Proprietes des activites proteolytiques extraites des sols frais

Soil Biol. Biochem. Vol. 7, pp. 281 to 286. Pergamon Press 1975. Printed in Great Britain.

PROPRIETES DES ACTIVITES PROTEOLYTIQUES EXTRAITES DES SOLS FRAIS J. MAYAUDON, L. BATISTIC et J. M. SARKAR Laboratoire de Biochimie Microbienne, Facult6 des Sciences Agronomiques, Universit6 de Louvain, 3030-Heverlee, Belgique (Accepted 22 December 1974)

R~sum6---L'Extrait NASF (Extrait neutre aseptique lyophilis6 des sols frais) et l'Extrait ESF (extrait des enzymes du sol qui repr6sente l'Extrait NASF trait8 par la salmine et SP SSphadex C25 pour en 6carter les mati6res humiques) ont tous deux une activit6 prot6olytique (substrat cas6ine) associ6e ~t des activit6s des o- et p-diph6nol oxydases. L'activit6 prot6olytique de l'Extrait NASF est corr616e de faqon positive avec la teneur de la mati6re organique du sol et de faqon n6gative avec la teneur en argile. L'activit6 prot6olytique parMt li6e fi la croissance des bact6ries prot6olytiques, plut6t qu'h leur nombre. Les propri6t6s de l'activit6 prot6olytique de l'Extrait ESF montrent que celle-ci a une activit6 optimum /t pH 8,5 et une temp6rature optimum de 50°C. Entre 14°C et 37°C, EaCt. est de 5,8 Kcal mol-t °C-~. En faisant varier la concentration de la casSine, on constate que V~x = 1 UPK (Kaken) mg C- t ESF et K,, = 2,2~o (p/v). L'activit6 prot6olytique est insensible ~t riodoac6tamide (10 mM), au p-chloromercuribenzoate (10 #u) et ~t I'EDTA (50 mu). Elle est, par contre, sensible au diisopropylphosphofluoridate (100 #M). Ces r6sultats sugg6rent que l'activit8 prot6olytique associ6e l'Extrait ESF est une s6rine prot6ase de type alcaline. La stabilit8 des diph6nol oxydases et s6rine prot6ase dans rExtrait ESF est discut6e. Le traitement lysozyme et pronase inactive l'activit6 diph6nol oxydase. La pronase seule a peu d'effet. Ce fait suggSre que les polysaccharides associ6s aux Extraits ESF et NASF assurent un r61e protecteur dans les complexes "humoenzymes". Summary--Properties of proteolytic active extracts from soils: NAFS Extract (neutral sterile and lyophilized extracts of fresh soil) and EFS Extract (NAFS Extract treated with salmine and SP Sephadex C25 to remove humic matter) had proteolytic activity (substrate casein) associated with o- and p-diphenol oxidases. The proteolytic activity of NAFS Extract was positively correlated with soil organic matter content and negatively correlated with soil clay content. The proteolytic activity seemed to be associated with the growth of proteolytic bacteria but not with their number. Proteolytic activity of EFS Extract was optimal at pH 8.5 and at 50°C. Between 14°C and 37°C, the Eaet. was 5"8 Kcal mole-t °C-1. By varying the casein concentration, we obtained that Vmax= 1 UPK (Kaken) mg C- 1 EFS and Km = 2"2~o (w/v). The proteolytic activity was insensitive to iodoacetamide (10 mu) p-chloromercuribenzoate (10 pu) and EDTA (50 mu), but highly sensitive to diisopropylphosphofluoridate (100 #M). These results suggested that the proteolytic activity associated, with the EFS Extract was a serine protease of the alkaline type. The stability of diphenol oxydases and serine protease in EFS Extract was discussed. In the presence of lysozyme and pronase, the activity of diphenol oxidase was destroyed. Pronase alone had only a little effect on this activity. This suggests that polysaccharides associated with EFS and NAFS extracts play a role in stabilizing the "humoenzymes" system in soil.

