Oxydation du sulfite en sulfate en présence de protohématine I. Caractéristiques générales

BIOCHIM1CA ET BIOPHYSICA ACTA

OXYDATION

DU SULFITE

325

EN SULFATE EN PRt~SENCE DE

PROTOHI~MATINE I. CARACTt~RISTIQUES GI~NI~:RALES P. F R O M A G E O T ET F. C H A P E V I L L E

Ddpartement de Biologie, Commissariat dt l'Energie Atomique, Centre d'Etudes Nucldaires de Saelay, Gi/-sur- Yvet/e (France) (Requ le 6 d 6 c e m b r e 196o)

SUMMARY

Oxidation of sulphite to sulphate in presence of protohematin. I. General characteristics Protohematin catalyzes the oxidation of sulphite. The optimum p H of the reaction is approximately 7 in the presence of a o.o5M phosphate buffer. The oxidation of sulphite is not coupled to the reduction of protohematin to protohaem. Reagents able to form complexes with the iron of protohematin ale inhibitors of its catalytic function.

INTRODUCTION

L'6tude de l'oxydation du sulfite en sulfate par les tissus v6g6taux, entreprise par TAGER ET RAUTANEN1,2 et par notre laboratoire 3, permet de penser qu'en premi6re hypoth+se, la ou les enzymes responsables poss~dent un groupe prosth6tique de nature h6minique. I1 nous a donc paru utile, ~ titre de module, d'examiner le r61e catalytique de la protoh6matine ~ l'6gard de l'oxydation du sulfite en sulfate, r61e catalytique d6jk signal6 par S6RBO4.

Conditions exp~rimentales On mesure l'oxydation du sulfite dans l'appareil de Warburg, en pr6sence d'air, 7 ° ou k 37 °. La vitesse d'agitation est de 220 oscillations/min. Saul indication contraire on utilise IO tLmoles de sulfite par exp6rience, introduit sous forme de 0.2 ml de sa solution aqueuse et 0.02 t~mole de protoh6matine. La solution de protoh6matine employ6e est pr6par6e juste avant l'emploi, en dissolvant 6.5 mg d'h6mine cristallis6e dans 0.7 ml de solution de soude o.I N, et en diluant ~ IOO ml avec du tampon phosphate 0.05 M (pH 6.8). Les solutions de deut6roh6matine et de deut6roporphyrine sont obtenues de la mSme fa~on. Apr~s l'addition des substances dont l'effet sur l'oxydation du sulfite est 6tudi6, le volume est compl6t6 ~, 2 ml avec du tampon phosphate 0.05 M (pH 7.0). Les temps sont connus ~ ~ 5 sec pr6s.

Inhibiteurs Les mesures ont 6t6 faites avec une concentration en protoh6matine I . lO -5 M, L'influence de l'oxyde de carbone k 6t6 ~tudi6e k 25 °, k l'obscurit6 et dans une atmosphere comportant CO-O 2 (95:5) par rapport k des t6moins oh l'azote remplace Biochim. Biophys. Acta, 5 ° ( i 9 6 i ) 325-333

326

P. F R O M A G E O T ,

F. CKAPEVILLE

l'oxyde de carbone. On a aussi utilisd les substances ci-dessous duns les conditions habituelles: sulfate de sodium, fluorure de sodium, cyanure de potassium, Vers~'ne, o~,e'-dipyridyle, pyridine, acide rub6anique, alcool dthylique. En outre, on a examin6 l'influence sur l'oxydation du sulfite par la protoh6matine, de compos6s sulfin~s ainsi que de leurs analogues carboxyliques dont la liste ainsi que les concentrations utilis6es figurent dans le Tableau IV. F,.t~ S U L T A T S

