Recherches biochimiques sur l'oogenèse

BIOCHIMIE, 1972, 54, 1069-1072.

Recherches biochimiques sur l'oogenbse. 4. Absence d'amplification des gbnes organisateurs du RNA 5 S et du tRNA dans les petits oocytes de Xenopus laevis. Maurice WEfNEZ et H e r m a n DENIS.

Laboratoire de B i o c h i m i e , Unioersitd de Liege, Place Delcour, 17, B-4000 Libge, Belgique. (8/6/1972).

Summary. - - Transfer RNA and 5 S RNA from cultured cells of Xenopus hteois were found to hybridize to the same extent with somatic DNA as with DNA from ovaries of immature females. Under the same conditions 28 S RNA hybridized about 40 times as well with ovary DNA than with somatic DNA. 5 S and tRNA genes are therefore not amplified in previtellogenic oocytes of X. laeois. However, these oocytes accumulate far more 5 S RNA and tRNA than 28 S and 18 S RNA. INTRODUCTION. Le RNA s ' a c c u m u l e en deux phases bien distinctes p e n d a n t l'oogen6se du c r a p a u d sud-africain X e n o p u s laeois. Au cours de la p r e m i 6 r e p h a s e (petit a c c r o i s s e m e n t ) , l ' o o c y l e synth6tise surtout du RNA de faible p o i d s mol6culaire. Dans l ' o o c y t e de 150 ,~ de diam6tre, le RNA 5 S et le tRNA f o r m e n t r e s p e c t i v e m e n t 40 p. cent et 35 p. cent du c o n t e n u r i b o n u c l 6 i q u e total de la cellule [1]. P e n d a n t la s e c o n d e p h a s e de l'oogen6se (grand a c c r o i s s e m e n t ) , l ' o o c y t e a c c u m u l e b e a u c o u p de RNA 28 S e t de RNA 18 S e t relativ e m e n t peu de RNA 5 S e t de tRNA, si bien que dans l'ceuf, les 4 classes de RNA sont pr6sentes en quantit6s fi peu pr6s 6 q u i m o l a i r e s [1]. D6s le d6but de l'oogen6se, les gbnes organisateurs du RNA 28 S et 18 S sont amplifi6s [2, 3, 4]. L ' o o c y t e c o n t i e n t e n v i r o n 2 000 000 de ces g6nes alors q u ' u n e cellule s o m a t i q u e n'en poss~de que 1 000 [5]. P o u r e x p l i q u e r l%norme a c c u m u l a t i o n de RNA 5 S et de tRNA observ6e au d6but de l'oogen~se, on peut s u p p o s e r que les g6nes organ i s a t e u r s de ces deux types de RNA sont eux anssi amplifi6s. Certes, B r o w n et D a w i d [2] n ' o n t pas d6tect6 d ' a m p l i f i c a t i o n des g6nes 5 S e t tRNA, mais ils n ' o n t e x a m i n 6 que les oocytes en g r a n d a c c r o i s s e m e n t , off la synth6se du RNA 5 S e t du tRNA est fort r6duite p a r r a p p o r t fi celle du BNA Abr6viations : tRNA : RNA de transfert. Tris : tris (hydroxym6thyl) - aminom6thane. EDTA : acide 6thyl6nedinitrilot6traac6tique, sel disodique. SSC : NaC1 150 mM, citrate de sodium 15 raM. SDS dod6cylsulfate de sodium.

