en effet que: sur l'ensemble de la r~gion du sillon, la sexine se r~duit ~ sa strate externe, la sexine I. Cette derni~re d'ailleurs, a subi une forte r~duction de son ~paisseur et sa structure est devenue granuleuse; -- la nexine, toujours pr~sente, a une composition et une ~paisseur identiques a celles des regions intercolpales. Donc et contrairement aux Cycadales, la zone germinale du pollen du G. biloba est form~e d'une seule r~gion. Si par son aspect structural, elle rappelle la zone centrale du sulcus des Cycadales, il faut bien falre remarquer et souligner que la couche moyenne, situ~e entre la sexine et l'intine, est de nature diff~rente chez les Cycadales {couche externe de l'intine) et chez les Ginkgoales (nexine) (Fig.3b). -
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Composition du sporoderme au niveau des zones de transition Chez le G. biloba, seule la zone de passage cSte--sommet est n e t t e m e n t marquee, elle correspond aux l~vres du sillon. On remarque que: -- contrairement aux Cycadales, la sexine accroft son ~paisseur. Les cavit~s de la sexine II ~tant particuli~rement bien d~velopp~es; c o m m e chez les Cycadales, mais dans des proportions plus importantes, la nexine d~veloppe sa lamellarisation. -
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(b) L'ornementation apparai't moins complexe que celle des Cycadales, c o m m e chez ces derni~res pourtant on distinguera les deux r~gions suivantes: Les faces lat~rales et dorsales o~ l'ultrarelief apparai't constitu~ de petites crates, rectilignes, dispos~es sans ordre d~fini. Cette sculpture cr~t~e, pr~sentant deux types, est homog~ne pour l'ensemble de ces r~gions. Sur les ultracoupes nous constatons alors que ces rides correspondent ~ des ~l~vations de forme triangulaire de la surface exinique. Ainsi, chez le G. biloba, l'ornementation r~sulte de l'agencement particulier des formations en cr~te. Ce sont ces reliefs qui forment la sculpture de l'exine. Chez les Cycadales au contraire, les ~l~ments essentiels de la sculpture sont les d~pressions d o n t l'importance et surtout la disposition mod~lent la surface exinique. Ce sont ces creux qui contribuent ~ l'ornementation de l'exine (Audran et Masure, 1977). Cette difference est d'ordre morphog~n~tique (Audran, non publiC; Rhor, 1974). La face ventrale o~ l'ornementation est constitute de petites verrues o~ se m~lent parfois des crates similaires ~ celles des r~gions pr~c~dentes. Contrairement aux Cycadales, cette sculpture chez G. biloba n'est pas une
385
~laboration accidentelle, ddpendante d'un quelconque mouvement de l'exine, mais une ornementation r~elle, lide ~ la structure m~me de la sexine I. Enfin, nous noterons que, d'une mani~re gdndrale et du fair de l'~paisseur importante de la sexine I, le relief de la surface pollinique de Ginkgo biloba est sujet ~ moins de modifications que celui des Cycadales. En conclusion et en accord avec Ueno (1960a), nous voudrions rappeler l'importance des differences structurales et sculpturales des exines des pollens des Cycadales et de G. biloba pourtant morphologiquement identiques. Ces divergences confirment que Cycadales et Ginkgoales, bien qu' appartenant ~ un m~me niveau ~volutif, celui des Pr~spermaphytes, repr~sentent deux phylums nettement diff~rents. III. Terminologie Les nombreuses terminologies appliqudes ~ la ddfinition des diffdrentes strates constitutives de l'exine ont ~t~ ~tablies ~ l'aide d'exemples choisis chez les Angiospermes (Van Campo et al., 1965). Leur application aux exines des Prdgymnospermes et des Gymnospermes pose de sdrieux probl~mes (Gullvag, 1966). Toutefois, cela n'apparai't pas impossible ~ condition de d~finir strictement le cadre de leur utilisation. Pour cela nous nous rdf~rerons aux rdsolutions rdcentes (1975) prises ~ ce sujet au cours d'un symposium organisd par I'A.P.L.F. 1 . Aussi, compte tenu des r~sultats acquis prdc~demment il apparaft, ~ l'inverse des Cycadales (Audran et Masure, 1977), que la terminologie de Faegri (1956) et Faegri et Iversen {1964) se rdv~le la mieux adaptde ~ la ddfinition de la stratification des exines de G. biloba (Fig.4). A c e propos, nous soulignons que, pour des considdrations d'ordre morphog~n~tique propres aux Pr~gymnospermes (Rhor, 1974; Audran, non publid) et aux Gymnospermes (Willemse, 1971; Dickinson, 1971), le terme de tectum ne devra pas ~tre compris avec la signification qu'il
Fig.4. D~finition des diff~rentes couches et strates du sporoderme de Ginkgo biloba dans le cadre de la terminologie de Faegri (1956) et Faegri et Iversen (1964). Fig.4. Definitions of the different layers and strata of the Ginkgo biloba sporoderm in the terminology of Faegri (1956) and Faegri and Iversen (1964). Structure et terminologie de la paroi sporo-pollinique. R~solutions adopt~es le 7 octobre 1975 ~ Paris, A.P.L.F.
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poss~de chez les Angiospermes (Heslop-Harrison, 1971a) mais au sens plus restrictif que lui donne Reitsma (1970): le tectum ~tant la pattie la plus externe de l'exine. BIBLIOGRAPHIE Audran, J.C., 1969. Contribution ~ l'6tude cytologique de certaines anomalies apparaissant au cours de la formation des t6trades chez que!ques Cycadales. Rev. Cytol. Biol. V6g., 32: 27--36. Audran, J.C. et Masure, E., 1976. Pr6cisions sur l'infrastructure de l'exine chez les Cycadales (Pr4spermaphytes). Pollen Spores, XVIII(1): 5--26. Audran, J.C. et Masure, E., 1977. Contribution ~ la connaissance de la composition des sporodermes chez les Cycadales (Pr6spermaphytes). Etude en microscopie 61ectronique transmission (M.E.T.) et ~ balayage (M. E. B. ). Palaeontographica, 162 : 115--158. Dickinson, H.G., 1971. The role played by sporopollenin in the development of pollen in Pinus banksiana. In: J. Brooks, P.R. Grant, M.D. Muir, V.P. Gizel and G. Shaw (R6dacteurs), Sporopollenin. Academic Press, London, New York, pp.31--65. Erdtman, G., 1965. Pollen and Spore Morphology/Plant Taxonomy--Gymnospermae. Bryophytae. Almquist et Wiksell, Stockholm, 191 pp. Erdtman, G., 1966. A p r o p o s de la stratification de l'exine. Pollen Spores, 8(1 ): 5--7. Erdtman, G., 1972. Pollen and Spore Morphology/Plant Taxonomy--Gymnospermae. Pteridophyta--Bryophyta (illustration). Hafner, New York, 127 pp. Faegri, K., 1956. Recent trends in palynology. Bot. Rev., 9: 639--664. Faegri, K. et Iversen, J., 1964. Text-book of Pollen Analysis. Munksgaard, Copenhagen, 2nd ed., 237 pp. Gullvag, B., 1966. The fine structure of some gymnospermous pollen walls. Grana Palynol., 6: 435--475. Heslop-Harrison, J., 1971a. The pollen wall: structure and development. In: J. HeslopHarrison (R~dacteur), Pollen Development and Physiology, Butterworth, London, pp.75--98. Heslop-Harrison, J., 1971b. Sporopollenin in the biological context. In: J. Brooks, P.R. Grant, M.D. Muir, V.P. Gizel and G. Shaw (R6dacteurs), Sporopollenin. Academic Press, London, New York, pp.2--30. Le Thomas, A. et Lugardon, B., 1976. De la structure grenue ~ la structure columellaire dans le pollen des Annonac6es. Adansonia, 15: 543--572. Masure, E., 1976. Le pollen des Cycadales et des Ginkgoales actuelles. Rapport avec les monocolp6s fossiles. Th~se de sp6cialit~, Paris. Reitsma, T.J., 1970. Suggestion towards unification of descriptive terminology of angiosperm pollen grains. Rev. Palaeobot. Palynol., 10: 39--60. Rhor, R., 1974. Etude cytologique de la microsporog6n~se et de la spermatog6n~se in vitro chez une Gymnosperme (Taxus baccata L.) et une Pr~phan~rogame (Ginkgo biloba L.). Th~se de sp6cialit6, Nancy. Roland, F., 1971. The detailed structure and ultrastructure of an acalymmate tetrad. Grana, 11: 41--44. Rowley, J.R., 1964. Formation of the spore in pollen ofPoa annua. In: H.F. Linskens (R6dacteur), Pollen Physiology and Fertilization. North-Holland, Amsterdam, pp.59--69. Skvarla, J.J. et Larson, D.A., 1963. Nature of cohesion within pollen tetrads of Typha latifolia. Science, 140: 173--175. Skvarla, J.J., Raven, P.H. et Praglowski, J., 1975. The evolution of pollen tetrads in Onagrac~es. Am. J. Bot. 62: 6--35. Ueno, J., 1960a. Studies on pollen grains of Gymnospermae concluding remarks to the relationships between coniferae. J. Inst. Polytech., 11: 190--136. Ueno, J., 1960b. On the fine structure of the cell walls of some gymnosperm pollen. Biol. J. Nara Women's Univ. 10: 19--25.
