Recherches experimentales sur le maedi-visna

Comp. Immun. Microbiol. infect. Dis. Vol. I1, No. 1, pp. 35-41, 1988 Printed in Great Britain

0147-9571/88 $3.00+0.00 Pergamon Press plc

RECHERCHES EXPERIMENTALES SUR LE MAEDI-VISNA P. R u s s o ~, C. VITU', R. VIGNE 2, P. FILIPPI 2 et A . GIAUFFRET 1 a v e c la c o l l a b o r a t i o n

technique de

V. DELOR l, M . VIGNONI l e t N. SAUZE 2 ~Minist~re de l'Agriculture, Services V6t6rinaires, Laboratoire National de Pathologie des Petits Ruminants et des Abeilles, 63, avenue des Ar6nes, 06051 Nice Cedex et 2Unit6 INSERM, Laboratoire de Virologie, Facult~ de M~decine Nord 13326 Marseille Cedex 15, France (Refu le 16 septembre 1987) R6sum6----Dans le but d'6tudier le pouvoir pathog6ne des lentivirus du mouton, d'obtenir des s6rums monosp6cifiques et de mettre au point une r6action ELISA, 3 exp6rimentations 6chelonn6es sur quatre ann6es et faisant intervenir diff6rentes souches de maedi-visna ont 6t6 mises en place. Darts l'exp6rimentation 1, un seul clone (sur 3) d'une souche fran~aise de maedi-visna (ref. 564-79) entraine une s6roconversion nette chez les animaux inocul6s. Darts l'exp6rimentation 2, la souche de r6f6rence K1514 entraine une r6ponse humorale plus importante que les souches K796 et PPV; la voie d'inoculation intratrach6ale semble plus efficace que la voie intrac6r6brale. L'inoculation de mutants ts (exp6rimentation 3) montre que la positivit6 en ELISA est plus pr6coce qu'avec la souche parentale; l'intensit6 des r6ponses s6rologiques est n6anmoins plus faible. Ces r6sultats font apparaitre que l'expression des mutants ts n'est pas totalement r6prim6e chez le mouton. L'absence de signes cliniques et de 16sions anatomiques et histopathologiques contraste avec l'isolement fr6quent de virus ~i partir des cellules blanches circulantes. Ces r6sultats nous sugg6rent les remarques suivantes: rapparition 6ventuelle des signes cliniques dans les troupeaux infect6s peut ~tre li6e ~ diff6rents facteurs favorisants; tous les clones ne sont pas infectieux; l'infection virale pourrait n'~tre effective qu'en pr6sence de plusieurs types de virions. Mots clefs: Lentivirus, ovin, mutants, ELISA, exp6rimentation EXPERIMENTAL

RESEARCH

ON

MAEDI-VISNA

Abstract--In order to study pathogenicity of sheep lentiviruses, to obtain monospecific sera and to perfect ELISA, 3 experiments with different strains were carried out for 4 yr. In expt I, one clone only of a French maedi-visna strain (564-79) elicits a clear seroconversion in inoculated sheep. In expt 2, K 1514 is more immunogenous than K796 and PPV: intratracheal route seems more efficient than intracerebral route. Sheep infected by ts mutants (expt 3) are early positive as wild strain K796. Nevertheless, the level of positivity is less important than for the parental strain, suggesting that the defect of the ts mutants is not limiting their replication in vivo. An important result is the lack of clinical signs and anatomical and histopathological lesions, in spite of frequent isolations of virus from buffy coat cells. These results suggest that: different enhancing factors have to be taken in account in the apparition of clinical signs; all the clones are not infectious; viral infection might be effective with several types of virions. Key words: Lentivirus, sheep, mutants, ELISA, experimentation

INTRODUCTION L e v i r u s m a e d i - v i s n a , d e la f a m i l l e d e s r 6 t r o v i r u s , p r o v o q u e l ' a p p a r i t i o n c h e z le m o u t o n e t la c h 6 v r e , d e 2 t a b l e a u x c l i n i q u e s c l a i r e m e n t d i s t i n c t s : u n e a t t e i n t e n e r v e u s e d 6 g 6 n 6 r a t i v e 35

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P. R u s s o e t al.

