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Recherches biochimiques sur l'oogenèse
Recherches biochimiques sur l'oogen se. 7. Synth~se et maturation du RNA 5 S dans les petits oocytes de Xenopus laevis. Herman
DENIS et M a u r i c e WE6NEZ ( ' ) .
Laboratoire de Biochimie, Facult~ des Sciences, Universit~ de Liege, Place Delcour, 17, B-4000 Liege, Belgique. (5-6-1973). S u m m a r y . - As s h o w n previously, 5 S RNA s y n t h e s i z e d by small oocytes of Xenopus :aevis is stored for several m o n t h s before being i n c o r p o r a t e d into the ribosomes. In this paper we c o m p a r e the properties of n e w l y - f o r m e d 5 S RNA w i t h those of 5 S RNA stored in the oocyte. Ne'wly-synthesized 5 S RNA and bulk 5 S RNA differ b o t h by t h e i r electrophoretic m.obility and b y t h e i r c h r o m a t o g r a p h i c b e h a v i o u r . We propose the following scheme for p o s t - t r a n s c r i p t i o n a l processing of 5 S RNA in oocytes. 5 S RNA first appears as a p r e c u r s o r (form A) c o n t a i n i n g m o r e t h a n 135 nucleotides. The p r e c u r s o r is t h e n q u i c k l y s h o r t e n e d at the 3'-end and gives rise to a second f o r m (B) c o n t a i n i n g 80 p. cent molecules w i t h 120 nucleotides and 20 p. cent w i t h 121 or 122 nucleotides. F o r m B is v e r y slowly converted into the storage f o r m (C) of 5 S RNA. Most molecules of f o r m C contain 120 nueteotides, b u t 15 to 2{) p. cent of t h e m contain 119 or 118 nucleotides. In somatic ceils, ~'e lind no indication of a l o n g - t e r m modification s i m i l a r to t h a t observed in oocytes. The scheme outlined above is supported b y the following observations. (1) 32P-labelled 5 S RNA contains a small p r o p o r t i o n of mo]eeules which are longer t h a n b u l k 5 S RNA by at least 15 nucleotides. These e x t r a - n u e l e o t i d e s are located at the 3'-end of the molecule. (2) N e w l y - f o r m e d 5 S RNA (form B) is slightly longer at the 3'-end t h a n bulk 5 S RNA. This could be d e m o n s t r a t e d by m e a s u r i n g the e l e e t r o p h o r e t i e m o b i l i t y of the 3 ' - t e r m i n a l f r a g m e n t (nucleotides 90-120) o b t a i n e d a f t e r p a r t i a l h y d r o l y s i s w i t h T~ ribonuetease. After excision of the nucleotides t h a t follow r e s i d u e nr 118 b y m e a n s of snake v e n o m phosphodiesterase the c h r o m a t o g r a p h i c b e h a v i o u r of n e w l y - s y n t h e s i z e d 5 S RNA becomes idenlical to t h a t of bulk 5 S RNA. (3) Three different 3 ' - t e r m i n a l oligonucleotides were detected in 32P-labelled 5 S RNA (CpUpU, CpUpUpU and CpUpUpUpU) a f t e r h y d r o l y s i s w i t h T, ribonuelease. CpUpU is the most f r e q u e n t t e r m i n a l oligonueleotide. As m a n y as 8 different 3'-ends were observed in b u l k 5 S RNA. The m o s t f r e q u e n t one is CpUpU, as in n e a r l y - f o r m e d 5 S RNA (63 p. cent of all ends). The CpUpUpU and CpUpUpUpU ends occur in v e r y few molecules (3 p. cent). Two 3'-ends (C.pU a n d C : 16 p. cent of all ends) correspond to molecules s h o r t e r b y 1 to 4 nueleotides t h a n n e w l y - m a d e 5 S RNA. The r e m a i n i n g 3 ends (Gp~pApApU,
Gp~pApV
and CpGpU : 18 p. cent of all ends) were detected only in bulk 5 S RNA. These c a n n o t derive f r o m the 3'-ends observed in n e w l y - f o r m e d 5 S RNA b y a m e r e loss of t e r m i n a l nueleotides. (4) After labelling w i t h 32p, the u r i d y l i e residues of the 3 ' - t e r m i n a l oligonueleotides (CpUpU, CpUpUpU and CpUpUpUpU) a l w a y s h a v e a h i g h e r specitie activity t h a n the cytidylie residue. This suggests a t u r n o v e r of t h e 3'-end ~vhieh m i g h t he related to the v e r y slow s h o r t e n i n g t h a t 5 S RNA undergoes during its storage in the oocyte.
Abrdoiations : SDS : dod6cylsulfate de sodium. tRNA : RNA de t r a n s f e r t . A : acide ad~nylique. C : c y t i d i n e ou acide c y t i d y l i q u e . C ' : h y d r o x y m 6 t h y l e - d i O h y l ~ n e - g l y c o i cytosine. G : aeide g u a n y l i q u e . G! : acide g u a n y l i q u e 2', 3' eyelique. U : u r i d i n e ou acide u r i d y l i q u e . U ' : h y d r o x y m d t h y l e - d i ~ t h y l 6 n e - g l y e o l uracile. P o u r r e p r d s e n t e r la s6quence des oligonucl~otides t e r m i n a u x du RNA, nous utilisons la n o t a t i o n : CpUpU. P o u r les oligonucldotides int6rieurs et la s6quence compl6te, nous utilisons la n o t a t i o n : UUAG etc. (') Adresse actuelle des a u t e u r s : Centre de G6n6tique mol6eulaire, CNRS, F-91190 Gif-sur-Yvette, France.