28 S e t 18 S It, 6]. P o u r t i r e r cette question au clair, nous avons mesur6 l ' h y b r i d a t i o n du DNA s o m a t i q u e et du DNA de petits oocytes avec soit le tRNA, soit le RNA 5 S. C o n t r a i r e m e n t h ce que nous avons a n n o n c 6 dans une note pr61iminaire [7], les g6nes 5 S e t tRNA ne sont pas amplifi6s dans les petits oocytes de X. laevis. METHODES. Le DNA d ' o o c y t e s en petit a c c r o i s s e m e n t est e x t r a i t fi p a r t i r d ' o v a i r e s e n t i e r s de femelles inmaatures, m e s u r a n t 2,5 cm. La majorit6 des oocytes contenus dans ces o v a i r e s a 110 ~m de dianaOre El]. Le DNA s o m a t i q u e p r o v i e n t d'h6maties d ' i n d i v i d u s adultes. La p u r i f i c a t i o n du DNA c o m p o r t e les 6tapes suivantes : (1) suspension et b r o y a g e (pour les ovaires) dans 10 h 20 v o l u m e s de t a m p o n Tris 50 mM pH 8,0, EDTA r a M ; (2) a d d i t i o n de SDS ( c o n c e n t r a t i o n finale : 1 p. cent), puis de NaC10 4 ( c o n c e n t r a t i o n finale : 1M); (3) agitation p e n d a n t 30 m i n u t e s avec un volume 6gal de c h l o r o f o r m e , 24 v o l u m e s + alcool isoamylique, 1 v o l u m e ; (4) c e n t r i f u g a t i o n fi 10 000 t o u r s / r a i n p e n d a n t 10 m i n u t e s ; (5) r 6 c u p 6 r a t i o n du s u r n a g e a n t et r6p6tition des phases (3) et (4) ; (6) p r 6 c i p i t a t i o n fi l'6thanol - - 2 5 ° C p e n d a n t une nuit ; (7) r 6 c u p 6 r a t i o n tion ;

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Maurice Wegnez et Herman Denis.

(8) dissolution du pr6eipit6 dans 1 h 5 ml de 0,1 X S S C ; (9) t r a i t e l n e n t h la ribonucl6ase p a n c r 6 a t i q u e (Sigma) 100 ~ g / m l p e n d a n t 2 heures h 23°C ; (10) t r a i t e m e n t h la p r o n a s e 100 ~ g / m l p e n d a n t 2 heures h 23°C ; (11) 61imination de la p r o n a s e p a r t r a i t e m e n t au chloroforme + alcool i s o a m y l i q u e ; (12) r6p6tition des phases (4) h (8) ; (13) fixation du DNA sur une c o l o n n e d'album i n e m6thyl6e de 4 × 1,5 cm [:8] ; (14) r i n c a g e de la c o l o n n e avec 250 ml de NaC1 0,5 M, t a m p o n n 6 h pH 6,8 au m o y e n de phosphate 40 mM ; (15) 61ution du DNA dans 10 ml de NaC1 1 M, t a m p o n n 6 h pH 6,8.

20 C i / m m o l ) et de g u a n o s i n e [3HI (2,5 IxCi/ml ; 3 Ci/mmol). Le RNA, extrait p a r le proc6d6 au SDS-ph6nol froid, est d ' a b o r d pass6 sur u n e c o l o n n e de Sephadex G-100 (200 X 1,5 cm). Le p r e m i e r pic, c o r r e s p o n d a n t au RNA de p o i d s mol6culaire 61ev6, est r e p r i s et centrifug6 p e n d a n t 16 h e u r e s ~ 24 000 t o u r s / m i n dans u n g r a d i e n t de saccharose 5-20 p. cent. Le RNA 28 S, a i n s i s6par6 du RNA 18 S, est pnrifi6 p a r c h r o m a t o g r a p h i e sur c o l o n n e d ' a l b u m i n e m6thyl6e. I1 est ensuite secou6 avec un volume 6gal de ph6nol et dialys6 contre 4 litres de 2 X SSC. Le deuxi6me pic (RNA 5 S) et le troisi6me pic (tRNA) f o u r n i s p a r la c o l o n n e de Sephadex sont eux aussi purifi6s sur a l b u m i n e m6thyl6e, trait6s au p h 6 n o l et dialys6s contre 4 litres de 2 × SSC. RESULTATS ET DISCUSSION.