INTRODUCTION

des recherches, it serait utile d'6tablir les interactions L'Extrait neutre aseptique lyophilis6 des sols frais possibles existant dans les Extraits NASF, entre les (NASF) pr6sente les caract6ristiques chimiques des complexes "humoprot6ase" et les complexes "huacides humiques bruns, tout en ayant des activit6s mooxydase'. En outre, il serait int6ressant de d6terenzymatiques o- et p-diph6nol oxydase. AprSs purifi- miner, ~t partir de l'Extrait ESF, les propri6t6s de cation chromatographique, l'existence de complexes l'activit6 casSot,ytique extractible du sol. "humooxydase" de types r6versible et irr6versible ne MATERIEL ET M E T H O D E S pourrait ~tre mise en doute. I1 reste ~ signaler que Sols 1 ~ 10 l'Extrait NASF, trait6 ~ la salmine, permet de s6parer un extrait enzymatique de sol frais (ESF) libre de Les caract6ristiques p6dologiques et chimiques de mati+res humiques. Au cours de ces travaux, on sig- dix types de sols: pH (H20); capacit6 d'Schange; ~o nale encore que les Extraits N A S F poss6daient 8gale- argile; ~ limon; ~o C et 9/0 N ont 8t6 d6crites ailleurs merit une forte activit6 prot6olytique (Mayaudon et (Mayaudon et al., 1973a). Les pr618vements ont 6t6 Sarkar, 1974b). L'existence in situ de complexes "hu- r6alisSs en 6t6, en triple exemplaires. La couverture .moprotSase" parait se confirmer par la r6alisation vSgStale et la localisation des sols est indiqu6e ciin vitro de tels complexes (Rowell et al., 1973). L'optiapr6s: 1, For& (Meerdael); 2, For& (Meerdael); 3, que des recherches aboutit ainsi ~ u n point de conver- ForSt (Soignes); 4, Prairie (Heverlee); 5, Prairie (Tergence avec celles entreprises par Ladd et collaboravueren); 6, Prairie (Nodebais); 7, Prairie (Heverlee); teurs sur les activitSs prot6olytiques extractibles des 8, Labour (Nodebais); 9, Labour (Heverlee); 10, sols (Ladd, 1972; Ladd et Butler, 1972). A c e stade Labour (Heverlee). 281

J. MAYAUI)ON,L. BATISTICet J. M. SARKAR

282

Tableau 1. Analyse microbiologique des sols frais* No. 6chantillon

Bacteries

Bacteries proteolytiques

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

19.000 2000 2900 48.000 47.000 6800 3100 3200 6100 12.500

280 390 120 1200 1600 500 210 700 60(1 500

Moisissures

Actinomycetes

18 63 480 33 1,7 42 I8 6 15 4

3200 61 440 3900 4100 3600 1500 3900 2600 3000

* La teneur des microorganismes (x 103) des sols frais est rapportee par g sol poids sec.

Prbparation des Extraits NASF

E

Celle-ci est realisee 5. partir des sols frais 1 h 10, suivant une methode decrite dans un travail precedent (Mayaudon et al., 1973a). Les caractdristiques chimiques et les activites oxydasiques des Extraits N A S F sont donnees au Tableau 2.

o

Pr@aration des Extraits ESF

'~

L'Extrait ESF represente les enzymes libres de matieres humiques. II est obtenu ~ partir de l'Extrait N A S F trait6 ~ l a salmine. Cette preparation, decrite ailleurs (Mayaudon et al.. 1973b), a ete realisee pour le sol 2 (ESF 2: C'~,i~= 50; N% = 6).

o

Comptages des microorganismes Le comptage des bacteries est realis6 sur extrait sol agar. Le comptage des bacteries proteolytiques sur lait tournesole Difco agar; le comptage des moisissures sur milieu Jensen (Pochon et Tardieux, 1962); le comptage des actinomycetes est realis6 sur le milieu Hennebert (resultats non publies), dont la composition par litre est donnee ci-apres: diethylene glycol 1 ml: casdine Difco 0,3 g; KNO3 2 g; K2HPO4 I g; M g S O e . 7 H 2 0 0,5 g; NaC1 0,05 g; CaSO4 0,1 g; FeSOe.7H20 10 mg; Bacto agar 40 g. La teneur des divers groupes de microorganismes, relev+e dans les sols frais au moment du prelevement, est rapportee au Tableau l.