(visna) et une pneumonie interstitielle (maedi). Ces 2 maladies sont d'expression lente et progressive; l'apparition des signes cliniques entraine l'animal vers une mort in61uctable au bout de plusieurs mois, voire plusieurs ann6es. Des souches virales de visna ont 6t6 isol6es en Islande en 1960 [1] et sont consid6r6es actuellement comme des prototypes utilis6s dans un grand nombre de laboratoires. Le virus maedi a 6t6 isol6 quelques ann6es plus tard, ~i partir de 16sions pulmonaires [2]. D'autres isolements ont suivi aux Etats-Unis [3, 4] et en Europe [5-8]. La distinction entre les 2 virus n'est cependant pas claire, le virus isol6 du syst6me nerveux central peut provoquer une pneumonie progressive; d'autre part, une souche isol6e de poumon atteint peut provoquer des 16sions nerveuses [2]. Notons que l'atteinte nerveuse est exceptionnelle en Europe actuellement lors de maladie naturelle, la forme pulmonaire dominant g6n6ralement le tableau clinique. Dans la sous-famille des lentivirus, on peut ~. l'heure actuelle consid6rer maedi et visna comme un seul et m~me virus. L'introduction relativement r6cente dans ce groupe, des virus LAV et HTLVIII [9] donne un int6r& certain ~t l'&ude des lentivirus des petits ruminants. Dans le but d'6tudier le pouvoir pathog6ne de ces virus, d'obtenir des s6rums monosp6cifiques et de mettre au point une r6action ELISA, nous avons mis en place, il y a plusieurs ann6es [10], 3 exp6rimentations distinctes: l'&ude du pouvoir pathog6ne de diff6rents clones de la premiere souche fran~aise de maedi [8], l'~tude in vivo de 3 souches prototypes de maedi-visna et l'6tude exp6rimentale de l'att6nuation du pouvoir pathog6ne de mutants thermosensibles d'une souche de r+ference; cette derni6re exp6rimentation avait ~galement pour but l'6tude de l'effet 6ventuellement protecteur de ces mutants. Les r6sultats de ces exp6rimentations font l'objet du pr6sent article. MATERIEL ET METHODES Trente quatre ovins de race Pr6alpes du Sud ag6s d'environ 6 mois et issus d'un troupeau indemne de maedi-visna, ont fait l'objet du protocole suivant: - - 6 ont 6t6 inocul6s par la voie intratrach6ale (IT) avec 3 clones d'une souche franqaise de maedi 564-79 [8]; ~ 4 ont ~t~ inocul6s avec la souche prototype de visna K 1514 [1], 2 par voie intratrach6ale et 2 par voie intra-c~r~brale (IC); --le m~me protocole a 6t6 r6p(~t~ pour les souches K796 de visna [1], PPV de maedi [3] et pour 2 mutants thermosensibles ts 77 et ts 157. Ces mutants ts ont 6t6 obtenus par action de la nitrosoguanidine sur le g6nome de la souche K796 [10]; ils ont ensuite ~t~ clon~s par la technique des plages [11]. Tous ces animaux ont re~u environ 106 U F P de suspension virale et ont 6t6 gard6s en boxes s6par6s, ainsi que 4 animaux t6moins, non inocul6s. L'ensemble de ces groupes a fait l'objet d'une prise de sang toutes les 2 semaines. Leur r6ponse humorale a 6t6 6tudi6e par: immunodiffusion en g~lose (IDG) fixation du compl~ment ELISA s6roneutralisation (SN) vis ~ vis des souches K 1514 ET PPV. Toutes ces techniques ont 6t6 d6crites par ailleurs [10].

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Tout au long de cette exprrimentation qui a dur~ environ 4 ans, des essais d'isolement de virus ont 6t6 entrepris ~i partir des leucocytes circulants, en coculture avec des cellules de plexus choroides ovins. Les animaux encore vivants au bout de quatre annres ont 6t6 sacrifirs; aprrs autopsie et examen anatomopathologique, un grand nombre de leurs organes a fait l'objet d'une 6tude histopathologique et virologique. RESULTATS