On obtient p a r cette m6thode h peu pr6s 4 5 i~g de DNA purifi6 p a r ovaire. Avant d'6tre h y b r i d 6 , le DNA est f r a c t i o n n 6 p a r centrifugation en g r a d i e n t de CsC1. Les 6chantillons de DNA sont amen6s ~ u n e densit6 de 1,7 g/cma par a d d i t i o n de CsC1 solide, puis centrifug6s ~ 35 000 t o u r s / r a i n p e n d a n t 3 jours dans le rotor SW39 de la Spinco, mod61e L. Le c o n t e n u des tubes de c e n t r i f u g a t i o n est divis6 en 10-15 fractions. On mesure la densit6 optique h 260 rim, puis on d 6 n a t u r e le DNA en ajoutant ~ chaque fraction 50 ,vl de KOH N. Apr6s 10 minutes, on rarn6ne le pH h 7 et l ' o n ajonte 5 ml de 6 X SSC. Chaque f r a c t i o n est filtr6e tr6s l e n t e m e n t h travers u n e m e m b r a n e Millipore (HA) de 2,4 cm de diam6tre. Les m e m b r a n e s sont s6ch6es p e n d a n t plusieurs heures h la t e m p 6 r a t u r e o r d i n a i r e , puis p e n d a n t 2 heures ~ 80°C [9]. P o u r les exp6riences d ' h y b r i d a t i o n , on place dans u n e m6me fiole 2 s6ries de m e m b r a n e s , l ' u n e p o r t a n t u n 6chantillon de D.NA somatique, l'autre p o r t a n t u n 6 c h a n t i l l o n de DNA d'ovaires. Les m e m b r a n e s sont incub6es p e n d a n t 4 heures h 70°C avec 3 h 8 ~g de RNA marqu6, dissous dans 2 ml de 2 X SSC. Q u a n d l ' h y b r i d a t i o n c o n c e r n e le RNA 5 S e t le tRNA, on ajoute au m i l i e u d ' i n c u b a t i o n u n g r a n d exc6s de RNA 28 S + 18 S n o n radioactif, afin de d i l u e r le RNA 28 S + 18 S qui p o u r r a i t c o n t a m i n e r le RNA 5 S et le tRNA marqu6s. Apr6s l ' i n c u b a t i o n , les filtres sont trait6s pend a n t 1 h e u r e $ 23°C au m o y e n de r i b o n u c l 6 a s e p a n c r 6 a t i q u e (10 r~g/ml), rinc6s sur chaque face avec 50 m l de 2 X SSC, s6ch6s et finalement compt6s. Le RNA utilis6 p o u r les exp6riences d ' h y b r i d a tion p r o v i e n t de celluIes rdnales cultiv6es p e n d a n t 5 jours en pr6sence d ' u r i d i n e [all] (10 ,t~Ci/ml ;

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Le RNA 28 S s ' h y b r i d e 40 fois m i e u x avec l e DNA d'ovaires qu'avec le DNA somatique (fig. 1). Le pic de r a d i o a c t i v i t 6 est d6cal6 p a r r a p p o r t au pic de densit6 optique. Ce d6calage est n o r m a l car le DNA r i b o s o m i q u e a u n e densit6 plus 61ev6e que le reste du DNA [2, 10I. Le r a p p o r t d ' h y b r i d a t i o n observ6 sur la f g u r e 1 entre le DNA d'ovaires et le DNA somatique est assez faible, et de b e a u c o u p

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Fro. 1. - - Hybridation du RNA 28 S de cellules cultiv6es avec du DNA d'h6maties (A) et d'ovaires (B). Dans chaque cas, 40 !~tg de DNA ont 6tfi centrifug6s en gradient de CsC1, d6natur6s, fix4s sur Millipore et hybrid6s avec 8 ~g de RNA 28 S (8 X 104 d6sint/min/ ~g). Direction de la centrifugation : de droite h gauche, Fractions de 0,5 ml.