Pendant le temps utilis6 (IO min) pour porter les cellules de Warburg k la tempdrature de 37 °, 15-2o % du sulfite s'oxydent spontan6ment dans l'ampoule lat6rale. D~s le m6lange des %actifs, la protoh6matine catalyse l'oxydation du sulfite. La vitesse initiale de la r6action est sensiblement proportionnelle k la concentration de la protoh6matine (Tableau I) et h la concentration du sulfite (Tableau II). Si l'on r6alise l'oxydation k 7 °, la vitesse de la r~action est suffisamment diminu6e pour que l'on puisse faire varier la concentration en sulfite dans de plus larges proportions. La consommation d'oxygbne aprbs 9o sec d'oxydation "k cette tempgrature est donn~e dans la Fig. I, off l'on a port6, it titre de comparaison, les r6sultats obtenus duns les m~mes conditions en pr6sence de sulfate de cuivre 5" IO-6 M comme catalyseur. Le pH optimum de l'oxydation du sulfite en pr6sence de protoh6matine est voisin de 7 en tampon phosphate o.o5 M, (Fig. 2). A ce pH, le rapport des concentrations des ions sulfite et bisulfite est de 5o. TABI.EAU

I

OXYGL:NE CONSOMMI~ P E N D A N T LES 2 PREMI/~RES MINUTES DE L ' O X Y D A T I O N DU S U L F I T E SOUS L ' E F F E T D E LA PROTOHI~MATINE

Sulfite, i o p m o l e s ; t a m p o n p h o s p h a t e , o . o 5 M ( p H 7 . o ) ; t e m p 6 r a t u r e , Protohdmalinc

3 7 °.

Oxygdne consommd Od) .................................................. Essai t Essai I I

o

6 19 3(t 65

i - l o n 31 2- i o 6 M 4" i o 6 M 6" i o 6 3 I

rFABLEAU

7. -'

l0 35-.5 53 66

II

I N F L U E N C E D E LA CONCENTRATION EN S U L F I T E SUR LA VITESSE DE LA CONSOMMATION D~OXYGJ~NE EN PRI~SENCE DE PROTOHI~MATINE

P r o t o h 6 m a t i n e , 2 . 5 " IO 6 M ; t a m p o n p h o s p h a t e , o . o 5 21/I ( p H 7 . o ) ; V c r s ~ n e , 0 . 7 5 - t o 6 ~ I ; t e m p d r a t u r e , 37 °. S u l f i t e i n t r o d u i t : [, 5 I t m o l e s ; I I , i o p m o l e s ; 1 [ [ , 2 o / , m o l e s . Oxygene consommd ( ld) Temps (rain)

2 4 6 8

I

II

II[

9 1.5 19 22

T7 30 39 46

3~ 07 83 97

Biochim.

Biophys. :t~la, 5o (196I) 325-333

OXYDATION DU SULFITE EN PRI~,SENCE DE PROTOHI~MATINE Si l ' o n s u i t l ' o x y d a t i o n

du sulfite en pr6sence de quantit6s

de protoh~matine

l ' o r d r e d e 1 . 2 5 5. 7 . 2 5 " IO -6 M , o n o b s e r v e q u e l a v i t e s s e d e l ' o x y d a t i o n ment.

Le Tableau

protoh6matine

III

montre

l'oxydation

que la quantit6

qu'en

devient

prfsence

d'une

apr~s quelques

concentration

minutes

327 de

d6crolt rapide1 . 2 5 " I O -6 M

extr~mement

de

lente bien

de sulfite encore prfisent soit appr6ciable.

d 50

----Jr-'''~'' ""+~

" A B

2~

0 0

10

20

30 #moles sulfite

Fig. t. Influence de la c o n c e n t r a t i o n en sulrite s u r la vitesse initiale de s o n o x y d a t i o n . La vitesse initiale est la q u a n t i t 6 d'oxyg~ne, exprim6e en /*1, utilis6e p e n d a n t les 90 p r e m i e r e s secondes. T a m p o n p h o s p h a t e , 0.o5 M (pH 7.0) ; t e m p 6 r a t u r e , 7 °. Courbes A e t B, p r o t o h ~ m a t i n e 2.5. io 6 M, courbe C, CuSO 4 5' lO 6 M.