INTRODUCTION. Au c o u r s de son a c c r o i s s e m e n t , l ' o o c y t e de x 6 n o p e a c c u m u l e 30.0.00.0 f o i s p l u s d e R N A q u ' u n e c c l l u l e s o m a t i q u e . L ' a c c u m u l a t i o n d u R N A 28 S et 18 S est r e n d u e p o s s i b l e p a r u n e a m p l i f i c a t i o n d e s g 6 n e s c o r r e s p o n d a n t s [1, 2, 3]. E n r e v a n c h e , les g b n e s o r g a n i s a t e u r s d u R N A 5 S e t d u t R N A n e s o n t p a s a m p l i f i 6 s [3, 4}. B i e n q u ' i l p o s s ~ d e b e a u c o u p m o i n s d e g 6 n e s 5 S q u e d e g ~ n e s 28 S et 18 S, l ' o o c y t e a c c u m u l e a u t a n t d e m o 1 6 e u l e s 5 S q u e d e m o l 6 c u l e s 28 S et 18 S. I I s ' e n s u i t q u e 1¢~
H. D e n i s el M. W e g n e z .
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g~nes 5 S doivent p r o d u i r e plus de mol6cules de BNA que les gSnes 28 S et 18 S. Geci explique p o u r q u o i les gSnes 5 S sont actifs p e n d a n t route la dur6e de l'oogen~se, alors que Ies gbnes 28 S e t 18 S ne le sont que p e n d a n t la partie t e r m i n a l e de ce processus (vitellogenbse ou grand aceroissem e n t ; r6f. [5, 6]). Par ailleurs, les oocytes augm e n t e n t leur p r o d u c t i o n de RNA 5 S par r a p p o r t aux cellules somatiques en e x p r i m a n t la totalit6, ou tout au moins la majeure p a r t i e des gbnes 5 S qu'ils possbdent, alors que les cellules somatiques n'utilisent qu'une p a r t i e de ces g/rues [7, 8]. P e n d a n t la phase initiale de l'oogenbse (petit a c c r o i s s e m e n t ) , l'oocyte synth6tise surtout du RNA 5 S e t du tRNA [5, 6]. I1 faut attendre plusieurs mois p o u r que le RNA 5 S p r o d u i t en excbs d u r a n t la premibre phase de l'oogenbse soit int6gr6 dans les ribosomes [9]. Le RNA 5 S reste done en attente p e n d a n t un laps de temps consid6rable. Durant cette p6riode, le RNA 5 S se trouve en partie clans le suc cellulaire et en p a r t i e dans des particules nucl6oprot6iques p r 6 s e n t a n t un coefficient de s6dimentation de 42 S [6, 10]. On peut se d e m a n d e r si le RNA 5 S subit des modifications p e n d a n t son s6jour prolong6 dans l'oocyte. P o u r r 6 p o n d r e h cette question, nous avons compar6 les propri6t6s du RNA 5 S stock6 dans l'oocyte avec celles du RNA 5 S nouvellement synth6tis6.
MATERIEL ET METHODES.
Marquage et purification du RNA 5 S, Le RNA 5 S d'oocyte est extrait h p a r t i r d'ovaires entiers de femelles immatures, m e s u r a n t de 2 h 3 cm. Ces ovaires ne c o n t i e n n e n t que des oocytes en petit accroissement et de nombreuses cellules somatiques, dont le contenu en RNA est n6gligeable p a r r a p p o r t h celui des oocytes. Pour les marquages de courte dur6e (2 heures h 3 jours), les ovaires sont incub6s dans du Ringer ou dans du milieu F 12 [11], a d d i t i o n n 6 d ' u r i d i n e [ ~ J (26 C i / m m o l ; 1,00 t, Ci/ml), de guanosine [atI] (3,5 C i / m m o l ; 10,0 I,Ci/ml) ou de a,2p (,1 mCi/ml). Pour les marquages de longue dur6e, on in]ecte le p r 6 c u r s e u r dans la cavit6 a b d o m i n a l e de la femelle. Le RNA est extrait p a r Ia m6thode au SDS-ph6nol froid, puts purifi6 par filtration sur colonne de Sephadex G-10J0 [5] ou par 6Iectrophorbse en gel de p o l y a c r y l a m i d e . Dans quelques cas, le contenu des oocytes a 6t6 centrifug6 en gradient de saccharose, de manibre h s6parer les particules 42 S du suc cellulaire [10]. Le RNA 5 S
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contenu dans ces deux c o m p a r t i m e n t s cellulaires est purifi6 comme d6crit ci-dessous.
Analyse du RNA 5 S. P o u r l'analyse de la structure p r i m a i r e du RNA 5 S, nous avons utilis6 la t e c h n i q u e de BrownIee el al. [12]. Les proc6d6s employ6s pour l'61ectrophor5se en gel de p o I y a c r y l a m i d e h 12,3 p. cent et la c h r o m a t o g r a p h i e sur colonne d ' a l b u m i n e in6thyl6e- Kieselguhr ont d6jh 6t6 d6crits [13]. Nous avons ~tudi6 la structure s e c o n d a i r e du RNA 5 S e n soumettant celui-ci h une h y d r o l y s e mod6r6e par la ribonucl6ase T 1 et en a n a l y s a n t les fragments de mol6cule obtenus p a r 2, 61ectrophor6.ses successives en gel de p o l y a c r y l a m i d e El4]. Le RNA est dissous dans 1 ml de NaC1 0,2 M, MgCIu 0,02 M, Tris 0,05 M pH 7,5, puts dig6r6 h 5°C au m o y e n de 5 unit6s de ribonucl6ase T 1 par mg de RNA. Le RNA est ensuite soumis h l'61ectrophorSse p e n d a n t 15 heures ~ 5°C dans un bloc de p o l y a c r y l a m i d e h 12,3 p. cent [15!. Le RNA est localis6 dans le gel soit p a r a u t o r a d i o g r a p h i e si le marquage a 6t6 fair au a:,p, soit par coloration d'une aliquote migrant en parallble, si Ie marquage a 6t6 fait au tritimn. On r6cup~re Ie RNA et procSde h une seconde 61ectrophorSse en pr6sence d'ur6e 7 M [14]. Les coupures i n t r o d u i l e s dans le RNA p a r la ribonucl6ase, qui n ' a p p a r a i s s a i e n t pas lors de la premibre 61ectrophor~se p a r c e que ta mol6cule conservait sa configuration native, sont r6v616es p a r la seconde 61ectrophorbse [14]. Les fragments de mol6cule sont mis en 6vidence par a u t o r a d i o g r a p h i e ou p a r coloration au m o y e n de p y r o n i n e [10].