i n f 6 r i e u r h celui que l'on d e v r a i t o b t e n i r (500) si l'on employait, au lieu de DNA d'ovaires entiers, du DNA d'ooeytes pur. Mais le DNA d'ovaires prov i e n t n o n seulement des cellules germinales de la glande, mais aussi des eellules somatiqnes, qui sont de loin les plus n o m b r e u s e s . Le DNA de ces cellules, dont les g6nes r i b o s o m i q u e s ne sont pas amplifi6s, dilue eelui des oocytes. Le tRNA s ' h y b r i d e aussi b i e n avec Ie DNA som a t i q u e qu'avec le DNA d'ovaires (fig. 2). Ici, le

R e c h e r c h e s b i o c h i m i q u e s s u r t'oogendse. p i c d e d e n s i t 6 o p t i q u e c o i n c i d e a v e c le p i c d e r a d i o a c t i v i t 6 . O n o b t i e n t le m 6 m e r 6 s u l t a t a v e c le RNA 5 S (exp6rience non pr6sent6e), h ceci pr6s q u e le p i c d e r a d i o a c t i v i t 6 se t r o u v e d u c6t6 <<16ger >> p a r r a p p o r t a u p i c d e d e n s i t 6 o p t i q u e . D a n s les c o n d i t i o n s e m p l o y 6 e s , le t R N A et R N A 5 S s a t u r e n t , r e s p e c t i v e m e n t 0,01 p. c e n t et 0,045 p.

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F~o. 2. - - H y b r i d a t i o n du tRNA de celhtles cultivdes avec du DNA d'h6maties (A) et d'ovaires (B). On a centrifug6 24 Ixg (A) et 19 p.g (B) de DNA en g r a d i e n t de CsC1, p u t s on l'a h y b r i d 6 avec 3,5 ~xg de tRNA m a r q u 6 (2,2 ><. 105 ddsint/min/l~xg) et 70 ~g de RNA 28 S -t- 18 S non marqu6. Direction de la centrifugation : de droite ~ gauche. F r a c t i o n s de 0,5 m].

c e n t d e la l o n g u e u r t o t a l e d u DNA. Ces v a l e u r s s o n t p r o c h e s d e c e l l e s q u ' o n t o b t e n u e s B r o w n et W e b e r [5] et B r o w n et al. [11]. I1 n ' y a d o n c p a s d'amplification d6celable des g6nes 5 Set tRNA. C e t t e c o n c l u s i o n n ' e s t v a l a b l e q u e d a n s la m e s u r e off l e s g 6 n e s a m p l i f i 6 s n ' o n t p a s 6t6 6 1 i m i n 6 s de facon pr6f6rentielle pendant l'extraction du DNA. U n e telle 6 v e n t u a l i t 6 s e r a i t fi e n v i s a g e r si les g b n e s a m p l i f i 6 s d u R N A 5 S e t d u t R N A 6 t a l e n t i n d 6 p e n d a n t s d e s c h r o m o s o m e s , c o m m e le s o n t les g 6 n e s 28 S e t 18 S d e l ' o o c y t e . P o u r 6tre stirs de ne perdre aucune mo16cule de DNA lors de l ' e x t r a c t i o n , n o u s a v o n s m o d i f i 6 le p r o c 6 d 6 d e p u r i f i c a t i o n e n 6 v i t a n t t o n t e p r 6 c i p i t a t i o n /~ l ' 6 t h a n o l ( p h a s e s 6 ~ 8) et e n la r e m p t a c a n t p a r u n e d i a l y s e c o n t r e d u 0,1 × SSC. A u s u r p l u s , le D N A n ' a p a s 6t6 fix6 s u r M i l l i p o r e , m a t s h y b r i d 6 e n s o l u t i o n a v e c le R N A m a r q u 6 . A p r b s t r a i t e m e n t /I la r i b o n u c l 6 a s e (10 ~ g / m l pendant 1 h e u r e ) , le m 6 1 a n g e D N A - R N A a 6t6 p a s s 6 s u r u n e c o l o n n e d e S e p h a d e x G-100. Le R N A 5 S h y b r i d 6 s o r t d e la c o l o n n e a u m 6 m e e n d r o i t q u e le D N A (fig. 3). O n c o n s t a t e d e n o u v e a u q u e le R N A 5 S n e s ' h y b r i d e p a s m i e u x a v e c le D N A d ' o v a i r e s q u ' a v e c le D N A s o m a t i q u e (fig. 3). Ce r 6 s n l t a t n ' e x c l u t p a s e n c o r e t o u t ~ f a i t l ' e x i s tence d'une amplification des gbnes 5 Set tRNA d a n s les p e t i t s o o c y t e s . E n effet, si c e t t e a m p l i f i c a t i o n 6 t a i t f a i b l e , elle p o u r r a i t p a s s e r i n a p e r c u e clans n o s e x p 6 r i e n c e s , c a r le D N A d ' o o c y t e s q u e