Mesure de l'activit~ prot#olytique (cas~ine) des Extraits NASF et ESF On applique la methode preconisee par Ladd et Butler (1973), dans les conditions experimentales suivantes: 2 mg d'Extrait lyophilis6 (NASF ou ESF) sont solubilises dans 1 ml tampon Tris-borate 0,1 M pH 8,1, auquel on ajoute 1 ml de caseine isoelectrique (Difco) 5 mg m l - 1 dans le m~me tampon. A w e s une incubation de 1 h ~ 50°C. sans agitation, on ajoute 1 ml acide trichloroacetique 17,5% (TCA). Apres centrifugation, on ajoute au surnageant 3 ml Na2CO3 2,8 N plus 1 ml reactif de Folin trois fois dilue (volume total, 7 ml). Un temoin est realis6 dans les memes conditions, avec extrait et substrat separement. La densit6 optique, lue h 700 nm, est convertie en unites d'activit6 U P K de Kaken Chemical Co. (Narahashi, 1970), en s'aidant du graphique Fig. 1 realis6 par ajoute de quantites connues de pronase (Calbiochem 53702; act.: 45 U P K mg 1), dans les conditions precitees. Les activites caseolytiques speci-

o

~.5o

.~ o

t.oc

0,50

0

I CO

200

300

400

500

Unil"~s mOPK

Fig. 1. Variation de la densite optique en fonction de l'activit6 caseolytique de la pronase. fiques sont exprimees en milli U P K (mUPK) mg C - i d'extrait enzymatique h - ~ fi 50°C. L'activit6 caseolytique totale extractible du sol est exprimee en unite UPK. Elle s'obtient en multipliant l'activit6 caseolytique specifique par le poids carbone de N A S F extrait du sol frais et estime par Kg sol poids sec.

Effet du pH Un mg ESF 2 lyophilis6 est solubilis6 dans 1 ml tampon acetate (100 #moles) pH 5,0 ou dans 1 ml tampon K2HPOe/KH2P04 (100 #moles) respectivement aux pH 6; pH 7; pH 8. On prepare des solutions de caseine de 5 mg ml-1 dans les m~mes tampons. On ajoute 1 ml de solution enzymatique/l 1 ml de cashine. Apr~s une incubation de 1 h fi 50°C, l'activit6 caseolytique specifique est determinee en condition standard.

Effet de la tempfrature Un mg ESF 2 est solubilis6 dans 1 ml tampon Tris-borate (100 #moles), pH 8,1; ajoute de 1 ml de caseine 5 mg ml- 1. Incubation de 1 h aux temperatures 14, 25, 37, 50 et 70°C. L'activit6 caseolytique specifique est determinee en condition standard.

Effet de la concentration du substrat Un mg ESF 2 est solubilis6 dans l ml tampon T r i ~ b o r a t e (100 #moles), pH 8,1; ajoute de 1 ml caseine aux concentrations respectives de 0,5 mg; 1 mg; 2,5 mg et 5 mg m l - 1. Incubation de 1 h & 50°C. L'activit6 caseolytique specifique est determinee en condition standard.

Propri~t6s des activit6s prot6olytiques

283

Tableau 2. Caracteristiques chimiques et enzymatiques des extraits NASF* Analyse 616mentaire No. 6chantillon