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© Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam -- Printed in The Netherlands
LA SCULPTURE ET L'INFRASTRUCTURE DU SPORODERME DE GINKGO BILOBA COMPAREES tk CELLES DES ENVELOPPES POLLINIQUES DES CYCADALES
JEAN-CLAUDE A U D R A N ' et EDWIGE MASURE ~
Labratoire de Botanique, U.E.R. Sciences, 51062 Reims CJdex (France) Laboratoire de Micropal$ontologie, U.E.R. Sciences de la Terre, 4, Place Juss&u, 75230 Paris C$dex 05 (France) (Accept~ le 5 juillet, 1977)
ABSTRACT Audran, J.-C. et Masure, E., 1978. La sculpture et l'infrastructure du sporoderme de Ginkgo biloba compar~es ~ celles des enveloppes polliniques des Cycadales. (Sculpture and infrastructure of the Ginkgo biloba sporoderm compared to those of the cycad pollen wall.) Rev. Palaeobot. Palynol., 26: 363--387. The Ginkgo biloba sporoderm, when examined with transmission and scanning electron microscopes, shows a sculpture and a texture which are very different from those observed in cycads. (1) The ornamental units are "rugules" which are evenly dispersed over the pollen grain surface except on the germinal zone which is decorated with " v e r r u c o f d e " components mixed with a few ridges. (2) The exine is composed of a tripartite sexine, the middle zone of which is full of irregular pits, and of a thick and strongly lamellated nexine. RI~SUMI~ Chez le Ginkgo biloba, le sporoderme examin~ en microscopie ~lectronique ~ transmission et ~ balayage poss~de des motifs sculpturaux et une configuration texturale qui se rdv~lent trbs diffdrents de ceux observds chez les Cycadales. (1) Les motifs ~l~mentaires de l'ornementation sont des rugules dispers~es uniform~ment sur le pourtour du grain de pollen ~ l'exception de la zone germinale, d~cor~e d'~i~ments verrucofdes m~l~s ~ quelques rides. (2) L'exine est constitute d'une sexine tripartite dont la zone moyenne est creus~e de cavit~s irr~guli~res et d'une nexine ~paisse, fortement lamellaris~e. INTRODUCTION
Lorsque l'on observe ~ l'~chelle de la microscopie optique des grains de pollen de Cycadales et de G. biloba, recueillis au moment de l'anth~se et
' Les observations en M.E.T. ont ~t~ faites par J.C. Audran, celles en M.E.B. par E. Masure.
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months simplement entre lame et lamelle dans une goutte d'eau, on constate qu'ils apparaissent identiques tant par leur forme, comparable ~ celle de grains d e caf~, que par leurs dimensions. Toutefois, l'analyse de l'ornementation de la surface exinique, ainsi que celle des variations d'~paisseur et de la compacit~ texturale de l'exine, permet ~ un observateur attentif et exp~riment~ de diff~rencier ces deux types de grains de pollen. Ce qui precede conduit, t o u t naturellement, h s'interroger sur la nature exacte de l'organisation morphologique et topographique des enveloppes polliniques, et plus particuli~rement de l'exine, des grains de pollen des Pr~spermaphytes; probl~mes qui demeurent hors du champs d'investigation de la microscopie optique du fait m~me des limites impos~es par la finesse des structures ~ analyser et ~ comparer. Deux hypotheses sont alors envisager: -- soit que le sporoderme des Pr~spermaphytes est b~ti sur un m~me schema, c o m m e semble le sugg~rer l'identit~ morphologique de ces grains de pollen, et, dans ce cas, les l~g~res differences qui permettent leur reconnaissance ne seraient que de simples variations compos~es sur un th~me commun; -- soit, au contraire, qu'il se pr~sente avec une architecture diff~rente selon qu'il appartient au pollen des Cycadales et des Ginkgoales, ce que pourraient traduire alors les quelques differences entrevues; dans ce dernier cas, la forme similaire qu'affectent ces grains de pollen ne serait qu'une simple convergence. Qu'en est-il r~ellement? C'est pour repondre a cette question que nous rapportons ici les r~sultats et les conclusions auxquels nous sommes parvenus apr~s analyse, ~ l'~chelle de la microscopie ~lectronique, du sporoderme de G. biloba. MI~THODOLOGIE
Materiel. Les grains de pollen de G. biloba ont ~t~ recueillis au m o m e n t de l'anth~se sur un arbre se d~veloppant dans les jardins du Museum d'Histoires Naturelles de Paris. Techniques. Les protocoles techniques sont identiques ~ ceux que nous avons employ~s dans un travail ant~rieur pour l'~tude en microscopie ~lectronique des sporodermes de quelques Cycadales (Audran et Masure, 1976, 1977). Terminologie. Afin de pouvoir comparer nos r~sultats ~ ceux de nos pr~d~cesseurs, ainsi qu'~ ceux que nous avons recueillis chez les Cycadales, la qualification des diff~rents niveaux du sporoderme du G. biloba se fera dans le cadre de la terminologie d~finie par Erdtman (1966). Toutefois, cette terminologie sera simplifi~e ~ ses termes principaux de mani~re ~ ~viter toute ambiguitY. Ainsi, pour l'exine, elle sera r~duite aux termes essentiels suivants: sexine et nexine, auxquels nous adjoindrons un chiffre arabe ou une lettre pour d~finir leurs subdivisions (Fig.3a).