D~termination de l'extr~mit~ 3' du RNA 5 S. Pour identifier le nucl6otide 3 ' - t e r m i n a l du R,NA 5 S non marqu6, on emploie la m6thode de Hatlen et ah [16]. Deux mg de RNA 5 S purifi6 sont hydrolys6s au m o y e n de KOH 0,3 N p e n d a n t 15 heures h 37°C, puts fix6s sur une colonne de Dowex 1 × 8 (forme formiate ; 3 x 1 cm). On passe sur la colonne 20 ml d'acide formique 5 raM, ce qui 61ue le nucl6oside 3'-terminal. Celuici est concentr6 p a r 6vaporation, p u t s identifi6 par c h r o m a t o g r a p h i e sur p a p i e r W h a t m a n n ° 1 dans Ie systbme eau-6thanoI-(NH4)2SO 4 propos8 p a r Lane [17]. I,'extr6mit6 3' du RNA 5 S stock6 dans l'oocyte est marqu6e p a r le proc(~d6 de R a j B h a n d a r y [183 et de De W a c h t e r et Fiers [19]. I1 s'agit de r e n d r e r a d i o a c t i f le nucleotide situ6 h l'extr6mit6 3' de !a mol6cule par o x y d a t i o n au m o y e n de periodate,
Recherches biochimiques sur l'oogenbse (7). puts p a r r d d u c t i o n au m o y e n de b o r o h y d r u r e [ZH]. Nous avons s u i v i h la lettre le proc6dd de De W a c h t e r et Fiers. La r d d u c t i o n finale est faite p a r du b o r o h y d r u r e de p o t a s s i u m (20 C i / m m o l ; CEA, Saclay). U n e no.uvelle p u r i f i c a t i o n du RNA est n dcessaire aprbs le m a r q u a g e . Nous a v o n s soumis le RNA s u c c e s s i v e m e n t h u n e filtration sur c o l o n n e de S e p h a d e x G-100 et h 2 61ectrophorbses en gel de p o l y a c r y l a m i d e , d ' a b o r d en l ' a b s e n c e , puts en p r d s e n c e d'urde 7 M. Le RNA est finalem e n t 61u6 du gel au m o y e n de NaC1 0,3 M. P o u r i d e n t i f i e r le ou les o l i g o n u e l 6 o t i d e s qui p o r t e n t le m a r q u a g e t e r m i n a l , on h y d r o l y s e le RNA au m o y e n de r i b o n u c l 6 a s e T 1 ou de ribonucl6ase A, puts on a n a l y s e l ' h y d r o l y s a t p a r chrom a t o g r a p h i e sur c o l o n n e de DEAE-cellulose ou p a r f i l t r a t i o n sur c o l o n n e de S e p h a d e x G-25. Le premier procdd6 s6pare Ies o l i g o n u e l d o t i d e s d ' a p r b s l e u r c h a r g e et l e u r c o m p o s i t i o n , t a n d i s que le s e c o n d les sdpare d ' a p r ~ s leur taille, l e u r c o m p o s i t i o n et l e u r c h a r g e [201. La DEAE-cellulose (Macherey, Nagel el Co) est calibrde et lavde avec du NaCt 4 M, p u t s tassde d a n s u n e c o l o n n e de c h r o m a t o g r a p h i e (20 × 1 era) et enfin dquilibrde d a n s du t a m p o n Tris-HC1 2~0 mM p H 7,5, urde 7 M [21]. L ' h y d r o l y s a t est a p p l i q u d sur la c o l o n n e d a n s le m 6 m e t a m p o n , p u t s dlud p a r un g r a d i e n t l i n d a i r e de NaC1 0 h 0,3 M d a n s l'urde 7 M. On mesure Ia densitd o p t i q u e h 26:0 n m de c h a q u e fraction r e c u e i l l i e h la sortie de la c o l o n n e et la r a d i o activitd d ' u n e aliquote aprbs y a v o i r ajoutd 10 vol u m e s d'Insta-Gel ( P a c k a r d ) . P o u r la f i l t r a t i o n sur S e p h a d e x G-25, on utilise u n e c o l o n n e de 125 × 1,5 era. L'61ution est assur6e p a r un flux c o n s t a n t (5 m l p a r h e u r e ) de t a m p o n acide ac6tique-acdtate de s o d i u m 10 mM p H 5,0, NaN 3 0,02 p. cent. Le m a r q u a g e p a r le b o r o h y d r u r e modifie le n u c l d o t i d e 3'-terminal. Aprbs u n e h y d r o l y s e comp l O e p a r le KOH, on o b t i e n t le ddrivd h y d r o x y m 6 t h y l e - d i d t h y l b n e - g l y c o l de la base t e r m i n a l e . Celni-ci est identifi6 p a r c h r o m a t o g r a p h i c s u r p a p i e r W h a t m a n n ° 1 [17], en p r d s e n c e de nucl6osides modifids p a r o x y d a t i o n au m o y e n de p e r i o date, puts p a r r d d u c t i o n au m o y e n de b o r o h y d r u r e [19].
RESU.LTATS.
Mise en ~vidence d'une RNA 5 S d'oocyte.
forme
2 b a n d e s p r i n c i p a l e s , c o r r e s p o n d a n t au RNA 5 S et au tRNA (fig. 1). P l u s i e u r s b a n d e s r n i n e u r e s s ' i n t e r c a l e n t e n t r e la ligne de d d p a r t et le RNA 5 S. L ' u n e d ' e n t r e elIes ( m a r q u d e 2 sur la fig. 1) pr6sente, apr6s h y d r o l y s e p a r la r i b o n u c l ~ a s e T1, le m~me <
FI6. I. - - Electrophor$se en gel de polyacrylamide 12,3 p. cent du RNA extrait d'ovaires entiers de femelles immatures, marquds au a2p pendant 3 jours. La figure reprdsente le clich~ obtenu en appliquant un film de radiographic eontre le gel pendant 5 heures. Environ 100 /xg de RNA ont ~td soumis /t I'dlectrophor~se h 5°C pendant 20 heures sous i0 volts/cm.