Rendelnent mg NASF extrait par Kg sol

C%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

425 1300 725 230 450 733 330 125 200 250

37,97 43,70 38,15 38,08 37,44 38,12 40.94 3~66 35,94 3&53

o-Diph~nol oxydase

p-Diph6nol oxydase

Protease

N%

Activit6 sp~cifique

Unit6s totales

Activit6 sp6cifique

U nit6s totales

Activite sp6cifique

Unites totales

3,03 3,16 2,81 3,43 2,84 3,55 3,21 3,62 3,32 3,75

1,4 1,6 2,5 1,6 3,5 2,7 3,2 0,4 3,4 0~5

224 908 690 139 588 745 432 17 251 45

5,6 3,9 2,5 8,5 20,7 6,0 5,7 8,7 8,6 12,2

896 2215 690 739 3477 1656 769 365 636 1110

790 183 131 190 374 210 450 223 200 199

126 104 36 16 63 57 61 9 15 18

* Rendement: mg NASF lyophilis6 par Kg sol et estim6 par poids sec. Conditions exp~rimentales: o-diphdnol oxydase, substrat: 3(3,4-dihydroxyph6nylalanine);p-diphdnol oxydase, substrat: p-ph6nyl6nediamine. D6termination de l'activit6 enzymatique r6alis6e sur 5 mg Extrait NASF; 30 #moles tampon phosphopotassique, pH 7; 3 /~moles substrat, 37°C. Consommation 02 mesur6e au moyen de l'61ectrode polarographique YSI Model 52. Activit6 sp6cifique des oxydases: nmoles (10- g moles) 02 absorb6 rain l mgC-~ NASF ~ 37°C. Unites totales: nmoles (10- g moles) O2 absorb6 min-~ Kg -~ sol. Prot~ase: 2 mg Extrait NASF; 100 #moles tampon Tris-borate pH 8,1; 5 mg cas6ine iso61ec. (Difco); vol.tot., 2 ml; incubation 1 h ~ 50°C. Activit6 sp6cifique: mUPK (Kaken) h-a mg C-~ NASF. Unit6s totales: UPK h i Kg-~ sol.

Effet des inhibiteurs Un mg ESF 2 est solubilis6 dans 0,8 ml tampon KzHPO4/KH2PO 4 (100 pmoles) h pH 8; ajoute de 1 ml cas6ine (5 mg ml-1) et respectivement, une des solutions suivantes: 200 pl eau distill6e (contr61e); 200 /zl iodoac6tamide 10-1 M (conc finale 10 mM); 200/A p-chloromercuribenzoate 10-1 mM (conc finale 10 #M); 200 /A diisopropylphosphofluoridate (DFP) 1 mM (conc finale 100 #M); 200 #1 DFP 10-x rnM (conc finale 10 pM). Dans chaque cas, volume total 2 ml et incubation de 1 h "~ 50°C. La d6termination de l'activit6 cas6olytique sp6cifique est r6alis6e en condition standard.

Effet de EDTA Huit mg ESF 2 sont solubilis6s dans 2 ml KzHPO4/ KH2PO 4 0,1 rnM ~t pH 7 et dialys6s contre 2 1. EDTA 50 mM pH 7 pendant 24 h, puis dialys6s 3 jours contre eau d istill6e pour 6carter EDTA. L'Extrait ESF est lyophilis6. Un mg ESF (apr6s traitement EDTA) est dissous dans 1 ml tampon K2HPO4 KH2POg 1 (100 #moles) '~ pH 8; ajoute de 1 ml cas6ine 5 mg m l - l . Incubation de 1 h ~ la temp6rature de 50°C. On r6alis~ un essai contr61e sur 1 mg ESF non trait6 par EDTA. Dans les deux cas, on mesure l'activit6 cas6olytique sp6cifique en condition standard.

Ddoradation par prot~olyse de l'activitd mdlanique associde ~ l'Extrait ESF Autodigestion. Deux mg Extrait ESF sont solubilis6s dans 2,8 ml tampon KzHPO4/KH2PO4 10 mM pH 7. On ajoute 0,2 ml CaC12 1 raM. On introduit 100 /A tolu6ne et on incube 12 h h 37°C. Apr6s incubation, la solution est dialys6e contre tampon phosphate 100 /~M pH 7 et lyophilis6e. Action de la pronase. Deux mg Extrait ESF sont solubilis6s dans 2,8 ml tampon KzHPO,dKHzPO4 10 mM pH 7. On ajoute 0,2 ml CaC12 1 mM et 0,2 mg pronase (9 UPK) (Koch Light Lab.) pr6alablement dissous dans 0,3 ml tampon phosphate 20 mM pH 7. On introduit 100 #1 tolu6ne et on incube 18 h ~t 37°C. Apr6s incubation, la solution est dialys6e contre tampon phosphate 100 #M pH 7 et lyophilis6e.

Action du lysozyme + pronase. Deux mg Extrait ESF sont solubilis6s dans 2 ml tampon Tris-HC1 10 mM pH 8,1, auquel on ajoute 0,1 ml lysozymeEDTA (volume 6gal, m61ang6 avant usage, de lysozyme 0,85 mg ml-~, tampon Tris-HC1 0,25 M pH 8,1 et EDTA 2,7 mg ml -~ eau distill6e ) (Godson, 1967). L'incubation est r6alis6e 18 h ~ 37°C, apr6s ajoute de 100 pl tolu6ne. Apr6s incubation, la solution est dialys6e 24 h contre tampon K2HPO4/KHzPO4 10 mM pH 7. On traite par la pronase, comme indiqu6 plus haut, et apr6s incubation, la solution est dialys6e contre tampon phosphate 100/~M pH 7 et lyophilis~e. Test de l'activitd mdlanique associ~e ?t ESF On applique, avec de 16g6res modifications, la m6thode appliqu6e ant6rieurement (Mayaudon et al., 1973). Celle-ci consiste ~ dissoudre un poids correspondant it 1 mg de l'Extrait ESF (avant et apr6s Tableau 3. Correlations entre l'activit6 prot6olytique extractible (NASF) et les autres propri6t6s du sol et de NASF*