365 HISTORIQUE Les donn~es concernant la composition ornementale et structurale du sporoderme du G. biloba sont peu nombreuses. Elles proviennent essentiellement d'observations faites en microscopie optique (cf.revues de Wodehouse, 1935; d'Erdtman, 1965, 1972; et de Masure, 1976), desquelles il ressort que les grains de pollen d~shydrat~s sont morphologiquement similaires ~ ceux des Cycadales. Toutefois, la sexine plus ~paisse que la nexine, apparait de texture plus compacte que celle des Cycadales. En microscopie ~lectronique, Ueno (1960b) d~crit, sur des coupes ultrafines de grains de pollen non ac6tolys~s, la structure de l'exine de G. biloba. I1 montre ainsi, apr~s avoir rappel~ la ressemblance morphologique des pollens secs du G. biloba ~ ceux des Cycadales, que la sexine "consists of a system of densely crowded bodies, 1.2 to 2.0 pm thick, gradually merging into the remarkable structure of the sexine". La sexine est ~pineuse. L'auteur conclut en soul:gnant que la sexine du G. biloba est tr~s diff~rente de celle du Cycas. De m~me, Yamazaki et Takeoka (1962), ~ l'aide de r~pliques au carbone, ont pu montrer que l'ornementation de l'exine est tr6s diff6rente de celle des Cycadales et consiste sur la face distale en de petites rides irr~guli6res, hautes de 0,1 ~ 0,2 pm auxquelles se m~lent, sur la zone aperturale, des ornementations verrucoi'des. Enfin, en 1974, Rhor analyse bri~vement les modalit~s de la g~n~se des enveloppes polliniques du G. biloba. En ce qui concerne l'infrastructure du sporoderme du pollen mfir, cet auteur rapporte, en plus des faits precedents, les pr~cisions suivantes: -- la sexine d6veloppe consid~rablement son 6paisseur aux d~pens de la r6gion "columellaire" qui n'est plus repr~sent~e que par de larges piliers bordant des tunnels parfois reli~s ~ l'ext~rieur; la surface de la sexine et les cavit~s de la "bacula" sont recouvertes par une pellicule tr~s fine, de densit~ diff~rente et de nature imprecise; la sporopoll~nine de la sexine a un aspect finemerit granuleux et homog~ne dans route son ~paisseur; la nexine est de structure lamellaire; l'intine apparai't comme une couche claire de faible ~paisseur; -- enfin, au niveau du sillon germinal l'exine ne serait plus constitute que par la nexine et la "foot layer", le tectum et la "bacula" ayant disparu. -
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RESULTATS Apr6s avoir bri~vement rappel6 qu'elles sont les caract~ristiques des grains de pollen du G. biloba, observes en microscopie optique (M.O.), nous d~crirons successivement l'ornementation de la surface de l'exine teUe qu'elle se r6v~le en microscopie 61ectronique ~ balayage (M.E.B.), puis l'organisation structurale du sporoderme telle qu'elle apparm~t sur des coupes ultrafines analys6es en microscopie ~lectronique ~ transmission (M.E.T.) et sur des fractureg observ~es en M.E.B.
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367 I. G ~ n ~ r a l i t ~ s L e s g r a i n s d e p o l l e n t u r g e s c e n t s o n t u n e f o r m e s u b s p h ~ r i q u e ( P l a n c h e I, 1). Au cours de la d~shydratation, l'aire germinative, de plus faible rdsistance et s u b e l l i p t i q u e , s ' e f f o n d r e e n i n d u i s a n t la f o r m e c l a s s i q u e d e s m o n o s u l q u d s ( P l a n c h e I, 2 ) . E n t r e l e s d e u x f o r m e s i d d a l e s , l a s p h e r e e t l ' e l l i p s o f d e ,
E X P L I C A T I O N S DES P L A N C H E S Techniques: M.O. : pollen non a c d t o l y s ~ - Planche I, 1--3; M.E.B.: pollen non ac~tolys~ -- Planche I, 4--5, Planche II, 1--8; M.E.T.: pollen non ac~tolys~, fix~ par le G l u t / O s O 4 et contrast~ par le KMnO 4 - - Planches III--VI. Abr$viations: C = c6t~; Ca = cavitd; CP = cellule prothallienne; CR = cellule reproductrice; C T = cellule t u b e ; I = intine; La = lamellarisation; L = l~vres du sillon; N = nexine; P D = p a l e distal; PE = p o n t exinique; PG = p a l e germinal; PP = p a l e p r o x i m a l ; S = sexine; S I = sexine I; S H = sexine II: S I I I = sexine III.
EXPLANATIONS OF PLATES Me thods: O.M.: non-acetolysed pollen grains -- Plate I, 1--3; B.E.M.: non-acetolysed pollen grains - - P l a t e I, 4--5, Plate II, 1--8; T.E.M. : non-acetolysed pollen grains, fixed by G l u t / O s O 4 and c o n t r a s t e d by KMnO 4 - - Plates III--VI. L i s t o f abbreviations: C = side; Ca = pit; CP = prothallial cell; CR = generative cell; C T = t u b e cell; I = intine; La = lamellation; L = edges of furrow; N = nexine; P D = distal pole; P E = bridge of exine; P G = germinal pole; PP = proximal pole; S = sexine; S I = sexine I; S / / = sexine II; S I I I = sexine III.
PLANCHE I 1. Pollen turgescent en vue longitudinale en bout. R e m a r q u e r les variations d'~paisseur de l'exine sur le p o u r t o u r du grain de pollen. × 1000. 2. Pollen d~shydrat~; r e m a r q u e r les l~vres e x t e r n e s festonn~es du sulcus. × 1000. 3. Pollen ~ c o n t o u r et sulcus subpolygonals. × 1000. 4. Vue polaire distal~ d ' u n grain d o n t les l~vres du sulcus se rejoignent. × 2000. 5. Vue polaire distale d ' u n grain, x 1500. 6. D~tail de l ' o r n e m e n t a t i o n . Crates courtes et serr~es. × 10.000. 7. D~tail de I ' o r n e m e n t a t i o n . Crates allong~es et dispers~es. × 10.000. 8. D~tail de l ' o r n e m e n t a t i o n aperturale (~l~ments verrucofdes) et structure de l'exine au niveau du sulcus. × 10.000. 9. D~tall de l ' o r n e m e n t a t i o n aperturale; ~l~ments verrucofdes plus riches. X 5000. PLATE
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1. Turgescent pollen grain seen in longitudinal view. Notice the variation o f the sexine thickness around the pollen grain. × 1000. 2. Deshydrated pollen grain; notice the o u t e r scalloped edge o f sulcus. × 1000. 3. S u b p o l y g o n a l c o n t o u r o f pollen grain and sulcus. X 1000. 4. Polar distal view o f a pollen grain whose sulcus edges are contiguous. X 2000. 5. Polar distal view o f a pollen grain. × 1500. 6. Detail o f the o r n a m e n t a t i o n . S h o r t crests closely, packed together, x 10,000. 7. Detail o f the o r n a m e n t a t i o n . Long and dispersed crests, x 10,000. 8. Detail o f the apertural o r n a m e n t a t i o n and exine structure at the sulcus level. × 10,000. 9. Detail o f the apertural o r n a m e n t a t i o n , x 5000.