5

6

7

8

pH

Fig. 2. Influence du p H sur l ' o x y d a t i o n du sulfite en pr6sence de p r o t o h 6 m a t i n e . Protoh 6 m a t i n e , 2.5" IO-e M ; sulfite, i o / z m o l e s , t a m pon p h o s p h a t e , 0.05 M. t e m p 6 r a t u r e , 37 °. E n ordonndc s o n t port6s les t+l O z c o n s o m m e s d a n s les trois premieres m i n u t e s p o u r c h a q u e exp6rience, apr~s s o u s t r a c t i o n de l'oxyg~ne cons o m m 6 d a n s des c o n d i t i o n s i d e n t i q u e s en a b s e n ce d ' h 6 m a t i n e .

0 TM

T~moin

75

~

0.3 50

0.2

250 300 350 mp Fig. 3. Spectre de la p r o t o h ~ m a t i n e apr&s oxyd a t i o n c a t a l y t i q u e de sulfite en sulfate. A, courbe d ' a b s o r p t i o n d ' u n m61ange de protoh 6 m a t i n e i- IO 5 M avec i o / * m o l e s de Na2SO 4 et 2 ml de t a m p o n p h o s p h a t e , o.o 5 M (pH 7.o) m a i n t e n u 15 m i n ~ 37 °. B, courbe d ' a b s o r p t i o n d ' u n m61ange de p r o t o h 6 m a t i n e i . to -s 2V/avec 1o / * m o l e s de Na2SO a et 2 ml de t a m p o n phosp h a t e o.o 5 M (pH 7.o) m a i n t e n u 15 m i n & 37 °. L ' o x y d a t i o n d u sulfite est alors totale.

I

..o--

. . . . " .......

- ......

25

,b

2b

3b

rain Fig. 4. Influence de l'a, ~'-dipyridyle et du Vers~ne s u r l ' o x y d a t i o n d u sulfite en presence de p r o t o h 6 m a t i n e . P r o t o h 6 m a t i n e , I. lO -5 M ; sulrite, IO/*moles; t a m p o n p h o s p h a t e , o.05 ~V/(pH 7.0) ; t e m p 6 r a t u r e , 37 °. I, Vers~ne, 2- io 5 M ; 2, ~,a'-dipyridyle, i . i o - 4 M ; 3,Vers~ne, i. IO 4 M .

Biochim. Biophys. Acta, 50 (1961) 325 333

328

P. FROMAGEOT, F. CHAPEVILLE

L a Fig. 3 p e r m e t d e c o m p a r e r le s p e c t r e d ' a b s o r p t i o n d e la p r o t o h ~ m a t i n e e n t r e 25o e t 4oo m F , e n p % s e n c e d e s u l f a t e i n t r o d u i t d i r e c t e m e n t (A) o u p r o v e n a n t d e l ' o x y d a t i o n c a t a l y t i q u e d u sulfite (B). Inhibiteurs L a c a t a l y s e d e l ' o x y d a t i o n d u s u l f i t e p a r la p r o t o h 6 m a t i n e ~ la c o n c e n t r a t i o n I . IO 5 M n ' e s t p a s m o d i f i 6 e e n p r 6 s e n c e d e s u l f a t e d e s o d i u m 2" lO -2 M , d e f l u o r u r e d e s o d i u m I . lO -2 M , d e c y a n u r e d e p o t a s s i u m I - I o -4 M . D a n s les c o n d i t i o n s i n d i q u 6 e s l ' o x y d e d e c a r b o n e n e p r o v o q u e a u c u n e a l t 6 r a t i o n d e la c i n d t i q u e d e l ' o x y d a t i o n d u sulfite. L a Fig. 4 m o n t r e l ' i n f l u e n c e i n h i b i t r i c e d u V e r s ~ n e e t d e l ' a , a ' - d i p y r i d y l e . L a TABLEAII I l l OXYDATION