Propri6t6s du sol et de l'Extrait NASF pH CEC Argile ~o Limon % C~o N% o-Diph6nol oxydase p-Diph6nol oxydase Batteries Bact6ries prot6olytiques Moisissures Actinomyc6tes

Co6fficients de corr6lation obtenus avec l'activit6 prot6olytique Activit6 Unit6s sp6cifique totales -0,53 NS -0,41 NS -0,81 S** -0,66 NS 0,74 S 0,27 NS 0,54 NS 0,21 NS 0,03 NS 0,00 NS

-0,53 NS -0,22 NS -0,73 S -0.35 NS 0,85 S** 0,63 NS 0,89 S** 0,67 NS 0,10 NS 0,06 NS

-0,26 NS -0,47 NS

0,1,7 NS -0,19 NS

* Co6fficients de corr61ation obtenus en excluant les sols forestiers 1,2,3. NS~non significatif;S~significatifP < 0,05; S**--hautement significatif P < 0,01.

284

J. MAYAUDON, L. BATISTICet J. M. SARKAR

dhgradation prot6olytique) dans 3 ml de solution K 2 H P O J K H z P O 4 10 rn~ p H 7 contenant 3/~moles de DOPA. On suit, apr6s 6 h h 37°C, la formation de m61anine par accroissement de densit6 optique "a 400 nm. RESULTATS ET DISCUSSION

Relation entre l'activit~ prot~olytique de NASF et les constituants oryaniques et inorganiques du sol L'examen des Tableaux 2 et 3 montre que, sans exception, tousles Extraits N A S F obtenus aux d6pens des sols de for6t, de prairie et de culture ont des activit6s prot6olytiques. Celles-ci sont corr616es de fa~on positive avec la teneur de la mati+re organique du sol, que ces activit6s soient estim6es par poids de carbone Extrait N A S F (r = 0,74) ou par poids de sol (r = 0,85). D'un autre c6t6, on constate que l'activit6 prot6olytique sp6cifique est significativement corr616e de faqon n6gative avec la teneur en argile des sols (r = -0,81). Le pH et la capacit6 d'6change du sol ne sont pas des param6tres significatifs. Ces r6sultats sugg6rent que les enzymes prot6olytiques extractibles sont associ6es ~ la mati6re organique et que leur extractabilit6 est frein6e par la teneur en argile, sans que le limon exerce un effet similaire.

Relation entre I'activitb protbolytique de NASF et les activitbs oxydasiques des Extraits NASF Les activit6s sp6cifiques prot6olytiques et oxydasiques ne sont pas corr616es. Les corr61ations rapport6es aux Tableaux 2 et 3 indiquent cependant que, si on excepte les sols de for6t, l'activit6 prot6olytique exprimbe par Kg sol est significativement corr616e avec la D O P A oxydase (r = 0,89), tandis qu'une tendance positive est constat6e avec la laccase (r = 0,67). Ces r6sultats sugg6rent que les conditions 6cologiques qui conditionnent la production des activit6s

protholytiques et oxydasiques sont similaires, cependant que la shquestration, ou ragrhgation, des enzymes prot6olytiques et oxydasiques aux composhs organiques de N A S F suivrait un mode diffhrent qui, actuellement, est fi l'6tude.