368 existent une multitude d'interm~diaires d~form~s. A l'extr~me, certains pollens pr~sentent un contour polygonal ~ angles arrondis (Planche I, 3). G~n~ralement, les extr~mit~s de l'ellipse sont aigu~s, mais peuvent s'arrondir. Les mesures effectu~es sur 200 grains ont donn~ les r~sultats suivants: L = 25 t~m (33 pm) 47 p m ; l = 17 t~m (24,5 pm) 33 gm. Modes L = 35 um, l ~ 22 tzm. R a p p o r t L/l = 1,3. Au niveau du pSle proximal, l'exine mesure I pm. Au sommet des faces lat~rales, elle s'~largit jusqu'~ 1,5 pm, pour s'amincir consid~rablement au niveau du pSle v~g~tatif et atteindre 0,3--0,5 pm. L'~paississement de l'exine au sommet des faces lat~rales se traduit en vue polaire distale par un bourrelet festonn~ qui souligne le sulcus (Planche I, 2). II. La sculpture exinique Le relief de la surface exinique qui caract~rise les r~gions extracolpales diff~re tr~s nettement de celui correspondant ~ la r~gion germinale. L 'ornementation du pSle proximal et des faces lat~rales Les clich6s (Planche I, 4,5) montrent que les motifs 616mentaires de l'ornementation sont des crfites ou rugules ~ relief aigu d61imit6es par une forte rupture de pente. Ces crfites se dispersent uniform6ment sur le pourtour du grain de pollen. Deux types d'ornementation fond6s sur les variations de l'allongement des crfites ont 6t6 r6pertori6s. Certains grains de pollen pr6sentent des crates courtes et serr6es (Planche I, 6), tandis que d'autres poss6dent des crates plus longues et espac~es. (Planche I, 7). L 'ornementation de l'aire germinative L'aire aperturale est orn6e d'616ments verrucofdes dont la forme peut varier (Planche I, 8) m~16s quelquefois $ des rides (Planche I, 9). III. Structure et stratification des enveloppes polliniques Nous rapporterons t o u t d'abord, les r6sultats acquis sur des grains de pollen normalement conform6s, puis ceux recueillis sur certaines structures polliniques aberrantes que nous avons eu l'occasion de rencontrer, toujours en petit nombre, durant nos observations. Le sporoderme des grains de pollen normaux Nos r~sultats ont ~t~ obtenus essentiellement sur des grains de pollen non ac~tolys~s, nous les compl~terons par quelques donn~es acquises sur des grains de pollen ac~tolys~s.
369
(a) Pollen non ac$tolysb L'exine. La coupe axiale d'un grain de pollen examin6 en M.E.B., montre n e t t e m e n t les variations d'6paisseur de l'exine, particuli6rement l'6paississement de celle-ci au niveau des 16vres du sillon (Planche II, 1). En M.E.T., sur coupe ultrafine, cette exine apparai't d'embl6e compos6e de deux couches (Planche III, 1). L'une externe, h6t6rog6ne et de forte densit6, la sexine, et l'autre interne, d'apparence homog6ne et de plus faible densit6 correspondant ~ la nexine. D6crivons les successivement telles qu'elles se pr6sentent tout d'abord sur la base prothallienne et les faces lat6rales du grain de pollen o5 eUes sont les plus complexes, puis au pale germinal oO elles se simplifient.
(1) Structure de l'exine sur la base prothallienne et les cSt~s du grain de pollen. La sexine. Elle se r~v~le constitute de trois strates (Planche II, 2; Planche III, 2): -- l'une externe, la sexine I, de texture homog~ne et dont l'~paisseur relativement importante n'est pas constante. Elle ~met vers l'ext~rieur de petites projections en forme d'~pines, de taille variable et qui conf~rent ~ son profil un aspect en dents de scie. Remarquons ~ ce propos, que le relief exinique peut ~tre selon les grains de pollen, soit tr~s accuse, soit plus ou moins f o r t e m e n t ~mouss~ (Planche III, 3--4). une strate moyenne, la sexine II, qui, en coupe axiale, apparai't compos~e de piliers. Ceux-ci, de taille et de forme irr~guli~res sont en continuit~ avec la sexine I. Ils d~limitent des cavit~s d'aspect tr~s variable pouvant communiquer avec l'ext~rieur par des interruptions plus ou moins localis~es de la sexine (Planche II, 8; Planche III, 5). Sur des coupes tangentielles, on constate que les piliers sont, en fair, la trace de cloisons dispos~es perpendiculairement la surface de l'exine et dessinant un r~seau grossier (Planche IV, 1). enfin, une strate interne, la sexine III (Planche III, 2--5) en continuit~ avec la base des cloisons de la sexine II et reposant sur la nexine. Cette strate est g~n~ralement mince, mais elle peut, localement, acqu~rir un fort d~veloppement. La nexine. On distingue: une zone transparente aux ~lectrons et d'~paisseur uniforme qui limite ext~rieurement la nexine. C'est sur elle que repose la sexine III (Planche IV, 2). une strate interne (nexine B) d'apparence homog~ne et dans laquelle on observe des syst~mes lamellaires tout ~ fait comparables ~ ceux d~crits dans la nexine des Cycadales (Planche IV, 3). Cette configuration de l'exine se transforme localement dans la zone de passage c5t~-pSle germinal par: une augmentation importante du volume des cavit~s de la sexine II (Planche II, 2; Planche IV, 4--5; Planche V, 1); et un d~veloppement considerable de la nexine qui apparaft enti~rement constitu~e de longs syst~mes de lamelles dispos~es parall~lement les unes aux autres (Planche IV, 4--5; Planche V. 1 }. -
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371 Par c o n t r e , l ' e x i n e ne se m o d i f i e pas dans la z o n e de passage base-cbt~, c o m m e c ' e s t le cas d~j~ d~crit chez les Cycadales. (2) S t r u c t u r e de l ' e x i n e au pble germinal
La sexine. Elle est r~duite ~ sa strate externe, sexine I, qui repose ainsi d i r e c t e m e n t sur la nexine. C e t t e strate, d'ailleurs, s'est f o r t e m e n t amincie et se r~v~le c o n s t i t u t e par la j u x t a p o s i t i o n de petits amas arrondis ext6rieurem e n t (Planche II, 6; P l a n c h e V, 1). La nexine. Elle a p p a r a f t avec la m ~ m e c o n f o r m a t i o n que sur la base et les cbt~s, et f o r m e d o n c , d u fait de l ' a m i n c i s s e m e n t de la sexine, l'essentiel de l ' e x i n e au pble germinal (Planche III, 1; Planche V, 1).
L'intine. Elle est d'~paisseur r e l a t i v e m e n t c o n s t a n t e sur le p o u r t o u r d u grain de pollen, sauf au pble germinal off elle s'~paissit q u e l q u e peu. Elle se r~v~le t r a n s p a r e n t e a u x ~lectrons et de t e x t u r e h o m o g ~ n e sur l ' e n s e m b l e de son ~paisseur (Planche III, 1). Les parois s q u e l e t t i q u e s des ceUules r e p r o d u c t r i c e et p r o t h a l l i e n n e se r a t t a c h e n t i n d ~ p e n d a m m e n t ~ l ' i n t i n e situ~e sur la partie inf~rieure des faces lat~rales.
(b ) Pollen ac~tolys~ Apr~s ac~tolyse, le s p o r o d e r m e se t r o u v e r~duit ~ son exine, l'intine ~tant t o t a l e m e n t d~truite quelle que soit sa p o s i t i o n sur le p o u r t o u r d u pollen. L ' e m p l o i de l ' a c ~ t o l y s e m~nag~e ne f o u r n i t pas d ' i n d i c a t i o n s nouvelles. PLANCHE II 1. Coupe axiale. Remarquer les variations d'~paisseur de l'exine. × 4000. 2. D4tail de la structure de l'exine au sommet des faces lat~rales ou l~vres du sillon. × 10.000. 3. D~tail de la structure de l'exine au niveau de l'aire germinative. × 10.000. 4. Grain de pollen assoei~s en t~trade. Remarquer les points exiniques qui les relient (fl~ehes). X 1500. 5. D~tail de l'ornementation d'un grain de pollen anormal. X 5000. 6. D~tail de la structure de l'exine au niveau du sillon. Remarquer les interruptions de la sexine I et la nexine. × 10.000. 7. Pollen anormal en vue polaire distale. × 2000. 8. D~tail de l'architecture exinique au sommet des faces lat~rales. X 15.000. PLATE II 1. Axial section. Notice the variations of the exine thickness. × 4000.