DU SOLFITE

EN FONCTION

DE LA CONCENTRATION

EN PROTOH£MATINE

ET DU TEMPS

Sulfite, IO/imoles; tampon phosphate, 0.0 5 M (pH 7.0); temp6rature, 7". Protoh6matine: f, 1.2 5. io -e M; [I, 5" lO-6 M. Oxygdne consommd (ill)

Temps (rain)

.....

l

I 3 4.5 io 15 15o 240 Sulfite restant, dos6 par l'iode

11

6. 4 9-9 12.7 14.1 32 51

25.8 58 66 81.5 85.5 lO7 lO7

5-5 ttmoles

o

:1_

75

50

3 25

i

qO

20

min

30

Fig. 5. Oxydation catalytique du sulfite. Sulfite, lO/*moles; tampon phosphate, 0.05 M (pH 7.0); temp6rature, 37 ° ; volume fnal, 2 ml. i, Protoh6matine, I. lO-5 M ou deut6roh6matine, I. IO-s M ; 2, protoh6matine, i. io -s M + s6rum albumine, o,7" IO-~ M; 3, deut6roh6matine, I. IO-s M + s6rum albumine, o.7' IO-5 M; 4, deut6roporphyrine ; 5, protoh6matine, i. lO-5 M, s6rum albumine, 0. 7 . to-S ,~r + KCN i. io -4 M. Biochim. Biophys. Acta, 5o (t96I) 325 333

OXYDATION DU SULFITE EN PRI~SENCE DE PROTOHI~MATINE

329

pyridine a la m~me action et k la concentration 2. IO-~ M ralentit d'environ 5o % la vitesse d'oxydation du sulfite en pr6sence de protoh6matine I . lO -5 M. La substitution du tampon Tris au tampon phosphate supprime totalement les propri6t6s catalytiques de la protoh6matine (concentration: I ' I O -~ M), et l'acide rub6anique (dithio-oxamide) I . i O -4 M arrSte compl~tement toute consommation d'oxyg~ne. Dans les mSmes conditions, l'addition de s6rum albumine ~ la concentration o.7"IO s M provoque une modification de la cin6tique de l'oxydation du sulfite se manifestant par un ralentissement trSs marqu6 de l'oxydation pendant les trois premieres minutes (Fig. 5). Cette inhibition est accrue en prdsence de cyanure I. io 4 M, qui seul cependant n'a pas d'influence sur l'activit~ catalytique de la protoh6matine. A la concentration 2.1o -5 M, la s6rum albumine inhibe compl~tement l'oxydation du sulfite. En solution dans du tampon phosphate, la deut6roh6matine, qui poss~de les mSmes caract6ristiques k l'6gard de l'oxydation catalytique du sulfite, est cependant plus inhib6e par la s6rum albumine k la concentration 0. 7 • IO-5 M (Fig. 5), les solutions de deut6rohfmatine et de protoh6matine ayant ~t6 pr~par6es en m~me temps. En effet, si l'on conserve une solution de protoh6matine I . l O - 4 M dans du tampon phosphate 0.05 M (pH 7.0) pendant 4 jours ~ o °, son aptitude k catalyser l'oxydation du sulfite est diminu6e et l'addition de s6rum albumine k la concentration 0. 7. io -5 M conduit ~ une inhibition totale de la catalyse. Cette 6volution de la protoh6matine en solution ~ pH 7.0 est acc616r6e par la dilution : Une solution 5" IO-S M de protoh~matine dans du tampon phosphate 0.05 M (pH 7.0) perd environ la moiti6 de son activit6

0.50.~"/

J

O)

.~_ o

"..