Relation entre l'activit6 protbolytique de NASF et la b iomasse L'examen des Tableaux 1, 2 et 3 indique que les activiths prot6olytiques sp6cifique et totale ne sont pas corrhlhes avec le nombre des bacthries, bacthries protholytiques, moisissures et actinomyc4tes, ce qui ne signifie pas n6cessairement que l'activit6 prot6olytique extractible soit ou ne soit pas d'origine v6ghtale. A c e propos, on rappelle que si les prot6ases v6g6tales (papaya, gramin6es) sont ghnhralement des prot6ases -SH, il faut-souligner que l'activit6 prot6olytique de la phas6oline des haricots ne dhpend pas des groupes -SH intacts. Nos r4sultats, joints a c e s observations, sugg6rent que si l'enzyme casholytique extractible pourrait 4tre d'origine v4g6tale, elle ne dhpend certainement pas du nombre des microorganismes. Les rhsultats rapporths au Tableau 4 donnent des 6claircissements, en ce sens que, dans un sol de prairie ayant ou non requ une fumure organique (inductrice d'une activit6 cas6olytique dans le sol), t'activit6 casholytique de l'Extrait N A S F suit 6troitement la croissance des bacthries prot6olytiques. L'activit6 prot6olytique extractible montre un maximum au mois de mai et un abaissement au cours de 1'6t6. Cette variation suit celle du nombre des bact6ries protholytiques, tout en 6tant inverse ~ celle du nombre des moisissures et des actinomychtes. Le fait que l'activit6 prot6olytique extractible soit lihe ~ la croissance bact6rienne dans les sols a 6t6 observ6 en conditions in vitro pour une bact6rie prot6olytique du sol, en l'occurrence le Bacillus polymyxa (Fogarty et Griffin, 1973). Pour autant que ron con-

Tableau 4. Variation de l'activit6 prot6olytique extractible (NASF) d'un sol frais en fonction de la saison* Sol non rum6 Param6tres Humidit6 du sol pH (H20) du sol ppm (NASF) CYo (NASF) N~o (NASF) ppm C (NASF) Prot6ase (activit6 sp6cifique) Prot6ase (unit6s totales) Teneur des microorganismes Bact6ries Bact6ries prot6olytique s Moisissures Actinomyc6tes

Avril

Mai

Juin

14,5 6,6 480 41,0 4,9 197

15,5 6,5 499 42,8 5,2 213

14,5 6,6 583 42,9 4,9 250

152

274

30 4800 90 1,4 760

Sol fum6 Septembre

Avril

Mai

Juin

9,0 6,5 621 40,7 4,6 252

13,0 6,65 520 43,0 5,3 223

17,0 6,30 519 41,7 5,3 216

13,5 6,80 623 43,7 5,4 272

8,0 6,7 528 41,7 4,7 220

198

172

162

326

205

239

58

50

43

36

70

56

52

9800

4200

2400

5600

9500

4400

4000

150 0,5 1040

170 0,6 3400

100 1,7 1100

190 2,1 1120

130 0,9 3200

110 2,0 1760

100 0,9 730

Septembre

* Sol de prairie h Michamps (Prov. Luxembourg): CYo 1,69; NTo 0,16. Dans le cas du sol fum6, on a proc6d6 l'6pandage de 30 Tonnes ha - t de lisier au cours de l'automne de l'ann6e pr6c6dente. Parties/106 NASF: mg poids lyophilis6 de NASF par sol frais (correspondant h 1 Kg poids sec). ppm C NASF: mg C-~ NASF par Kg sol. Prot~ase: 2 mg Extrait NASF; 100 #moles tampon Tris-borate pH 8,1; 5 mg caskine; volume total 2 ml; i.ncubation 1 h ~ 50°C. Activit6 sp6cifique: mUPK (Kaken) h -~ mg C -~ NASF. Unites totales: UPK Kg-t sol. Teneur des microorganismes ( x 10 3) des sols frais, rapport6e par g sol poids sec.

Propri6t6s des activit6s prot6olytiques

285

Tableau 5. Propri6t6s de l'activit6 prot6olytique extractible (ESF)* pH de la r6action

Tampon 50 ,umoles/ml

Temperature d'incubation (°C)

Concentration finale du substrat (cas6ine)

pH

5,0 6,0 7,0 8,5

Ac6tate Phosphate Phosphate Phosphate

50 50 50 50

2,50 2,50 2,50 2,50

---

Temp6rature

8,0 8,0 8,0 8,0 8,0

Phosphate Phosphate Phosphate Phosphate Phosphate

14 25 37 50 75

2,50 2,50 2,50 2,50 2,50

---

Concentration du substrat (eas6ine)