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nous avons employ6 6tait fortement contamin6 par du DNA somatique. Une amplification des g b n e s 5 S d e 100 fois se t r a d u i r a i t p a r u n r a p p o r t d'hybridation de 3 h 1 en faveur du DNA d ' o v a i r e ; u n e a m p l i f i c a t i o n d e 10 fois d o n n e r a i t u n r a p p o r t d e 1,2 h 1. C o m m e les r a p p o r t s d ' h y b r i dation observ6s n'atteignent pas cette valeur, nous en d6duisons que l'amplification des g6nes 5 Set d e s g b n e s t R N A , si elle e x i s t e , d o i t 6tre i n f 6 r i e u r e h 10 fois. C e t t e c o n c l u s i o n est e n c o r e r e n f o r c 6 e p a r les r 6 s u l t a t s d ' e x p 6 r i e n c e s d ' h y b r i d a t i o n s u r coupes histologiques r6alis6es en collaboration a v e c M m~ F i c q ( u n i v e r s i t 6 d e B r u x e l l e s ) . D e s coupes d'ovaires de femelles m6tamorphos6s d e p u i s q u e l q u e s s e m a i n e s o n t 6t6 i n c u b 6 e s s n i v a n t la t e c h n i q u e d e Gall et P a r d u e [12] a v e c d u R N A 5 S d e h a u t ~ a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e (106 d 6 s i n t / min/~g). Aprbs autoradiographie, on n'observe aucune hybridation pr6f6rentielle du RNA 5 S a v e c les c e l l u l e s g e r m i n a l e s d e l ' o v a i r e . D a n s les m 6 m e s c o n d i t i o n s , le R N A 28 S s ' h y b r i d e t r b s n e t t e m e n t a v e c la c a p s u l e e x t r a - c h r o m o s o m i q u e d e s o o c y t e s , o h est l o c a l i s 6 le D N A r i b o s o m i q u e a m p l i f i 6 [3], et p a s d u t o u t a v e c les n o y a u x s o m a tiques. B

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FiG. 3. - - H y b r i d a t i o n du RNA 5 S de cellules cultiv6es avec du DNA d'h6maties (A) et d'ovaires (B). On a incub6 p e n d a n t 4 heures h 70°C 17 ~l~g (A) et 13 !~g (B) de DNA avec 1,1 ~xg de RNA 5 S m a r q u 6 (3,75 X 105 d6sint/min/!~g) et 40 ;~g de RNA 28 S -418 S n o n marqud, dissous d a n s 1 m l de 2 × SSC. Le m61ange a 6t6 traitd h la ribonucldase (10 ~ g / m l ) p e n d a n t 1 h e u r e h 23°C, puts pass6 sur colonne de Sephadex G-100 (110 × 1,2 cm). F r a c t i o n s de 1,5 ml. La radioactivit6 a ~t6 mesuree aprbs prdcipitation h l'acide trichlorac6tique 5 p. cent et filtration sur Millipore. Les fl6ches i n d i q u e n t l ' e n d r o i t off ]e RNA 5 S est 61u6 du Sephadex q u a n d il n ' e s t pas h y b r i d 6 avec ]e DNA. La densit6 optique pr~sente d a n s les tubes 30 et s u i v a n t s est due h du RNA 28 S e t 18 S p a r t i e l l e m e n t d6grad6 p a r la ribonucl6ase.