<
Q u a n d on s o u m e t h l ' d l e c t r o p h o r 6 s e en gel de p o l y a c r y l a m i d e h 12,3 p. cent le RNA d ' o v a i r e s m a r q u d s au z2p p e n d a n t 2 h 3 jours, on o b t i e n t
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Tout ceei m o n t r e que la b a n d e 2 (fig. 1) corresp o n d /t une f o r m e <
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p o u r d o n n e r n a i s s a n e e h la f o r m e de la m o l 6 c u l e qui c o n t i e n t 129 n u c l 6 o t i d e s . D a n s les c o n d i t i o n s h a b i t u e l l e s de m a r q u a g e , la f o r m e ¢ l o n g u e a r e p r 6 s e n t e h p e u prbs 1 p. c e n t du R,NA 5 S total. N o u s n ' a v o n s p a s jusqu'~ p r 6 s e n t t r o u v 6 le m o y e n
c o n t i e n t 120 h 122 n u c l 6 o t i d e s ( b a n d e 3 de la fig. 1). Nous s a v o n s d6jh que le RNA 5 S n 6 o f o r m 6 est t r i p h o s p h o r y l 6 h l ' e x t r 6 m i t 6 5' et q u ' i l p e r d p e u h p e u ses g r o u p e s p h o s p h a t e s p e n d a n t s o n s 6 j o u r p r o l o n g 6 d a n s l ' o o c y t e [26]. Le RNA 5 S
TABLEAU I.
Analyse des taches qui composenl le ~ fingerprint ~> de Ia figure 2, comparde avec des analyses similaires, portant sur le RNA 5 S d'oocyte et sar le RNA 5 S somatique. Tache N°
Composition
1 1' 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 18' 19 20 20' 21 Xt X~ X3 Z
G pG CG AG UG CAG AAG UCG UAG AUG C CCG ACC G AAAG CCUG UC UG UUAG CCAAG CCUACG AUCUCG AUC UC AG UA C UUG AAUAC C AG AUACAG C CA(: AC CAC C C U G CpUpU CpUpUpU CpUpUpUpU (5U,3C,3A) G CCG UUG
Proportion Bande 2 de la fig. I
I/NA 5 S d'oocyte (partieules 42 S)
RNA 5 S somatique
11,16
9,88 0,04
12,06 0,24
1,45
1,02 i ,i0 t ,68 0,23 0,76 1,23 1,02
0,18 1,04 1,95 0,95
2,01 2,59
0,69
0,10 0,65
0,14 0,46
0,87 2,07 1,21 0,97
0,98 2,35 0,88 1,08
0,10
0,10
0,66 1,59
0,86 1,72
0,84 1,94 1,00 1,01 0,99 0,88 0,79 1,95 1,08 0,91 0,82 0,74 1,98
0,93 0,39
O, 78 0,17
0,92
0,64
0,85
0,97
0,83
0,94
0,38
0,60 0,90
0,97 1,41 0,79 0,97
1,03
0,52
0,64 0,70 0,05
0,14 0,86 0,36 0,45
0,18 0,10
La proportion des oligonuel6otides est d6termin6e en divisant le nombre de coups/ran pr6sents darts chaque oligonucl6otide par la radioactivit6 sp6eifique d'un nucl6otide. Les valeurs prdsent~es dans les deux derni~res colonnes sont les moyennes de 2 et de 5 mesures. Les taehes 18', 20' et Xs n'existent que darts les <
oocytes une accumulation d u RNA 5 S, c o m m e il a chez les b a c t 6 r i e s p o u r les S [22, 23, 24, 25].
Propridtds du R N A 5 S nouvelIement synthHisd. T o u t e s les e x p 6 r i e n c e s qui v o n t 6tre d 6 c r i t e s c o n c e r n e n t la f o r m e (< c o u r t e >> d u RNA 5 S, qui
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m a r q u 6 p e n d a n t 4 h e u r e s au m o y e n de g u a n o s i n e [!artiest u n p e u m o i n s r e t a r d 6 p a r le S e p h a d e x G-10@ que le RNA 5 S total ( e x p 6 r i e n c e n o n r e p r 6 sent6e) et il m i g r e u n p e u plus l e n t e m e n t en gel de p o l y a c r y l a m i d e h 12,3 p. c e n t (fig. 3). Cette diff 6 r e n c e de m o b i l i t 6 est u n e p r o p r i 6 t 6 li6e h ]a p o r t i o n 3 ' - t e r m i n a l e d u RNA 5 S, c o m m e o n p e u t s'en r e n d r e c o m p t e apr~s u n e h y d r o l y s e p a r t i e l l e
R e c h e r c h e s b i o c h i m i q u e s s u r l'oogendse (7). du RNA 5 S p a r la r i b o n u c I 6 a s t Tt, suivie d ' u n e s 6 p a r a t i o n des f r a g m e n t s o b t e n u s p a r 2 61ectrop h o r 6 s e s s u c c e s s i v e s en gel de p o l y a c r y l a m i d e (fig. 10). Le RNA 5 S n o u v e l l e m e n t synth6tis6 est 61u6 de l ' a l b u m i n e m 6 t h y l 6 e apr6s le R:NA 5 S total (fig. 4). D a n s les p a r t i c u l e s 42 S, le d6calage e n t r e le profil de d e n s i t 6 o p t i q u e et It profil de r a d i o a c t i v i t 6 ne d i s p a r a l t que tr6s l e n t e m e n t : il t'aut a t t e n d r e 1 m o i s p o u r qu'il s ' e s t o m p e tout ~ fair (fig. 4). Le