2. Detail of the exine structure at the edge of the furrow. × 10,000. 3. Detail of exine structure in the germinal zone. × 10,000. 4. Pollen grain associated in a tetrad. Notice the exine bridges (arrows). × 1500. 5. Detail of the ornamentation of a pollen grain. × 5000. 6. Detail of the exine structure at the furrow level. Notice the interruption of the sexine I and the nexine. × 10,000. 7. Abnormal pollen grain seen in polar distal view. × 2000. 8. Detail of the exine structure at the top of lateral faces. × 15,000.
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PLANCHE III
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La configuration de la sexine demeure inchang~e, par contre les syst~mes lamellaires de la nexine sont rendus plus accessibles &l'observation. Soulignons que la prise " d u colorant" de la M.E. sur les exines ac~tolys~es se fait tr~s mal. Malgr~ cela, la sexine se r~v~le toujours plus contrast~e que la nexine.
Le sporoderme de quelques grains de pollen aberrants Les formations polliniques aberrantes les plus fr~quemment observ~es peuvent ~tre r~unies en deux types.
(a) Grains de pollen associ$s en t~trade La photo prise en M.E.B. fournit un excellent exemple de grains de pollen group,s par quatre (Planche II, 4). On constate que ces grains de pollen dont les faces germinales sont tourn~es vers l'ext~rieur, sont associ~s dans la position qu'ils poss~daient initialement dans la t~trade, dont ils sont issus. Ils sont r~unis les uns aux autres par des ponts exiniques dont le nombre et l'importance sont variables. Par ailleurs, la sculpture (Planche II, 5) de l'exine de ces pollens se r~v~le tr~s ~mouss~e et apparaft, de ce fait, tr~s diff~rente de celle d~crite pour les grains de pollen normaux. Sur les coupes ultrafines pratiqu~es sur ces constructions polliniques, on remarque que la disposition g~n~rale des constituants du sporoderme n'est pas modifi~e (Planche V, 2--3). La stratification, la structure et la texture des diff~rents niveaux exiniques, en particulier, sont similaires ~ celles observ~es dans l'exine des grains de pollen de constitution normale. Sur ces images, la nature des jonctions ~tablies entre les diff~rents grains de pollen devient apparente. Ces liaisons dont les photos fournissent quelques uns des n o m b r e u x aspects qu'elles peuvent affecter, sont constitutes par la PLANCHE III 1.
Coupe axiale. Noter la forte r~duction de l'exine au p61e germinal et sa compacit~ sur l'ensemble du pourtour du grain de pollen. X 6000. 2. Sporodermes des faces lat~rales. La sexine et la nexine sont nettement individualis~es. La face externe de la sexine est h~riss~e d'ornements aigus. X 22.000. 3--4. Deux aspects des variations du relief ornemental (fl~ches). × 11.000. 5. Sporoderme des faces lat~rales. Les cavit~s de la sexine communiquent avec l'ext~rieur par de fins canalicules (fl~ches). x 22.000. PLATE III 1.
Axial section. Notice the strong decrease of the exine in the germinal zone and its compactness around the pollen grain, x 6000. 2. Sporoderms of the lateral faces. The sexine and the nexine are clearly identified. The external face of the sexine bristles with sharp ornaments. × 22,000. 3--4. Two views of ornamental relief variations, x 11,000. 5. Sporoderm of the lateral faces. The sexine pits communicate with the outside by small canalicules, x 22,000.
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sexine et plus particuli~rement la sexine I (Planche V, 2--3). Ces portions de sexine mises en c o m m u n entre les grains de pollen adjacents d~terminent ainsi une cohesion extr~mement rigide de l'ensemble des grains de pollen associ~s. Enfin, nous noterons aussi le caract~re estomp~ des pro~minences de la surface exinique (Planche V, 3).
(b ) Grains de pollen pr~sentant une malformation texturale et structurale de l'exine Commentons les deux aspects que nous avons observ6s et qui sont respectivement illustr6s par les figures 1, 2 et 3 de la Planche VI. Premier aspect (Planche VI, 1). Sur ce grain de pollen, l'exine apparai't dans son ensemble pros de deux fois plus @aisse qu'une exine normale. La sexine et la nexine sont toujours bien identifiables mais avec les differences suivantes: La sexine: Elle est une fois et demi plus ~paisse que dans le grain de pollen normal et se r~v~le tr~s compacte. Elle apparai't sur les coupes ultrafines, c o m m e compos~e de blocs de sporopoll~nine de taille et de forme irr~guli~res, tass6s plus ou moins fortement les uns contre les autres selon leur position stratigraphique. Les diff6rentes strates de la sexine d~crites pr~c~demment sont encore d~celables, bien que tr~s modifi~es. Sexine I: elle forme une strate compacte, aux limites irr~guli~res. Sa surface pr~sente un profil tr~s tourment~ off l'on observe encore quelques rares pro~minences ~pineuses. La sculpture de ce pollen doit ~tre fortement perturb~e. Sexine II: le volume des cavit6s constituant ce niveau est r6duit ~ l'extr~me et celles-ci apparaissent sous la forme de fins canalicules. Sexine III: elle est fragmentaire et de faible @aisseur. La nexine est pros de quatre fois plus ~paisse que la normale et sa texture est relativement homog~ne. Les syst~mes lamellaires y sont plus rares. PLANCHE IV 1.
Coupe orient6e parall~lement ~ la surface du grain de pollen. Les cloisons limitant les cavit6s de la sexine dessinent un r~seau grossier, x 22.000. 2--3. Sporodermes des faces lat4rales. La nexine est s~par6e de la sexine par une fine ligne blanche (fl~ches). Des lignes blanches identiques sont aussi observables au sein de la nexine (fl~ches doubles). X 11.000. 4--5. Sporodermes de la zone de passage c6t6---pSle germinal. Coupes axiale et subtangentielle montrant le fort d6veloppement des cavit4s de la sexine et l'importante lamellarisation de la nexine. X 22.000. PLATE IV 1. Subtangential section. The walls of the sexine pits form a coarse network, x 22,000. 2--3. Sporoderm of lateral faces. The nexine is separated from the sexine by a thin white line (arrows). Identical white lines are also observed in the nexine (double arrows). X 11,000. 4--5. Sporoderms of the edge of the furrow. Axial and subtangential sections showing the strong development of the sexine pits and the large lamellated nexine, x 22,000.