Expbrimentation 1 (souche 564-79) Les 6 animaux inoculrs avec la souche frangaise de maedi ont 6t6 suivis durant 44 mois. Nous n'avons observ~ aucun signe clinique particulier; seul un des agneaux inocui6 avec le clone 2 a prrsent6 une pneumonie transitoire classique. Le suivi srrologique de ces animaux a donn6 les rrsultats suivants: --les agneaux inocul~s avec les clones 1 et 3 sont restrs nrgatifs en I D G et en FC' pendant toute la durre de l'exprrimentation. Seul l'un de ceux inoculrs avec le clone 1 se positive assez nettement en ELISA (7 en mode matrix, pour un seuil de positivit6 ~ 5). --les agneaux inoculrs avec le clone 2 se positivent fortement en IDG, en FC' et en ELISA, particulirrement l'agneau 2B (Fig. 1): positif en FC' ( + + 1/10) au 46me mois pi, avec un maximum au 1/80 au 86me mois pi; la fluctuation des taux est plus nette qu'en ELISA; positif en I D G au 66me mois pi jusqu'~i 32 mois aprrs inoculation; les anticorps pr6cipitants chutent sans raison apparente par la suite. seule la souche K1514 neutralise au 1/80 le s6rum de l'agneau 2B durant la prriode off il pre~ente un taux srrologique maximum en ELISA; on note 6galement que la FC' et I'IDG sont positives. Par contre, les srroneutralisations vis/l vis de la souche PPV se sont toujours rrvrlres nrgatives. Nous n'avons pas eu la possibilit~ d'6tudier l'apparition des anticorps neutralisant la souche homologue.

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Fig. 1. Comparaison des 3 tests sgrologiques (immunodiffusion en grlose, ELISA et fixation du complrment) sur l'agneau 2B inocul6 par voie intratrachrale avec le clone n°2 de la souche 564-79 de maedi. • • FC'; • • ELISA; + - - I D G .

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Une vir6mie transitoire a 6t6 mise en 6vidence sur 2 animaux (un s6ropositif et un s6ronggatiO. Les examens effectu6s A l'autopsie et l'histopathologie n'ont apport6 aucun 616ment int6ressant.

Experimentation 2 (souches prototypes KI514-K796-PPV) Sur les 3 groupes de 4 animaux, nous n'avons constat6 aucun signe clinique particulier durant les 44 mois d'exp6rimentation. Sur le plan s6rologique, la souche K 1514 entraine une r6ponse plus importante que K796 et PPV: test ELISA ~i 8-9, FC' positive au 1/80 et 1/160, I D G positive pour les 4 animaux. De plus, la souche K1514 donne une r6ponse humorale plus nette par voie intratrach6ale qu'intra c6r6brale (Fig. 2). La FC' est moins stable que I'ELISA; ses titres diminuent alors que les valeurs ELISA continuent ~ monter. Les r~ponses s6rologiques r6vSl6es en I D G sont plus faibles que dans la 16re exp6rimentation. La Figure 3(a) compare les r6ponses s+rologiques en I D G et en ELISA pour deux agneaux (2T1 et 3T2) respectivement inocul6s avec K796 et PPV par voie intratrach6ale: en ce qui concerne la r~ponse s6rologique, la souche PPV est la moins active des 3 souches de r&~rence.

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Fig. 2. Souche K1514 de visna: influence de la voie d'inoculation. La r6ponse humorale est plus forte dans les 3 tests apr6s inoculation intratrach6ale (1T1),

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Fig. 3. (a) ELISA: Cin6tique des anticorps pour un animal inocul6 par voie intratrach6ale avec K796 (2TI) et un animal inocul6 avec PPV par la memo voie (3T2). Les anticorps pr6cipitants sont repr6sent6s au-dessus de la ligne des abscisses. (b) ELISA: Cin6tique moycnnc des anticorps r6v616es chez les 8 animaux avec les 2 mutants ts77 et ts 157. /

Nous constatons 6galement que, contrairement ~t K1514, l'inoculation intratrachrale de PPV et K796 n'est pas plus efficace que par voie intracrrrbrale. Seul le srrum des animaux inoculrs avec la souche K1514 a neutralis6 la souche homologue. La souche K796 n'a entrain6 l'apparition d'aucun anticorps neutralisant dans les 3 groupes. Les examens anatomiques et histopathologiques ont 6t6 nrgatifs. Plusieurs souches virales ont 6t6 isolres dans les diffrrents groupes tout au long de l'exprrimentation fi partir des globules blancs circulants. L'isolement in vitro ii partir de diffrrents organes a permis de mettre en 6vidence un effet cytopathique (ECP) pour les 3 groupes inoculrs, ~ partir du systrme nerveux central, du poumon, du liquide crphalo rachidien et des plexus choroi'des. Nous n'avons pas eu la possibilit6 d'approfondir l'rtude biochimique de ces souches virales isolres.