1141
RNA p a r la c h a l e u r , ni l ' e n l 6 v e m e n t des g r o u p e s p h o s p h a t e s 5 ' - t e r m i n a u x p a r Ia p h o s p h a t a s e alcal i n e ne s u p p r i m e n t le d6calage. La d i f f 6 r e n c e de c o m p o r t e m e n t c h r o m a t o g r a p h i q u e e n t r e le RNA 5 S n 6 o f o r m 6 et le R NA 5 S total ne s ' o b s e r v e q u e clans l ' o o c y t e : le RNA 5 S de rate m a r q u 6 p e n d a n t 5 h e u r e s ~ 2 jours est 61u6 de l ' a l b u m i n e m6t h y l 6 e en m S m e t e m p s que Ie RNA 5 S de foie (fig. 6). Ces p r e m i e r s r6sultats p e u v e n t s ' i n t e r p r 6 t e r de la m a n i 6 r e suivante. Le RNA 5 S n 6 o f o r m ~ s e r a i t 16g6rement plus l o n g h l ' e x t r 6 m i t 6 3' que le RNA 5 S stock6 d a n s l ' o o c y t e , c o m m e l ' i n d i q u e n t sa m o b i l i t $ plus faible en gel de p o l y a c r y ] a m i d e (fig. 3 et 10) et son 61ution p l u s r a p i d e du Sephad e x G-100. Chez Escherichia colt, on sait que l ' a l b u m i n e m 6 t h y l 6 e r e t i e n t m o i n s f e r m e m e n t le RNA 5 S total q u e le RNA 5 S n o u v e l l e m e n t synth6tis6, qui p o s s 6 d e 1 h 3 n u c l 6 o t i d e s en plus [23]. Ces n u c l ~ o l i d e s se t r o u v e n t h l ' e x t r 6 m i t 6 d ' u n e ¢ tige >) bifilaire p u i s q u e l ' e x t r 6 m i t 6 5' du RNA 5 S est a p p a r i 6 e ~ l'extr6mit6 3' [27]. La p r 6 s e n c e d ' u n bout u n i f i l a i r e p r o l o n g e a n t u n e <(tige)) bifilaire e n t r a i n e d o n c u n e plus forte r 6 t e n l i o n du RNA 5 S p a r l ' a l b u m i n e m6thyl6e. Nous p e n s o n s que le RNA 5 S de x 6 n o p e s t c o m p o r t e de la m ~ m e m a n i 6 r e que celui d'Escherichia colt. P o u r p r o u v e r qu'il e n e s t b i e n ainsi, n o u s d e v o n s : 1) m o n t r e r q u e l ' e x t r 6 m i t 6 5' du RNA 5 S est a p p a r i 6 e h l ' e x t r 6 m i t 6 3' ; 2) m o n t r e r que le r a c c o u r c i s s e m e n t de la m o l 6 c u l e h l ' e x t r 6 m i t 6 3' s u p p r i m e le d6calage e n t r e les profils de d e n s i t 6 o p t i q u e et de r a d i o a c t i v i t 6 observ6 sur les fig. 4 et 5 ; 3) i d e n -
[ Fro. 2. - - <( Fingerprint >> fourni par le RNA contenu dans la bande 2 de la figure 1. Le RNA a 6t6 5lud du gel au moyen de NaC1 0,3 M, pr6cipit6 h l'~thanol et hydrolys6 par la ribonucl6ase T, (250 unit6s/mg de RNA). Les oligonuel6otides obtenus ont 6t6 s6par6s par 61ectrophor6se en 2 dimer~sions suivant la technique de Brownlee et aI [12]. La composition des principales taches est indiqu6e dans le tableau I. Comparer avec la figure 1 A et B de la rdf. [2fi].
l//
I0
d6calage d i s p a r a i t b e a u c o u p p l u s vite d a n s le suc c e l l u l a i r e : il est c o m p l 6 t e m e n t s u p p r i m 6 au b o u t de 12 j o u r s ( e x p 6 r i e n c e n o n r e p r 6 s e n t 6 e ) . L'6cart e n t r e les profils de d e n s i t 6 o p t i q u e et de r a d i o a c t i vit6 est m o i n s p r o n o n c 6 p o u r le RNA 5 S m a r q u 6 p a r la g u a n o s i n e [ZHI que p o u r le RNA 5 S m a r qu6 p a r le 32p (fig. 5) ou p a r l ' u r i d i n e EZH] (exp6r i e n c e n o n r e p r 6 s e n t 6 e ) . Ni la d 6 n a t u r a t i o n du
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 9.
20
50
40
50
60
tRNA
.500 m
It
.,oo
it/i" 70
80
90
I00
I10
DJSTANCE PARCOURUE (ram)
FIG. 3. - - Electrophor~se en gel de polyacrylamide ~. 12,3 p. cent du RNA 5 S extrait d'ovaires critters de femelles immatures, marqu6s par l a guanosine [aH] pendant 4 heures. On a m61ang6 25 ug de RNA 5 S purifi6 avee 40 t~xg de tRNA et soumis le m@lange l'61ectrophor6se pendant 23 heures h 5°C. Le bloc d'acrylamide a 6t6 color6 h la pyronine, pass6 au densitom6tre, puts d6eoup6 en tranches de I mm d'6paisseur pour la mesure de la radioactivit6 [13].