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Deuxi~me aspect (Planche VI, 2, 3). Dans ce deuxi~me type, la configuration g~n~rale de l'exine se r~v~le d'embl~e inhabituelle. Comme dans le cas pr~c~demment d~crit, la nexine est @aisse et relativement homog~ne. Par contre, la sexine est b~tie sur un module tr~s different dont la sexine I constitue la partie la plus importante. Celle-ci est en effet compos~e par l'alternance de r~gions, d'~tendues variables, peu ~paisses, au relief moutonn~ et de zones fortement saillantes, en forme de d6me et dont les dimentions limit~es sont relativement homog~nes sur l'ensemble du grain de pollen. Sous la sexine I, on observe une tr~s fine sexine II dont les cloisons en continuit~ avec la sexine I semblent par endroit reposer directement sur la nexine. C'est qu'en effet, la sexine III est irr~guli~rement d~velopp~e, voire souvent inexistante (Planche VI, 2). En conclusion, l'ensemble des r~sultats que nous venons d'acqu~rir sur l'organisation du sporoderme de G. biloba permet d~s maintenant: -- de d~finir la disposition infrastructurale et la configuration texturale des diff~rentes enveloppes polliniques c onstitutives ( Fig. 1 ); -- d'~tablir les relations entre l'ornementation superfici~lle de l'exine et son infrastructure sous-jacente (Fig.2). DISCUSSION
I. Confrontations de nos rdsultats & ceux de nos pr~decesseurs Selon Ueno (1960a) l'ornementation superficielle de l'exine serait de type ~pineux. Cette m~prise vient du fait que cet auteur n'a pu ~tudier que des coupes ultrafines sur lesquelles effectivement, c o m m e le montrent aussi nos ~lectronographies, l'image du relief exinique apparaft bien sous l'aspect d'une s~rie de pointes. En r~alit~, l'emploi du M.E.B. r~v~le que ces projections ~pineuses repr~sentent les coupes de rides ou crates dispos~es irr~guli~rement sur l'exine. Nos r~sultats concordent donc avec ceux de Yamazaki et Takeoka (1962) obtenus par la m~thode des empreintes. Par ailleurs, ils les PLANCHE V 1.
Modification de la structure e x i n i q u e dans la zone de passage c6t~--sillon germinal. Au niveau du p61e germinal, la sexine est r~duite & sa strate externe, x 35.000. 2--3. Grains de pollen group4s en t~trade. Seule la strate e x t e r n e de la sexine c o n t r i b u e & la f o r m a t i o n des p o n t s exiniques reliant les grains de pollen entre eux. L ' o r n e m e n t a tion de ces grains de pollen est faiblement d~velopp4e (fl~ches). x 7000. PLATE V 1.
Modification o f the exine structure at the edge of the furrow. At the germinal zone, the sexine is reduced to its external stratum. X 35,000. 2--3. Pollen grains associated in a tetrad. The external stratum of the sexine alone contributes to the f o r m a t i o n of exine bridges. The o r n a m e n t a t i o n of this pollen grain is p o o r l y developed (arrows). × 7000.
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® @ Fig.1. Repr6sentation semi-sch~matique d'une coupe radiale du sporoderme du grain de pollen de Ginkgo biloba, vue en microscopie ~lectronique ~ transmission. Fig.1. Diagrammatic representation of a radial section of a Ginkgo biloba sporoderm pollen grain seen by transmission electron microscopy.
compl~tent car nous avons d6cel6 sur les ~chantillons de pollen analys6s une double variation morphologique du motif ornemental affectant la longueur et l'importance du relief des rugules. Pourquoi de telles modifications? Si les causes [probablement d'ordre g~n~tique (Heslop-Harrison, 1971b)] modifiant PLANCHE VI 1.
Exine aberrante dont la sexine apparaft compos6e de granules de sporopoll6nine dens(!ment agglom6r6s (fl6ches). × 16.000. 2--3. Exine aberrante. L'ornementation de la surface pollinique est totalement modifi6e. X 25.000 et X 11.000. PLATE VI Abnormal exine whose sexine is composed of densely packed sporopollenin granules (arrows). X 16,000. 2--3. Abnormal exines. The ornamentation of the exine surface is totally modified. X 25,000 and × 11,000. 1.
380 sillon
qerminal
M. E. T.
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Fig.2. R e l a t i o n s e n t r e l ' o r n e m e n t a t i o n et F i n f r a s t r u c t u r e sous-jacente d e l ' e x i n e d u p o l l e n de Ginkgo biloba (N = n e x i n e ; S = sexine). Fig.2. R e l a t i o n s b e t w e e n t h e o r n a m e n t a t i o n a n d t h e u n d e r l y i n g i n f r a s t r u c t u r e o f t h e e x i n e o f t h e Ginkgo biloba p o l l e n grain ( N = n e x i n e ; S = sexine).
la densit~ de la r~partition et la longueur des crates sont difficilement pr~hensibles, celles entrai'nant le caracthre ~mouss~ du relief exinique d'un certain pourcentage de grains de pollen dans les lots examines, peuvent trouver un d~but d'explication. En effet, chez G. biloba (Rhor, 1974), ~ l'inverse de ce que nous avons pu observer chez les Cycadales (Audran, non publiC), l'exine ne s'41abore pas en totalitd au sein de la t~trade. La sculpture exinique, en particulier, n'apparai't, d'apr~s les images fournies par l'auteur, que sur les grains de pollen; les microspores n'ayant qu'une ~bauche d'ornementation. On peut donc valablement avancer que les grains de pollen ornementation r~duite ne sont que des microspores ayant cess~, pour une cause ignor~e, d'~voluer. On remarquera ~ ce propos, que les ~difices polliniques group,s en t~trades et provenant sans doute, c o m m e chez les Cycadales, d'une anomalie du d4roulement des mitoses m~iotiques (Audran,
381 1969), sont caract~ris~s aussi par une ornementation ~ peine marquee. Ces groupements aberrants au sein du pollen de G. biloba s'apparentent aux t~trades acalymm~es d~finies par Van Campo et Guinet (1961) et Roland (1971). La cohesion de ces ensembles est assur~e, c o m m e cela a ~t~ aussi rapport~ pour les t~trades polliniques de Typha latifolia (Skvarla et Larson 1963), et de certaines Onagrac~es (Skvarla et al., 1975), par des r~gions d'importance variable de la couche externe de l'exine mises en c o m m u n entre les monades contigiies. En ce qui concerne l'infrastructure et la texture des enveloppes polliniques du G. biloba nos r~sultats: -- s'opposent ~ ceux de Ueno (1960b) sur les deux points suivants: Selon cet auteur, la sexine serait constitute par: "A system of densely crowded bodies" et poss~derait ainsi une texture grenue iVan Campo et Lugardon, 1973). Les images que nous fournissons ainsi que celles de Rhor {1974) m o n t r e n t au contraire que la sexine est constitute d'une substance homog~ne se subdivisant en trois niveauxo Toutefois, nous avons observ~ quelques grains de pollen d o n t l'exine, de construction aberrante, poss~dait une sexine effectivement b~tie c o m m e le d~crit Ueno. Une telle disposition de la zone m o y e n n e de l'exine ~voque la texture infratectale grenue Observ~e par Le Thomas et Lugardon (1976) chez certaines Annonac~es. L'apparition de cette texture infratectale grenue sur un pollen o~ elle n'existe pas normalement souligne le caract~re versatile des processus morphog~n~tiques ~ l'origine des principales couches de l'exine. Par ailleurs, ces granules formant la sexine se m~leraient intimement ~ la nexine. Or, sur nos ~lectronographies, sexine et nexine forment deux