Expbrimentation 3 Elle a port6 sur l'rtude de 2 mutants thermosensibles (ts77 et ts 157). La biosynthrse protrique de ces mutants a entre temps 6t6 6tudire, fi temprrature permissive (33°C) et restrictive (41°C). Sur cellules de plexus choroides, un ECP est mis en 6vidence ~, 33°C et non ~, 41°C. Alors que les titres de la souche parentale K796 sont

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de 105 fi 10 6 DCP50/ml fi 33 et 41°C, les mutants ts ne produisent du virus fi un niveau d6tectable (10 4) qu'~l. 33°C [10]. L'6tude de ces 2 mutants ts en immunopr6cipitation a montr6 que l'alt6ration du ts77 se situe au niveau de la production de prot6ines virales intracellulaires; l e t s 157 est probablement modifi6 au niveau de l'6tape de maturation du virion [10]. La s6rologie observ6e sur 34 mois montre que la r6ponse ELISA est moyenne pour les 8 animaux inocul6s avec ces 2 mutants (valeur 6). Ni la voie intratrach6ale, ni la voie intrac6r6brale ne privil6gie une r6ponse s6rologique importante. Le seuil de positivit6 (valeur 5) est atteint au 26me mois pi [Fig. 3(b)]. Avec la souche sauvage K796, le m6me seuil est atteint au 46me mois pi mais les valeurs ELISA sont nettement plus 61ev6es [Fig. 3(a)]. L ' I D G est totalement n6gative. Une souche virale, dont l'&ude n'a pas 6t6 approfondie, a 6t6 isol6e ~i partir des globules blancs circulants d'un animal inocul6 avec ts 77. De plus, les recherches anatomiques et histopathologiques n'ont donn6 aucun r6sultat. Ces mutants ts avaient 6t6 inocul6s en double de mani6re ~i pouvoir appr6cier une 6ventuelle protection apr6s 6preuve virulente. Des mortalit6s non sp6cifiques ne nous ont pas permis d'entreprendre cette 6tude.

DISCUSSION ET CONCLUSION Ces exp6rimentations nous conduisent aux remarques suivantes: Les souches 564-79, K1514 et PPV ont 6t6 inocul6es par voie intratrach6ale et intrac6r6brale. Les r6ponses humorales obtenues sont plus importantes pour K1514 que pour K796. Une r6ponse identique est obtenue pour 564-79 par rapport ~i PPV. La souche K1514 entraine,/t dose d'inoculation 6gale, une r6action s6rologique plus forte que les 3 autres souches. Cette r6ponse est encore plus importante chez les animaux ayant requ le virus par voie intra-trach6ale. Afin de d&erminer si l'amplitude des r6ponses s6rologiques est li6e ~i la virulence des souches, il serait n6cessaire de conduire une exp6rimentation avec une souche hypervirulente [12]. L'&ude cin6tique des r6ponses s6rologiques indique que I'ELISA est la technique la plus sensible et permet de comparer in vivo l'activit6 des diff6rentes souches de maedi-visna [13]. De plus, la pr6cocit6 d'apparition de ces anticorps permet d'envisager son utilisation dans le but d'6radiquer la maladie dans un troupeau. Dans cette exp6rimentation, les anticorps fixant le compl6ment apparaissent plus pr6cocement que les anticorps pr6cipitants. Cette observation confirme l'importance du choix des souches utilis6es comme antig6ne et des techniques de pr6paration. Remarquons 6galement que la fixation du compl6ment et l'immunodiffusion en g61ose montrent une n6gativation transitoire de leurs anticorps respectifs. La FC' n'est pratiquement plus utilis~e ~t l'heure actuelle; I'IDG peut par contre ~tre r6serv~e ~ un diagnostic de troupeau. L'interpr6tation de la s6roneutralisation semble d61icate; nous constatons des diff6rences dans la capacit6 qu'ont ces souches d'induire et de r6v61er des anticorps neutralisants homologues ou h&6rologues. L'6tude de ces anticorps apparait n6anmoins utile dans l'optique d'un travail plus fondamental sur les lentivirus. L'6tude in vivo des mutants ts77 et ts157 a montr6 que si la positivit6 en ELISA apparait plus pr6cocement qu'avec la souche parentale, l'intensit6 des r6ponses s6rologiques est