1142
H, Denis et M. Wegnez. £i 20 hcures 0,3l A 4 hcur¢s 3000
0,
J
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1
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-300
NoCt • 750 M ).5 1,0 -200
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0,2. • 0.5
0,1 ¸
-
250
!00 O,H
f --==ec,_e~e-,1 _~_:ccc_~,e,_~ 20 lO
,
50 40 10 20 30 40 TUBE N ° TUBE N ° FIG. 4 . Co m p o r t e m e n t c h r o m a t o g r a p h i q u e du R N A 5 S e x t r a i t des p a r t i c u l e s 42 S d ' o o c y t e s en p e t i t a c c r o i s s e m e n t , m a r q u i s p e n d a n t des dur6es c r o i s s a n t e s . P o u r les m a r q u a g e s de 4 et 20 h e u r e s , les o v a i r e s d i s s 6 q u 6 s o u t ~t6 i n c u b 6 s in vitro en presence d ' u r i d i n e [3HI. Le m a r q u a g e de 12 j o u r s et de 1 m o i s a 6t6 f a i t in vivo par i n j e c t i o n de 100 i~Ci d ' u r i d i n e r3 , HI darts u n e f e m e l i e i m m a t u r e . Les o v a i r e s s o n t b r o y 6 s d a n s 1 m l de t a m p o n Tris-HCl 50 mM, KC] 25 mM, MgCl~ 5 mM pH 7,8, p u i s c e n t r i f u g S s & 10.000 g p e n d a n t 70 m i n u t e s . Le s u r n a g e a n t est repris et c e n t r i f u g 6 h 35.000 t o u r s / m n d a n s u n g r a d i e n t de s a c c h a r o s e 15-30 p. cent. Le R N A 5 S c o n t e n u d a n s le pic 42 S est extrait, p,urifi6 sur c o l o n n e de S e p h a d e x G-100 et c h r o m a t o g r a p h i 6 sur c o l o n n e d ' a l b u m i n e m ~ t h y l d e - K i e s e l g u h r . F r a c t i o n s de 1 ml. La r a d i o a c t i v i t 6 est m e s u r 6 e apr$s p r 6 c i p i t a t i o n & l'acide t r i c h l o r a c 6 t i q u e et filtration sur Millipore.
0.08. ~
i
6oo~[8ooo ~
0,06-
450C
0,0 4
,I0
I 10
4000
_
30 4'0 50 60 TUBE N ° FI6. 5. - - C o m p o r t e m e n t c h r o m a t o g r a p h i q u e du R N A 5 S d ' o v a i r e s de f e m e l l e s i m m a t u r e s , m a r q u 6 s p e n d a n t 15 h e u r e s au m o y e n de a2p et de g u a n o s i n e [3H]. Le RNA 5 S est e x t r a i t des o v a i r c s entiers, purifi6 s u r c o l o n n e de S e p h a d e x G-100 et c h r o m a t o g r a p h i 6 sur e o l o n n e d ' a l b u m i n e m d t h y l 6 e . F r a c t i o n s de 1 ml. BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 9.
20
I
6000 [ I
R e c h e r c h e s b i o c h i m i q u e s s u r l'oogendse (7). tifier l ' e x t r 6 m i t 6 3' d u RNA 5 S total et d u RNA 5 S n 6 o f o r m 6 . Nous allons r e p r e n d r e ces 3 p o i n t s s6parament.
Structure secondaire du RNA 5 S.
1143
d o n e a p p a r i 6 e soit a v e c la r 6 g i o n m 6 d i a n e (nucl6otides 54 h 87), soit a v e c la r 6 g i o n 3 ' - t e r m i n a l e ( n u c l 6 o t i d e s 90 h 120), soit a v e c les 2 ~ la fois. L ' e x a m e n de la s t r u c t u r e p r i m a i r e du RNA 5 S [7, 8] m o n t r e que l ' e x t r 6 m i t 6 3' est c o m p l 6 m e n -
Apr6s u n e h y d r o l y s e tr6s m o d 6 r 6 e p a r la r i b o n u c I 6 a s e Tt, Ie R,NA 5 S se s 6 p a r e en 2 b a n d e s q u a n d on le s o u m e t h l ' 6 1 e c t r o p h o r 6 s e en gel de p o l y a c r y l a m i d e (fig. 7 A). La b a n d e la p l u s l e n t e (a) c o r r e s p o n d aux m o l 6 c u l e s i n t a c t e s ou p r 6 s e n t a n t des c o u p u r e s c a c h 6 e s . La b a n d e la p l u s rap i d e (b) est f o r m 6 e p a r des m o l 6 c u l e s r e c o u p 6 e s p a r la r i b o n u c l 6 a s e . U n e s e c o n d e 61ectrophor/~se en p r 6 s e n c e d ' u r 6 e (fig. 7 B) d i v i s e la b a n d e a en 7 f r a g m e n t s d o n t la c o m p o s i t i o n est i n d i q u 6 e d a n s le t a b l e a u II. Q u a n t h la b a n d e b, elle se s 6 p a r e en 4 t r o n c o n s c o m p r e n a n t les n u c l 6 o t i d e s 54 h 120, 54 h 87, 90 h 120' et I h 25 ( t a b l e a u II). La b a n d e b c o n t e n a i t d o n e 3 f r a g m e n t s assez c o u r t s (25 34 n u c l 6 o t i d e s ) qui ont m i g r 6 p e n d a n t la p r e m i 6 r e 6 1 e c t r o p h o r 6 s e c o m m e s'ils c o m p o r t a i e n t 100 nncl6otides (fig. 7 A). C'est d o n e q u e ces fragunents
0,150.
-20000I o
6
•
o.loo,
NoCI
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5000 m. o3 _. z-4
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0.0505000
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20
50 TUBE
40
50
N°
Fro. 6. - - Comportement chromatographique du RNA 5 S de foies et de rates d'individus immatures marqu6s pendant 2 jours au m.oyen de guanosine [3HI. Le RNA 5 S provient de 5 rates et de 5 foies, soumi,; ensemble h 1'extraction. Le profil de densit6 optique est fourni par le RNA 5 S de foie, tandis que le profil de radioactivit6 est fourni par le RNA 5 S de rate. Fractions de 0,8 ml.
a d h 6 r a i e n t les u n s aux autres. E n t e n a n t c o m p t e de l ' a b o n d a n c e r e l a t i v e des f r a g m e n t s qui c o m p o sent la b a n d e b ( t a b l e a u I,I), on a r r i v e h la c o n c l u sion que cette b a n d e (.fig. 7 A) c o n t e n a i t 2 t y p e s de. c o m b i n a i s o n s en q u a n t i t 6 s in6gales : le fragm e n t 1-25 fix6 au f r a g m e n t 54-120 (--4-_ 20 p. cent) et les f r a g m e n t s 1-25, 5.4-87 et 89-12.0 r e t e n u s e n s e m b l e ( ± 80 p. c e n t ) . D a n s le RNA 5 S, l'extr6rnit6 5' de Ia m o l 6 c u l e (nuc16otides 1 h 25) est
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 9.