L ' o o c y t e c o n t i e n d r a i t d o n c 2 000 000 d e g 6 n e s 28 S et 18 S, m a t s s e u l e m e n t 1 0 0 0 0 0 g 6 n e s 5 S et 40 000 g 6 n e s t R N A [5]. P o u r t a n t , l ' o o c y t e a c c u m u l e d u r a n t la p r e m i 6 r e p h a s e d e sa c r o i s s a n c e a u r o B i n s 150 m o l 6 c u l e s d e R N A 5 S et 200 m o l 6 c u l e s d e t R N A p o u r u n e m o l 6 c u l e 73

Maurice

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Wegnez

d e R N A 28 S e t u n e d e R N A 18 S [1]. Si l ' o n a d m e t q u e t o u s les t y p e s d e R N A p o s s b d e n t la m 6 m e s t a b i l i t 6 , ce q u i s e m b l e b i e n 6tre le c a s [6], il f a u t c o n c l u r e q u e les p e t i t s o o c y t e s t r a n s c r i v e n t l e u r s g b n e s 5 S et t R N A 3 000 h 10 000 l o i s p l u s v i t e - - o u p l u s f r 6 q u e m m e n t - q u e l e u r s g 6 n e s 28 S et 18 S. D a n s les g r o s o o c y t e s , le R N A 5 S e t le t R N A s ' a c c u m u l e n t h p e u p r 6 s "~ la m 6 m e v i t e s s e q u e d a n s les p e t i t s [17. I1 n e s e m b l e d o n c p a s q u e ce s o i t l ' a c t i v i t 6 d e s g b n e s 5 S e t t R N A q u i d i m i n u e a u m o m e n t off l ' o o c y ! e e n t a m e s o n g r a n d a c c r o i s s e m e n t , m a i s au c o n t r a i r e c e l l e d e s g b n e s 28 S et 18 S q u i a u g m e n t e de fa~on consid6rable.

et Herman

les oocytes en petit aeeroissement. Malgr6 cela, ces oocytes aecumulent beaucoup plus de RNA 5 S e t de tRNA que de RNA 28 S e t 18 S. ZUSAMMENFASSUNG.

Die Transfer-RNA und die 5 S-RNA yon X e n o p u s laevis h y b r i d i s i e r e n sowohl mit der Soma-DNA als mit der DNA, welche aus Ovarien yon i m m a t u r e n Weibchen stammt. U n t e r denselben Bedingungen h y b r i d i s i e r t die 28 S-RNA ungefiihr 40 Mal besser mit der Ovarien-DNA als mit der Son~a-DNA. Die Organisator-Gene der 5 S-RNA und der tRNA w e r d e n also in den Oozyten nicht amplifiziert. Trotzdem h~iufen diese Oozyten viel m e h r 5 S-RNA und tRNA als 28 Sund 18 S-RNA an.

BIBLIOGRAPHIE.

R e m e r c l e m e n ts. M. ~vVegnez est h o u r s i e r de l ' I n s t i t u t pour I'Encour a g e m e n t de la Recherche Scientifique dans l ' I n d u s t r i e et l'Agrieulture. Nous remercions le P r o f e s s e u r M. E r r e r a pour nous avoir permis de faire les cultures de cellules dans son laboratoire et le P r o f e s s e u r R. Monier pour avoir b i e n voulu lire et eritiquer le manuscrit.

1. 2. 3. 4.

R~SUM~:.

8.

Le RNA de t r a n s f e r t et le RNA 5 S de X e n o p u s laevis s ' h y b r i d e n t aussi hien avee le DNA somatique qu'avee le DNA p r o v e n a n t d'ovaires de femelles i m m a t u r e s . Dans les m~mgs conditions, le RNA 28 S s ' h y b r i d e environ 40 fois mieux avee le DNA d'ovaires qu'avee le DNA somatique. Les g~nes organisateurs du RNA 5 S et du tRNA ne sont done pas amplifi6s dans

9.

BIOCHIM1E, 1972, 54, n ° 8,

Denis.

5. 6. 7.

10. 11. 12.

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