"0

.~ o3

\

V

""

4

0.I N 3/o

3~o

3;0

~'oo &

0 10 20 rain 30 Fig. 7. Influence du c y a n u r e s u r l ' o x y d a t i o n du sulfite. Sulfite, Io /~moles; t a m p o n p h o s p h a t e , o . o 5 M (pH 7.0); t e m p 6 r a t u r e , 37°; v o l u m e final, 2 ml. i, P r o t o h 6 m a t i n e , 5 . i o - 8 M ; 2, p r o t o h 6 m a t i n e + KCN, I. IO a M ; 3, protoh 6 m a t i n e + KCN, 3" I o - S M ; 4, KCN, I. I o - 3 M ; 5, KCN, 3" lO-n M.

Fig. 6. Modification de la b a n d e de Soret de la p r o t o h 6 m a t i n e en f o n c t i o n du t e m p s et influence du Tris. Solution de p r o t o h 6 m a t i n e , i- io s M d a n s du t a m p o n p h o s p h a t e 0.05 M (pH 7.0). I, io m i n apr~s sa p r e p a r a t i o n ; II, apr~s 4 ° m i n ; III, apr~s 9o m i n ; IV, apr~s 15 h. M, solution de p r o t o h 6 m a t i n e , I. IO -s M d a n s d u t a m p o n Tris 0.o5 M (pH 7.1) et m e s u r 6 9 0 m i n apr~s sa p r 6 p a r a t i o n ; N, apr~s 15 h. T e m p 6 r a t u r e , 25 °.

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p. FROMAGEOT, F. CHAPEVrLLE

catalytique en 12 h £ 25 °, et h la lumi~re du jour; simultan6ment, l'intensit6 de la bande de Sorer diminue (Fig. 6). L'influence du cyanure stir la catalyse par la protoh6matine de l'oxydation du sulfite est donn6e par la Fig. 7. Les spectres de la protoh~matine en pr6sence de Tris et de ~,~'-dipyridyle ou de pyridine sont donn~,s par les Figs. 6 et 8. Enfin en pr~sence d'alcool 6thylique 1.6. IO ~ M, l'oxydation du sulfite par la protoh6matine, dans les m6mes conditions que ci-dessus est complStement arrPt6e. Le spectre de la protoh~matine en pr(~sence d'alcool est donn6 par la Fig. 0.

o~

"~ 0.~ EL 0

u~

0.3

0.2 370

380

390

,~00

l; 10

ml~

Fig. 8. Modification de la b a n d e de Sorer de la p r o t o h 6 m a t i n e p a r la pyridine et l'o~, a'-dipyridyle. Protoh6matine, I . I O -5 M , en solution dans du t a m p o n p h o s p h a t e o.o5 M (pH 7.o). A, p r o t o h 6 m a t i n e t~moin; B, en pr6sence d'oc, a'-dipyridyle, 3.6. IO-3 M; C, en pr6sence de pyridine, 3.6. IO --2 M. Mesures faites apr6s 2o min ~, 25 °.

o.21%

..'/

300

//

330

360

390

/.20

Fig. 9. Modification de la bande de Soret de la p r o t o h 6 m a t i n e en pr6sence d'alcool 6thylique. 1, Solution de protoh6matine, i - i o 5 3 I dans du t a m p o n p h o s p h a t e , o.o 5 3 I (pH 7.o5). 2, Solution constitu6e p a r i ml de solution de protoh~matine, i- io 4 M dans du t a m p o n p h o s p h a t e , o.o5 M (pH 7.o). o.5 ml d'alcool 6thylique ,~ 95 ~:' et p a r du t a m p o n p h o s p h a t e , o.o 5 M (pH 7.0), j u s q u ' a un volume total de to ml, p H final 7. t.