Fro. 7. - - Electrophor6se en gel de polyacrvlamide h 12,3 p. cent dn RNA 5 S d'ovaires soumis h urm hydrolyse mod6r6e par la ribonuel6ase T1 (A). Environ 100 :~g de RNA 5 S marqu6 au a2p ont 6t6 traitds h 5°C pendant 5 minutes par 0,5 unit6 de ribonucl6ase Tj, puts soumis h l'61ectrophori~se pendant 5 heures sous 20 volts/em. Le RNA contenu dans les bandes a et b a 6t6 repris et soumis h une seconde 61eetrophorbse en pr6sence d'ur6e 7 M (B). Les photographies pr6sent6es sont les clich6s obtenus en appliquant un film de radiographie contre les blocs de polyacrylamide.
t a i r e de l ' e x t r 6 m i t 6 5' (fig. 8). A u c u n e a u t r e zone de c o m p l 6 m e n t a r i t 6 n ' e x i s t e e n t r e la r 6 g i o n 1-25 d ' u n e p a r t et les r 6 g i o n s 54-87 et 90-120, d ' a u t r e p a r t . N o u s en d 6 d u i s o n s q u e les 2 e x t r 6 m i t 6 s de la m o l 6 c u l e f o r m e n t u n e • tige • bifilaire c o m m e le m o n t r e la fig. 8.
Influence de l'ablation des nucldotides Y-terminaux sur le c o m p o r t e m e n t chromatographique du RNA 5 S. U n t r a i t e m e n t tr6s m o d 6 r 6 d u RNA 5 S m a r q u 6 au a2p p a r la p h o s p h o d i e s t 6 r a s e de v e n i n de serp e n t , s u i v i e d ' u n e 6 1 e c t r o p h o r b s e en gel de p o l y a c r y l a m i d e h 12,3 p. c e n t fair a p p a r a i t r e 2 b a n d e s
H. D e n i s et M. W e g n e z .
1144
c o n s t a t e que le d 6 c a l a g e e n t r e le profil de r a d i o activit6 et le p r o ill de densit6 o p t i q u e a d i s p a r u , alors qu'il subsiste p o u r les m o l 6 c u l e s Iaiss6es
d ' i n t e n s i t 6 in6gale. La p l u s i m p o r t a n t e a la m 6 m e m o b i l i t 6 que le RNA 5 S intact. L ' a u t r e est u n p e u p l u s r a p i d e . Elle c o r r e s p o n d & u n e f o r m e de la
TABLEAU II.
Composition des fragments obtenus apr~s une hfldrolyse partielle dn R N A 5 S marqud a~ szP. Bande (fig. 7)
Composition (no des nucl6otides)
Proportion
1-120 38-120 1-75 -] 49-120J 38-89 au moins deux fragments 1-37 90-120
0,21 0,17
54-120 54-87 90-120
0,19 0,86 0,86 1 ,nO
8 9 10 11
0,55 0,29 0,29 0,70 1,00
• La composition des bandes a $t6 dfiterminSe par hydrolyse au moyen de la ribonueldase T~ et s6paration des oligonucl&otides par 61ectrophor6se en 2 dimensions. La proportion des diff4rents fragments est mesur~e en divisant la radioactivit5 de chaque fragment par le hombre de nucldotides qu'il eomp.orte. Pour les bandes 1 h 7, la radioactivit6 du fragment 90-120 est prise comme r6fdrence. Pour les bandes 8 h 11, la radioactivit6 du fragment 1~25 est prise comme r6f~rence. La bande 5 fournit ~ l'hydro.lyse tous les oligonucI6otides correspondant aux r ~ s i d u s 1-89. Elle contient donc au moins 2 fragments &environ 45 nuci6otides dont les limites exactes n'ont pas pu ~tre d~termin6es.
mol6cule raccoureie d'environ 3 nucl6otides h l ' e x t r 6 m i t 6 3'. O n o b s e r v e aussi u n e t r a i n 6 e de m a t 6 r i e l de m o b i l i t 6 p l u s 61ev6e, et d o n c p l u s f o r t e m e n t e n t a m 6 p a r l ' e n z y m e . La b a n d e r a p i d e
i n t a e t e s p a r la p h o s p h o d i e s t 6 r a s e (fig. 9). On rem a r q u e r a e e p e n d a n t que la q u a n t i t 6 de RNA r a c e o u r c i qui a p u 6tre e x t r a i t d u gel est tr6s faible (fig. 9).
IO r G-.CI I
5
120
.
C-U - A-C- G -G -C / [ } [ I_/ I
,o(U-U)-U-u-c-G-G-A-u-G 115
.--u-~
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C-A-
A-C
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C-C-
C-U-G-A-
23 A-A-G
C I /
IIO" U- G
20
15
C - A
G\ I05
U-A-A-G-G-G I00
- U-C-
C
95
Fro. 8. - - Mode d'appariement probable de l'extr~mit~ 5" et de l'extr~mit5 3' du RNA 5 S de x~nope. La s~quence nucl~otidique a ~t~ ~tablie p a r Wegnez et al [7] et Ford et Southern [8]. Cette s~quence est eelle du RNA 5 S nouveltement form~.
e n g e n d r 6 e p a r le t r a i t e m e n t f la p h o s p h o d i e s t ~ r a s e a p e r d u le b o u t g n i f i I a i r e qui faisait saillie fi l ' e x t r ~ m i t 6 3 '~ de la m o l e c u l e (fig. 8). C'est la <
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 9.