8,0 8,0 8,0 8,0

Phosphate Phosphate Phosphate Phosphate

50 50 50 50

0,25 0,50 1,25 2,50

---

lnhibiteurs

8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0

Phosphate Phosphate Phosphate Phosphate Phosphate Phosphate

50 50 50 50 50 50

2,50 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50

Variation des param6tres

Prot~ase activit6

Pourcentage relatif d'activit6 prot6olytique

62 130 300 420

15 31 7l 100

56 80 120 400 60

1,4 20 30 100 15

--

90 163 300 430

21 38 70 100

1AM 10 mM pCHgB 10/~M D F P 10 #r,I D F P 100 /~t,I EDTA 50 mM

440 390 440 294 268 440

100 88 100 67 61 1130

Inhibiteurs

--

---

* Dans chaque essai: 1 mg (0,5 mg C) Extrait ESF; volume total, 2 ml; incubation 1 h. Activit6 exprim6e en mUPK mg C-~ ESF. IAM--iodoac6tamide; pCHgB--p-chloromercuribenzoate; DFP--diisopr0pylphosphoftuoridate. Tableau 6. Inhibition de l'activit6 prot6olytique extractible (NASF) par le diisopropylphosphofluoridate (DFP)* NASF 6cht. no.

Prot6ase Inhibiteurs activit6 DFP 0,1 mM sp6cifique

1

-

1 5 5 7 7

+ + +

854 592 307 255 486 374

~o Inhibition 31 17 24

* NASF 1, C ~ = 38; NASF 5, C ~ = 37,4; NASF 7, C ~ = 41. Dans chaque essai: 2 mg NASF poids sec, dissous dans 1,7 ml tampon phosphate pH 8 (100 #moles); 1 rnl cas6inate sodique 5 nag m l - l ; DFP 0,1 mM; temperature d'incubation: 1 hr ~ 50°C. Activit6 sp6cifique exprim6e en mUPK h-1 mg C - t NASF.

sid6re un sol de prairie d6termin6, les r6sultats obtenus sugg+rent que les bact6ries prot6olytiques seraient l'agent biologique causal de l'activit6 prot6olytique extractible, tout en faisant remarquer que, si on compare une s6rie de sols entre-eux, ce param~tre biologique n'est pas significatif, par suite probablement de la nette prevalence des ph6nom6nes d'adsorption induits par la mati6re, organique du sol et des colloi'des argileux.

Propridt~s de l'activitd prot~olytique de l'Extrait ESF (Tableau 5) Effet de la matibre humique. On a utilis6 un Extrait ESF, qui a l'avantage d'61uder les interf6rences possibles dues ~ la mati6re humique. Par la comparaison des activit6s de NASF et de ESF provenant du sol 2, on constate que l'activit6 enzymatique sp6cifique double, par suite de l'61imination des mati~res humiques par d6sorption fi la salmine sulfate. Effet du pH. Le Tableau 5 montre que, en conditions in vitro, l'activit6 prot6olytique augmente fortement avec l'accroissement du pH. Le pH optimum est situ6 aux environs de 8,5, ce qui suppose que

l'enzyme prot6olytique extractible rentre dans le groupe des prot6ases neutres et/ou alcalines mises en 6vidence dans les sols (Ambroz, 1970; Ladd et Butler, 1972). Effet de la tempdrature. L'activit6 prot6olytique augmente avec la temp6rature dont l'optimum se situe aux environs de 50°C avec une d6naturation nette /t 75°C. L'optimum concorde avec celui constat6 par L a d d e t Butler (1972). A partir des valeurs num6riques de l'activit6 prot6olytique donn6es en fonction de la temp6rature, on calcule par la relation d'Arrh6nius, que l'6nergie d'activation (Eact.) vaut, dans l'intervalle 14°C-37°C: 5,8 Kcal mole- 1 °C- ~, ce qui implique sa nature enzymatique. Dans l'intervalle 37°C-50°C, Eact. = 20 Kcal indique que, parall6lement h un rel6vement de l'activit6 prot6olytique, une modification d'affinit6 enzyme-substrat se r6alise grace h l'intervention de facteurs physicochimiques. Effet de la concentration du substrat. L'activit6 cas6olytique suit une courbe de Michaelis-Menten. Portant les valeurs dans un graphique de Lineweaver-Burk, on estime que la vitesse maximum (V,,) est de 1000 m U P K mg C - 1 ESF, valeur qui d6passe toutes les activit6s mesur6es sous forme de NASF. La valeur K,, est de 2,2~ (pv) caskine. On peut faire remarquer, h ce propos, que cette valeur Km est du m~me ordre de grandeur que celle obtenue pour la prot6ase lib6r6e en conditions in vitro par Bacteroi'des amylophilus (Blackburn, 1968). Action des inhibiteurs. L'activit6 cas6olytique est peu sensible ~ l'iodoac6tamide (10 mM) et au p-chloromercuribenzoate (10 pM), indiquant qu'elle n'a pas de groupements sulfhydryles actifs libres ou s6questr6s. L'activit6 prot6olytique n'est donc pas du type papai'ne (Greenberg, 1955), par contre, rinhibition du diisopropylphospho fluoridate (DFP) (100 #M) est prononc6e (39 pour cent). La prot6ase doit donc ~tre consid6r6e comme faisant partie du groupe des skrine-prot6ases (Walsch et Wilcox, 1970). L'Extrait ESF n'est pas inhib6 par EDTA (50 mM). L'activit6 cas6olytique de ESF a des ressemblances avec les s6rine-prot6ases extracellulaires produites aux d6pens