Inhibition par les dgriv~s sulfin~s et par leurs analogues Les d6riv6s sulfin6s sont des inhibiteurs de l'oxydation du sulfite par la protoh6matine. Le Tableau IV montre qu'une concentration 5"IO-~ M d'hypotamine conduit £ une vitesse initiale d'absorption d'oxyg~ne inf6rieure k celle du t6moin sans hypotaurine. La substitution de la taurine, puis de la glycine h l'hypotaurine, se manifeste par une diminution de cette inhibition. On retrouve cette d6croissance de l'inhibition de l'oxydation du sulfite au fur et h mesure que l'on remplace un d6riv6 sulfin6 par son homologue sulfon6 puis carboxylique, dans l'action de l'acide cyst6inesulfinique, de l'acide cyst6ique et de l'acide aspartique (Tableau IV). Le Tableau IV donne aussi l'effet d'autres d~riv6s sulfin~s ou sulfon~s sur la catalyse h6matinique de l'oxydation du sulfite ainsi que du thiosulfate. Bioclli~. Biophys. Acla, 50 (1061) 325 333

OXYDATION

DU

SULFITE

EN

PRI~SENCE

TABLEAU

DE

PROTOH1~MATINE

331

IV

I N F L U E N C E D E D I V E R S COMPOSI~S SULFINI~S OU DE SUBSTANCES ANALOGUES SUR LA VITESSE D ' O X Y D A T I O N DU S U L F I T E E N PRI~SENCE DE PROTOHI~MATINE

Protoh6matine, I . IO - 5 ]lJI; s u l f i t e , IO #moles; tampon phosphate, 0 . 0 5 l~I ( p H 7 . 0 ) ; temp6rature, 3 7 ° ; volume total, 2 ml. Les rfsultats sont exprimds en / ~ 1 0 ~ absorbds pendant les 2 premib.res minutes, en pour cent par rapport au t6moin. Substance introduite

02 absorbis

T6moin Hypotaurine 5" l O - 3 M Hypotaurine I O . l O . 3 1~,I Taurine 5" i o a 2tl Taurine i o . lO - 3 M Glycine i o . lO - 3 M Acide cyst6inesulffnique 5" I O - a M Acide cyst6ique 1 3 . IO - 3 M Acide aspartique 1 5 . lO - 3 M N-m6thyltaurine I O . l O - 3 M t~thanesulfonate de N a 5" ~o a 3 I l~thanesulfonate de N a i o . i o 3 M I2thanesulfonate de N a 1 5 . i o 3 M Benz6nesulfinate de N a 5" i o 3 ~ / Thiosulfate de N a 5" i o 3 M

(Ill)

IOO 57 4-5 72 38 64 o 22 67 o 90 83 76 o o

DISCUSSION

I. Les r&ultats obtenus montrent que le fer ferrique, sous forme de complexe porphyrinique (protoh~matine, deutfrohfmatine), est £ pH 7, un actif catalyseur de l'oxydation du sulfite en sulfate. La deut6roporphyrine ne poss~de pas cette aptitude (Fig. 5). Les groupes vinyliques de la protoh6matine n'ont pas de r61e essentiel dans cette analyse, puisque la deut&oh6matine poss~de les m6mes propri6t6s. On salt que le spectre et le poids mol6culaire apparent de la protoh6matine se transforment en solution aqueuse. Ces modifications, 6tudi6es par vole spectroscopique par SHACK ET CLARK5 et par BLYUMENFELDT6 (voir aussi Fig. 6) entrainent aussi une diminution de l'activit6 catalytique de la protoh6matine 5. l'6gard de l'oxydation du sulfite. I1 est possible que de telles modifications de la protoh6matine soient en partie responsables de la diminution de son activit6 catalytique que l'on observe au cours des exp6riences qui mettent en oeuvre de tr~s petites quantit6s de ce catalyseur (Tableau III). 2. Le sulfite ne r~duit pas le fer trivalent de la protoh~matine, et en presence de pyridine il n'est pas possible de d6celer la formation d'un h6mochrome, qui dans les m~mes conditions apparMt imm6diatement en prfisence de l'hydrosulfite. Ainsi, contrairement 5. ce que l'on observe pour la catalyse par les ions Cu 2+, le r61e catalytique de la protoh~matine n'est pas li~ au changement de valence du fer. Ce r~sultat est en accord avec le fait que l'oxyde de carbone n'est pas un inhibiteur; l'effet inhibiteur de l'~,~'-dipyridyle ne peut alors s'expliquer par les propri6t6s ch61atrices du fer ferreux. On est conduit k penser que le dipyridyle se comporte comme une base azot6e formant avec la protoh6matine un h6michrome. En effet, le spectre de la protohfimatine est modifi6 au niveau de la bande de Soret par l'~,~'-dipyridyle comme il l'est par la pyridine (Fig. 8). Ces donn~es montrent incidemment que la substitution du carbone en c~par rapport k l'azote n'exclut pas la formation d'un h~michrome, comme le pense LANGENBECK7. SCIffELERET JUNG s 6taient d6j~ arrivds 5. une conclusion identique avec Biochim. Biophys. Acta,