ensembles n e t t e m e n t tranch~s, tant sur le plan structural (texture homog~ne et lamellaire) que sur celui de la densit~ aux ~lectrons; la sexine ~tant plus dense que la nexine. s'accordent avec ceux de R h o r (1974). N~anmoins l'interpr~tation que nous donnons de la structure de l'exine sur la zone germinale diff~re de cet auteur. En effet, nous consid~rons que la partie de la sexine qui subsiste sur le sillon, correspond ~ la sexine I e t non ~ la sexine II (nomm~e " f o o t layer" par Rhor). Pour justifier notre position, nous avancerons les arguments suivants: Le premier est d'ordre morphologique. En effet, l'ornementation de cette surface exinique est constitute en partie des m~mes ~l~ments sculpturaux que celle des r~gions intercolpales; Le second est d'ordre morphog~n~tique. Si, c o m m e le d~crit Rhor, la " f o o t layer" (sexine III) se forme ~ partir de la base des bacules selon le m~me principe que celui qui preside ~ la formation du m~me niveau du sporoderme des Spermaphytes, nous concevons real sa presence sur le sillon 1~ ot~ justement, les bacules sont absentes. Comme nous, Ueno admet que c'est l'ectosexine (sexine I selon notre terminologie) qui recouvre, avec la nexine, le sillon. Enfin, il est ~ noter qu'aucun des auteurs precedents n'a signal~ la transformation structurale de la nexine dans la zone de passage cSte--sommet -
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382
qui confute pourtant ~ celle-ci une configuration tr~s originale et qui n'est pas sans ~voquer la structure de la nexine localis~e autour du pore des grains de pollen de Poa annua, dans les jeunes stades de sa formation (Rowley, 1964). II. Comparaison de la sculpture et de la structure du sporoderme du G. biloba celle du sporoderme des cycadales (a) Lorsque l'on compare les coupes pratiqu~es dans un sporoderme de Cycadale (cf. Audran et Masure 1976) ~ celles pratiqu~es au m~me endroit dans le sporoderme du G. biloba (Fig.l), on remarque d'embl~e que ceux-ci sont toujours constitu~s de trois couches distinctes: une externe, h~t~rog~ne et de forte ~paisseur qui conf~re ~ l'exine ses principales caract~ristiques. Elle est qualifi~e de sexine. -- une moyenne, plus discrete, homog~ne et lamellaire, nomm~e nexine; Ces deux couches, plus ou moins ac~tor~sistantes, forment l'exine. -- enfin, une interne ac~tosoluble et en contact direct avec le contenu cellulaire du grain de pollen, c'est l'intine. Toutefois, cette ressemblance structurale demeure tr~s superficielle car la texture, la disposition et l'organisation des diff~rents niveaux composant ces couches, et en particulier l'externe, apparaissent fondamentalement diff~rentes. Confrontons les r~sultats obtenus sur la structure de l'exine du pollen de G. biloba ~ ceux ayant permis pr~c~demment de d~finir le schema g~n~ral de la conformation de l'exine des Cycadales (Audran et Masure, 1976). -
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La structure du sporoderme des faces lat~rales ou de la base prothallienne On constate alors, d'embl~e, un certain nombre de differences importantes que nous allons passer maintenant en revue et qui affectent la composition de: La sexine. Elle est essentiellement l'objet de deux modifications qui ~ elles seules opposent l'exine du pollen du G. biloba ~ celle des pollens des Cycadales. Ce sont: l'absence de logettes r~guli~res, qui ici sont remplac~es par des cavit~s de volume r~duit et de c o n t o u r irr~gulier d~finissant un r~seau grossier et formant ainsi une sexine II tr~s compacte. Cette compacit~ de l'exine est encore rehauss~e par la presence d'une sexine fortement d~velopp~e. la presence d'un niveau forme ~ la base de la sexine par la fusion lat~rale des extr~mit~s des murets limitant le r~seau de la sexine II. Hormis le cas du genre Zamia (Audran et Masure, 1977), o~ sur le pSle prothallien du grain de pollen une ~bauche de fusion lat~rale des bases des cloisons des logettes en une strate discontinue a pu ~tre observ~e, une telle sous-couche n'existe pas chez les Cycadales. Cette strate appartient r~ellement ~ la sexine car elle r~agit ~ l'ac~tolyse et aux fixateurs, en particulier le permanganate de potassium, c o m m e le f o n t les sexines I e t II. -
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383 a)
Cycadales
Ginkgoaies
II
,~EX INE
INTINE
~zone/ qerminale
Fig.3. Schemas r~capitulatifs de la composition du sporoderme (a) et de l'organisation des enveloppes pollinique au niveau de la zone germinale (b) chez les Cycadales et le Ginkgo biloba (ZG = zone germinale). Fig.3. Recapitulative diagrams of the sporoderm composition (a) and of the pollen wall organization at the germinal zone level (b) of the cycads and Ginkgo biloba (ZG = germinal zone). De ce fair, la sexine chez les Ginkgoales a p p a r a f t c o m p o s ~ e de trois strates au lieu de d e u x chez les Cycadales (Fig.3a).
La nexine. Les d i f f e r e n c e s y s o n t m o i n s sensibles et l ' o n n o t e r a s i m p l e m e n t : - - sa f o r t e ~paisseur. Par e x e m p l e la n e x i n e d u G. biloba est u n tiers d e fois plus ~paisse que la n e x i n e de Ceratozamia mexicana o u de Dioon edule et elle est d e u x fois plus ~paisse q u e celle de Stangeria paradoxa. son a b o n d a n t e lamellarisation. Les syst~mes lamellaires ~tant ~ la fois plus n o m b r e u x et plus longs. -
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L'intine. Elle a, c o n t r a i r e m e n t ~ celle des Cycadales, u n e ~paisseur u n i f o r m e .
384 L'organisation du sporoderme au niveau de la zone germinale (Fig.3b) Observ~ en microscopie optique ou en microscopie ~lectronique ~ balayage au faible grossissement, le sillon germinal du pollen du G. biloba a une configuration ellipsofdale similaire ~ celui des Cycadales. I1 est en effet situ~ au pSle distal et se d~prime fortement lorsque le pollen est d~shydrat~. Cette ressemblance morphologique cache en fait de profondes differences structurales qui se marquent uniquement au niveau de la conformation de l'exine. On constate en effet que: sur l'ensemble de la r~gion du sillon, la sexine se r~duit ~ sa strate externe, la sexine I. Cette derni~re d'ailleurs, a subi une forte r~duction de son ~paisseur et sa structure est devenue granuleuse; -- la nexine, toujours pr~sente, a une composition et une ~paisseur identiques a celles des regions intercolpales. Donc et contrairement aux Cycadales, la zone germinale du pollen du G. biloba est form~e d'une seule r~gion. Si par son aspect structural, elle rappelle la zone centrale du sulcus des Cycadales, il faut bien falre remarquer et souligner que la couche moyenne, situ~e entre la sexine et l'intine, est de nature diff~rente chez les Cycadales {couche externe de l'intine) et chez les Ginkgoales (nexine) (Fig.3b). -
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Composition du sporoderme au niveau des zones de transition Chez le G. biloba, seule la zone de passage cSte--sommet est n e t t e m e n t marquee, elle correspond aux l~vres du sillon. On remarque que: -- contrairement aux Cycadales, la sexine accroft son ~paisseur. Les cavit~s de la sexine II ~tant particuli~rement bien d~velopp~es; c o m m e chez les Cycadales, mais dans des proportions plus importantes, la nexine d~veloppe sa lamellarisation. -