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J. MAYAUDON, L. BATISTIC et J. M. SARKAR

de Myxobacterium (Whitaker, 1970) et de Streptomyces 9riseus (Narahashi, 1970) qui sont des microorganismes du sol. Ces s6rine-prot6ases ont, en c o m m u n avec r E x t r a i t ESF, d'etre inhib6es par le DFP. Sachant que les s6rine-prot6ases neutres sont inhib6es par E D T A et n o n par DFP, tandis que les s6rineprot6ases alcalines sont inhib6es par le D F P et n o n par EDTA (Narahashi, 1970), on peut estimer que l'activit6 prot6olytique de l'Extrait ESF pr6sente plut6t les caract6ristiques d'une s6rine-prot6ase alcaline. II reste ~ mentionner que les s6rine-prot6ases de Bacillus sont chimiquement caract6ris6es par une faible teneur en histidine (1 ~ 3~o poids) (Keay et al., 1970). Ce fait est ~t mettre en parall61e avec la teneur nulle obtenue ant6rieurement pour un Extrait E S F ( M a y a u d o n et al., 1973). Stabilitd des syst~mes enzymatiques diph~nol oxydasique et sdrine prot~ase associ~s gt l'Extrait E S F Dans l'6tat actuel des recherches, on doit admettre que l'Extrait E S F (libre de mati+res humiques) forme un compos6 de diph6nol oxydases et de prot6ase. Le probl6me se pose de savoir si ce m61ange est stable. En d'autres termes, l'activit6 diph6nol oxydasique de l'Extrait ESF serait-elle sensible /~ l'activit6 prot6olytique pr6sente ou introduite? En conditions in vitro (voir Mat6riel et M6thodes), il n'y a pas de d6gradation de l'activit6 m61anique par autodigestion prot6olytique ou par ajoute de lysozyme, par contre ractivit6 m61anique est inactive raison de 30 pour cent par la pronase et h raison de 100 pour cent par le traitement lysozyme + pronase. II faudrait donc admettre que, dans r E x t r a i t ESF, la fraction des polysaccharides, qui repr6sente le tiers en poids ( M a y a u d o n et al., 1973b) joue vraisemblablement un r61e t a m p o n et stabilisateur entre ces deux syst6mes dans les Extraits ESF et NASF. En conditions in situ, dans les sols, la pr6sence de bact6ries sporul6es du genre Bacillus et Streptomyces spp implique la s6cr6tion de lysozyme (Pollock, 1962; Salton, 1955), d o n t le p H o p t i m u m est situ6 aux environs de 9,2 (Davies et al., 1969). Ce fait explique que l'hydrolyse enzymatique des diph6nol oxydases ne serait efficace que dans des sols h r6action neutre ou alcaline, tout en faisant remarquer que cette hydrolyse enzymatique ne s'accompagne pas, dans les sols neutres, d'une inactivation, mais d'une d6polym6risation progressive des t6tram~res de diph6nol oxydases en sous-unit6s enzymatiquement actives qui peuvent ~tre mis en 6vidence dans les Extraits N A S F (Mayaudon et Sarkar, 1974b). Vu l'abaissement du pH, ce processus de d6polym6risation serait moins marqu6 dans la liti6re de CorOt ( M a y a u d o n et Sarkar, 1974a). Remerciemem~Recherches subventionn6es par l'lnstitut pour l'Encouragement de la Recherche Scientifique dans l'lndustrie et l'Agriculture (IRSIA), Belgique. BIBLIOGRAPHIE

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