5 0 (1961) 3 2 5 - 3 3 3

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P. FROMAGEOT, F. CHAPEVILLE

l'a-picoline et la quinol~ine. Le Tris provoque aussi une modifcation de la bande de Soret de la protoh6matine (Fig. 6), et il est bien d6montr6 que la s6rum albumine forme des combinaisons avec la protoh6matine. L'inhibition de la catalyse h6matinique de l'oxydation du sulhte provoqu6e par la pyridine, l'a,e'-dipyridyle, le Tris, la s6rum albumine peut done s'expliquer par la formation d'h~michromes, toutes ces substances ayant en commun la possession d'atomes d'azote. I1 est tff-s probable que l'inhibition observ6e en pr6sence de dithiooxamide doive ~tre rapport6e au m6me ph6nom~-ne. Toutefois, la forte absorption entre 38o m/~ et 41o m~ de cette substance ne nous a pas permis d'en apporter une preuve directe. L'effet inhibiteur de l'dthanol participe au m~me ph6nom6ne: formation d'un complexe avec le fer de la protoh6matine. L'existence d'un tel complexe est indiqu6 par la modification de la bande de Soret, comme MAEHLY ET AKESONs l'ont montr6 avec une concentration en 6thanol de 5o ?o, et comme on peut encore le voir avec des quantit6s d'alcool beaucoup plus petites (Fig. 9). I1 apparalt ainsi que la formation d'un complexe avec le ter retire £~ la protoh6matine ses aptitudes catalytiques k l'6gard de l'oxydation du sulfite. On remarquera aussi que l'acide cystdinesulfinique, qui doit ~ son groupe sulfinyl la propridt6 de pr6cipiter le fer ferrique de ses solutions ~°, est un inhibiteur de l'action catalytique de la protoh6matine. Lorsqu'on substitue ~Lcet acide sulfinique, l'acide sulfonique correspondant (acide cyst6ique) ou son analogue carboxyl6 (acide aspartique), on observe un affaiblissement de cette inhibition (Tableau IV). Nous avons rapport6 des faits analogues en ce qui concerne l'hypotaurine, la taurine et la glycine. De plus l'acide benz~nesulfinique, qui ne poss~de pas de groupe amind bloquc compl6tement l'action catalytique de la protoh~matine. Ces donn6es nous incitent ~ penser que les ddrivds soufr6s organiques utilisds peuvent former avec le fer de la protoh6matine un complexe par leur groupe sulfinyle, et "k un moindre degr6 par leur groupe sulfonyle. Un tel complexe auquel peut s'ajouter dans le cas des acides aminds ceux qui impliquent le groupe carboxylique ou le groupe amin6 pr6viennent l'acc6s du substrat au fer de la protoh6matine et rendent compte de l'effet inhibiteur observd. En ce qui concerne le Vers6ne, il est tr~s probable que ce sent les groupes carboxyliques qui sent responsables de la dissimulation du fer de la protoh6matine, et non l'azote, substitu6 par ces chMnes encombrantes. On a montr6 l'existence de tels complexes entre le fer h6matinique et un groupe carboxylique avec l'acide benzoique et la catalase ~. Le cyanure (Fig. 7) enfin n'inhibe le r61e catalytique de la protoh6matine que lorsque le rapport des concentrations cyanure/protoh6matine est sup6rieur "k 2oo. Dans ces conditions, on observe le spectre de la dicyanoferriprotoporphyrine. Cependant, en pr6sence de s6rum albumine et de cyanure (rapport des concentrations cyanure/protoh6matine IO), l'inhibition de l'oxydation du sulfite est sup~rieure "k celle que provoque, seule, la m~me quantit6 de s6rum albumine (Fig. 5, courbe 5). I1 est possible que ce ph6nom~ne mette en 6vidence un h6michrome mixte cyanures6rum albumine, analogue "Xcelui que SHACKET CLARK5 ont observ6 pour le systbme cyanure-pyridine. On est ainsi conduit ~ admettre que la catalyse de l'oxydation du sulfite par la protoh6matine implique une combinaison avec les substrats, et en particulier, une Biochim. Biophys..4eta, 50 (t q6l ) 325 333