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(b) L'ornementation apparai't moins complexe que celle des Cycadales, c o m m e chez ces derni~res pourtant on distinguera les deux r~gions suivantes: Les faces lat~rales et dorsales o~ l'ultrarelief apparai't constitu~ de petites crates, rectilignes, dispos~es sans ordre d~fini. Cette sculpture cr~t~e, pr~sentant deux types, est homog~ne pour l'ensemble de ces r~gions. Sur les ultracoupes nous constatons alors que ces rides correspondent ~ des ~l~vations de forme triangulaire de la surface exinique. Ainsi, chez le G. biloba, l'ornementation r~sulte de l'agencement particulier des formations en cr~te. Ce sont ces reliefs qui forment la sculpture de l'exine. Chez les Cycadales au contraire, les ~l~ments essentiels de la sculpture sont les d~pressions d o n t l'importance et surtout la disposition mod~lent la surface exinique. Ce sont ces creux qui contribuent ~ l'ornementation de l'exine (Audran et Masure, 1977). Cette difference est d'ordre morphog~n~tique (Audran, non publiC; Rhor, 1974). La face ventrale o~ l'ornementation est constitute de petites verrues o~ se m~lent parfois des crates similaires ~ celles des r~gions pr~c~dentes. Contrairement aux Cycadales, cette sculpture chez G. biloba n'est pas une
385
~laboration accidentelle, ddpendante d'un quelconque mouvement de l'exine, mais une ornementation r~elle, lide ~ la structure m~me de la sexine I. Enfin, nous noterons que, d'une mani~re gdndrale et du fair de l'~paisseur importante de la sexine I, le relief de la surface pollinique de Ginkgo biloba est sujet ~ moins de modifications que celui des Cycadales. En conclusion et en accord avec Ueno (1960a), nous voudrions rappeler l'importance des differences structurales et sculpturales des exines des pollens des Cycadales et de G. biloba pourtant morphologiquement identiques. Ces divergences confirment que Cycadales et Ginkgoales, bien qu' appartenant ~ un m~me niveau ~volutif, celui des Pr~spermaphytes, repr~sentent deux phylums nettement diff~rents. III. Terminologie Les nombreuses terminologies appliqudes ~ la ddfinition des diffdrentes strates constitutives de l'exine ont ~t~ ~tablies ~ l'aide d'exemples choisis chez les Angiospermes (Van Campo et al., 1965). Leur application aux exines des Prdgymnospermes et des Gymnospermes pose de sdrieux probl~mes (Gullvag, 1966). Toutefois, cela n'apparai't pas impossible ~ condition de d~finir strictement le cadre de leur utilisation. Pour cela nous nous rdf~rerons aux rdsolutions rdcentes (1975) prises ~ ce sujet au cours d'un symposium organisd par I'A.P.L.F. 1 . Aussi, compte tenu des r~sultats acquis prdc~demment il apparaft, ~ l'inverse des Cycadales (Audran et Masure, 1977), que la terminologie de Faegri (1956) et Faegri et Iversen {1964) se rdv~le la mieux adaptde ~ la ddfinition de la stratification des exines de G. biloba (Fig.4). A c e propos, nous soulignons que, pour des considdrations d'ordre morphog~n~tique propres aux Pr~gymnospermes (Rhor, 1974; Audran, non publid) et aux Gymnospermes (Willemse, 1971; Dickinson, 1971), le terme de tectum ne devra pas ~tre compris avec la signification qu'il
Fig.4. D~finition des diff~rentes couches et strates du sporoderme de Ginkgo biloba dans le cadre de la terminologie de Faegri (1956) et Faegri et Iversen (1964). Fig.4. Definitions of the different layers and strata of the Ginkgo biloba sporoderm in the terminology of Faegri (1956) and Faegri and Iversen (1964). Structure et terminologie de la paroi sporo-pollinique. R~solutions adopt~es le 7 octobre 1975 ~ Paris, A.P.L.F.
386
poss~de chez les Angiospermes (Heslop-Harrison, 1971a) mais au sens plus restrictif que lui donne Reitsma (1970): le tectum ~tant la pattie la plus externe de l'exine. BIBLIOGRAPHIE Audran, J.C., 1969. Contribution ~ l'6tude cytologique de certaines anomalies apparaissant au cours de la formation des t6trades chez que!ques Cycadales. Rev. Cytol. Biol. V6g., 32: 27--36. Audran, J.C. et Masure, E., 1976. Pr6cisions sur l'infrastructure de l'exine chez les Cycadales (Pr4spermaphytes). Pollen Spores, XVIII(1): 5--26. Audran, J.C. et Masure, E., 1977. Contribution ~ la connaissance de la composition des sporodermes chez les Cycadales (Pr6spermaphytes). Etude en microscopie 61ectronique transmission (M.E.T.) et ~ balayage (M. E. B. ). Palaeontographica, 162 : 115--158. Dickinson, H.G., 1971. The role played by sporopollenin in the development of pollen in Pinus banksiana. In: J. Brooks, P.R. Grant, M.D. Muir, V.P. Gizel and G. Shaw (R6dacteurs), Sporopollenin. Academic Press, London, New York, pp.31--65. Erdtman, G., 1965. Pollen and Spore Morphology/Plant Taxonomy--Gymnospermae. Bryophytae. Almquist et Wiksell, Stockholm, 191 pp. Erdtman, G., 1966. A p r o p o s de la stratification de l'exine. Pollen Spores, 8(1 ): 5--7. Erdtman, G., 1972. Pollen and Spore Morphology/Plant Taxonomy--Gymnospermae. Pteridophyta--Bryophyta (illustration). Hafner, New York, 127 pp. Faegri, K., 1956. Recent trends in palynology. Bot. Rev., 9: 639--664. Faegri, K. et Iversen, J., 1964. Text-book of Pollen Analysis. Munksgaard, Copenhagen, 2nd ed., 237 pp. Gullvag, B., 1966. The fine structure of some gymnospermous pollen walls. Grana Palynol., 6: 435--475. Heslop-Harrison, J., 1971a. The pollen wall: structure and development. In: J. HeslopHarrison (R~dacteur), Pollen Development and Physiology, Butterworth, London, pp.75--98. Heslop-Harrison, J., 1971b. Sporopollenin in the biological context. In: J. Brooks, P.R. Grant, M.D. Muir, V.P. Gizel and G. Shaw (R6dacteurs), Sporopollenin. Academic Press, London, New York, pp.2--30. Le Thomas, A. et Lugardon, B., 1976. De la structure grenue ~ la structure columellaire dans le pollen des Annonac6es. Adansonia, 15: 543--572. Masure, E., 1976. Le pollen des Cycadales et des Ginkgoales actuelles. Rapport avec les monocolp6s fossiles. Th~se de sp6cialit~, Paris. Reitsma, T.J., 1970. Suggestion towards unification of descriptive terminology of angiosperm pollen grains. Rev. Palaeobot. Palynol., 10: 39--60. Rhor, R., 1974. Etude cytologique de la microsporog6n~se et de la spermatog6n~se in vitro chez une Gymnosperme (Taxus baccata L.) et une Pr~phan~rogame (Ginkgo biloba L.). Th~se de sp6cialit6, Nancy. Roland, F., 1971. The detailed structure and ultrastructure of an acalymmate tetrad. Grana, 11: 41--44. Rowley, J.R., 1964. Formation of the spore in pollen ofPoa annua. In: H.F. Linskens (R6dacteur), Pollen Physiology and Fertilization. North-Holland, Amsterdam, pp.59--69. Skvarla, J.J. et Larson, D.A., 1963. Nature of cohesion within pollen tetrads of Typha latifolia. Science, 140: 173--175. Skvarla, J.J., Raven, P.H. et Praglowski, J., 1975. The evolution of pollen tetrads in Onagrac~es. Am. J. Bot. 62: 6--35. Ueno, J., 1960a. Studies on pollen grains of Gymnospermae concluding remarks to the relationships between coniferae. J. Inst. Polytech., 11: 190--136. Ueno, J., 1960b. On the fine structure of the cell walls of some gymnosperm pollen. Biol. J. Nara Women's Univ. 10: 19--25.
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