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beaucoup plus faible. Ces r6sultats sugg6rent que la replication de ces mutants n'est pas totalement r6prim6e chez le mouton. Un des r6sultats importants de ce long travail est repr6sent6 par le paradoxe existant entre la multiplicit6 des r6ponses s6rologiques alli6e 5. des isolements r6guliers de virus d'une part et l'absence de signes cliniques, de 16sions anatomiques et histopathologiques d'autre part. Ces observations montrent que, si rinfection est r6guli6re, la sensibilit6 l'expression clinique peut varier d'une race ~i l'autre. Des facteurs favorisants peuvent 6galement influencer l'apparition des signes cliniques: gestation, variations climatiques, d6s6quilibre alimentaire, sollicitation intensive de l'activit6 du troupeau. D'autre part, les suspensions virales inocul6es ont 6t6 clon6es. L'expression virale pourrait n'6tre effective qu'en pr6sence de plusieurs types de virions. Les r6sultats obtenus peuvent 6galement sugg6rer que tousles clones ne sont pas infectieux. L'obtention d'un mod61e exp6rimental 5. expression clinique rapide permettrait d'approfondir ces hypothdses. Ces perspectives peuvent ouvrir la voie fi une approche plus fondamentale des lentivirus, tant animaux qu'humains; le syndrome d'immunod6ficience acquise (SIDA) enest un bon exemple. Remerciements--Nous exprimons notre vive gratitude au Service d'Histologie du Laboratoire Central de Recherches V6t6rinaires d'Alfort (K. Irgens et J. P. Gillet) pour avoir bien voulu se charger des examens histopathologiques. BIBLIOGRAPHIE 1. Sigurdson B., Thormar M. et Palsson P. A. Cultivation of visna virus in tissue culture. Arch. Ges. Virusforsch. 10, 368-381 (1960). 2. Gudnadottir N. et Palsson P. A. Transmission of maedi by inoculation of a virus grown in tissue culture from maedi-affected lungs. J. Infect. Dis. 117, 1 ~ (1967), 3. Kennedy R. C., Eklund C. M., Lopez C. et Hadlow W. J. Isolation of a virus from lungs of Montana sheep affected with progressive pneumonia. Virology 35, 483-484 (1968). 4. Cutlip R. C. et Laird G. A. Isolation and characterisation of a virus associated with progressive pneumonia (maedi) of sheep. Am. J. vet. Res. 37, 1377-1382 (1976). 5. De Boer G. F. Zwoegerziekte, een persis terende virus infectie bij schapen, Oorsprenkelijke artikelen. Tijdschr. Diergenses 95, 725-740 (1970). 6. Krogsrud J. et Udnes Maedi (progressive interstitial pneumonia in sheep). Diagnosis, epizootiology, prevention and control program in Norway. Bull. Off. Int. Epiz. 89, 451-464 (1978). 7. Dawson M., Chasey D., King A. A., Flowers M. J., Day R. H., Lucas M. H. et Roberts D. H. The demonstration of maedi-visna in sheep in Great Britain. Vet. Res. 105, 220-223 (1979). 8. Russo P., Giauffret A., Lasserre M. et Sarrazin C. Isolement et ~tude d'une souche de virus maedi-visna chez le mouton en france. Bull. Acad. V~t. Fr. 53, 287-293 (1980). 9. Sonigo P., Alizon M., Staskus K., Klatsmann D., Cole S., Danos O., Retzel E., Tiollais P., Haase A. et Wain-Hobson S. Nucleotide sequence of the visna lentivirus: relationship to AIDS virus. Cell 42, 369-382 (1985). 10. Vitu C., Russo P., Vigne R., Filippi P., Querat G., Sauze N., Vignoni M. et Delor V. Comparative study of several strains of maedi-visna viruses and several ts mutants of visna virus: viral protein biosynthesis in infected cells and ELISA detection of antibodies to visna virus in experimentally infected sheep. In Slow Viruses in Sheep, Goats and Cattle (Edited by J. M. Sharp and R. Hoff-Jorgensen), pp. 51-58. Luxembourg CEE (1985). 1 I. Trowbridge R. S. Evaluation of a plaque assay for the maedi-progressive pneumonia visna viruses. Appl. Microbiol. 28, 366-373 (1974). 12. Lutley R., Petursson G., Georgsson G., Palsson P. A. et Nathanson N. Strains of visna virus with increased neurovirulence. In Slow Viruses in Sheep, Goats and Cattle (Edited by J. M. Sharp and R. Hoff-Jorgensen), pp. 45-49. Luxembourg CEE (1985). 13. Vitu C., Russo P., Filippi P., Vigne R., Querat G. et Giauffret A. An ELISA test for detection of maedi-visna antibodies. Comparative study with gel immunodiffusion and complement fixation test. Comp. Immun. Microb. infect. Dis. 5, 469-481 (1982).