OXYDATION DU SULFITE EN PRt~SENCE DE PROTOtII~MATINE

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combinaison hGmatine-sulfite. Que le sulfite forme des complexes avec le fer ferrique TM et que le thiosulfate, qui est aussi un agent complexant du fer 13mais non oxydable par la protohGmatine, inhibe compl~tement l'oxydation du sulfite, sont des observations en accord avec la prGc~dente conclusion. REMERCIEMENTS

Nous tenons k remercier le Dr. H O R N E R , Institut de Chimie Organique de l'Universit6 de Mayence, qui a mis ~ notre disposition de l'acide benz~nesulfinique, et le Dr. PICI-IAT, Section des Mol6cules Marqu6es du C.E.A., qui a pr6par~ l'hypotaurine utilis~e dans le present travail. RI~SUMI~

La protoh6matine poss~de la propri6t~ de catalyser l'oxydation du sulfite. Le pH optimum de cette r6action est voisin de 7 en pr6sence d'un tampon phosphate 0.05 M. L'oxydation du sulfite n'est pas li6e ~ la r6duction de la protoh6matine en protoh~me et les substances susceptibles de former des complexes avec le fer de la protoh6matine s~nt des inhibiteurs de son action catalytique. BIBLIOGRAPHIE 1 j . M. TAGER ET N. RAUTANEN, Biochim. Biophys. Acta, 18 (1956) I I i . 2 j . M. TAGER ET N. RAUTANEN, Physiol. Plantarum, 9 (1956) 666. 3 p. FROMAGEOT, R . VAILLANT ET H . PEREZ-MILAN, Biochim. Biophys. Acta, 44 (196o) 77. 4 B. SORBO, Colloque sur la Biochimie du Sou]re, Roscoff, 1956, p. 230. 5 j . SHACK ET N. M. CLARK, J. Biol. Chem., 171 (1947) 143. 8 L. A. BLYUMENFELDT, Doklady Akad. Nauk. SSSR, 85 (1952) i i i i . H. SCHUBERT, H. GIESEMANN ET W. LANGENBECK, Ann., 585 (1954) 68. s W. SCHELER ET F. JUNG, Biochem. Z., 329 (1957) 222. 9 A. C. MAEHLY ETA. AKESON, Acta Chem. Scan&, 12 (1958) 1259. 10 j . THOMAS, J. Chem. Soc., 95 (19o9) 343. 11 M. SuKuzI, T. TOMIMURA ET M. MIZUTANI, ] . Biochem. (Tokyo), 42 (1955) 99. 12 M. V. SIDGWlCK, The Chemical Elements and their Compounds, Vol. 2, Clarendon Press Oxford, 195o, p. 9o9. 13 F. M. PAGE, Trans. Faraday Soc., 5o (1954) 12o.

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