Extr~mit~ 3" du R N A 5 S rnarqud au s,p. T r o i s o l i g o n u c h ~ o t i d e s d i f f 6 r e n t s (X l, X 2 et Xs) t e r m i n e n t le I~NA 5, S m a r q u 6 au ~2p (tabIeau I). Le t a b l e a u I I I d o n n e la c o m p o s i t i o n de ces oligon u c l 6 o t i d e s . On voit que la r a d i o a c t i v i t 6 p r 6 s e n t e d a n s l ' a c i d e u r i d y l i q u e est p l u s ~]ev6e q u ' o n n e d e v r a i t s'y a t t e n d r e . C,eci ne p e u t s ' e x p l i q u e r que
R e c h e r c h e s b i o c h i m i q u e s s u r l'oogen@se (7). par u n e a d d i t i o n & l ' e x t r t m i t 6 3' d ' a c i d e u r i d y l i q u e pr61ev6 d i r e c t e m e n t s u r le <
>. Cette a d d i t i o n c o n c e r n e v r a i s e m b l a b l e m e n t les m o l t cules stock@s darts l ' o o c y t e aussi b i e n que les moltcules nouvellernent synthttis6es. L'addition p o u r r a i t 6tre p r 6 c t d t e de r a b l a t i o n du n u c l t o t i d e
t A MOII~CULES iNTACIES
]
1145
au m o y e n d ' u r i d i n e [ZH] ou de 32p que d a n s le RNA 5 S m a r q u 6 au m o y e n de g u a n o s i n e [3H]. Ceci e x p l i q u e sans d o u t e p o u r q u o i le RNA 5 S m a r q u 6 & l ' u r i d i n e ou au 32p est 61u6 de l'album i n e m t t h y l 6 e plus t a r d que le RNA 5 S m a r q u 6 h ta g u a n o s i n e (fig. 5). E n effet, l ' a l b u m i n e m 6 t h y l t e r e t i e n t d a v a n t a g e les m o l t c u l e s de RNA 5 S plus l o n g u e s [23]. Or le RNA 5 S m a r q u 6 h l ' u r i d i n e ou an 32.13 est a p p a r e m m e n t plus l o n g que le RNA 5 S m a r q u 6 h la g u a n o s i n e , p u i s q u e l ' a d d i t i o n d ' u r i d i n e h l ' e x t r t m i t 6 3' r e n d r a d i o a c t i v e s un c e r t a i n n o m b r e de m o l t c u l e s stock6es clans l'oocyte. Ces m ~ m e s m o l t c u l e s r e s t e n t ¢ f r o i d e s >> q u a n d le m a r q u a g e est fait p a r la g u a n o s i n e .
Extr~mit~ 3' dn RNA 5 S stock#, darts l'oocyte. 0.0
5 l ~ I0
~~/~0"5 5'0
20
4'o
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~.
&
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MOL£CULES RECOUPEES
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1.0 1000 "0,01' .5
lb
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3o TUBE
4'o
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.so
N°
Fro. 9. - - Influence d'un traitement mud@r6 par la phosphodiesttrase de venin de serpent sur le cornportement chromatographique du RNA 5 S nouvellement synthttist. Environ 200 tlxg de RNA 5 S marqu6 au 82p ont dt6 traitts pendant 10 minutes h 4°C par 20 ug de phosphodiestdrase, puis soumis ~ l'~lectrophorbse en get de polyacrylamide h 12,3 p. cent. Deux bandes d'importance intgale apparaissent aprbs autoradiographie du gel. La bande principalc (la plus tente) a la rn~mr mobilit6 6lectrophorttique que le RNA 5S intact. L'autre bande est un peu plus rapide. Le RNA est dlu@ de la bandc principale (A) et de la bande suppltmentaire (B) et chromatographi6 sur eolonne d'albumine m~thylte, comme d~crit sur la figure 4.
3 ' - t e r m i n a l . On a u r a i t alors affaire h u n r e n o u v e l l e m e n t de l ' e x t r t m i t 6 3', a n a l o g u e ~ celui que subit le tRNA. I1 r t s u l t e de ce qui p r t c t d e que l'activit6 s p t ci,fique de r e x t r t m i t 6 3' p a r r a p p o r t au reste de la m o l t c u l e est plus forte d a n s le RNA 5 S m a r q u 6
BIOCHIMIE, 1973,
55, n ° 9.
Le n u c l t o t i d e 3 ' - t e r m i n a l du RNA 5 S stock6 d a n s l ' o o c y t e est l ' a c i d e u r i d y l i q u e : apr~s h y d r o lyse c o m p l t t e au m o y e n de KOH et i s o l e m e n t du n u c l t o s i d e t e r m i n a l p a r c h r o m a t o g r a p h i c sur D o w e x 1 X 8, on ne r e c u e i l l e que de l ' u r i d i n e . D ' a u t r e s n u c l t o s i d e s p o u r r a i e n t ~tre p r t s e n t s en faible p r o p o r t i o n , mais ils n ' o n t pas 6t6 d t t e c t t s . Ceci ne nous i n d i q u e c e p e n d a n t pas le n o m b r e de U qui s u i v e n t le r t s i d u n ° 118 (fig. 8). Nous a v o n s d o n c m a r q u 6 au m o y e n de b o r o h y d r u r e [~H] le n u c l ~ o t i d e 3 ' - t e r m i n a l et d t t e r m i n 6 c o m b i e n de r t s i d u s s t p a r e n t celui-ci du n u c l 6 o t i d e n ° 118. A u p a r a v a n t , il faut d t m o n t r e r que le b o r o h y d r u r e m a r q u e le n u c l t o t i d e 3 ' - t e r m i n a l h l'exclusion de tout autre. Si l ' o n h y d r o l y s e c o m p l b t e merit le RNA 5 S m a r q u 6 au b o r o h y d r u r e et s t p a r e les n u c l ~ o t i d e s d u n u c l t o s i d e 3 ' - t e r m i n a l , o n consrate que ce d e r n i e r seul est r a d i o a c t i f . U n e h y d r o lyse p a r t i e l l e p a r la r i b o n u c l t a s e T1, suivie de 2 61ectrophor~ses en gel de p o l y a c r y l a m i d e p e r m e t de d 6 c o u p e r le RNA 5 S e n p l u s i e u r s fragm e n t s (fig. 7 B). Nous savons dtj& que le f r a g m e n t le plus r a p i d e (7) c o m p o r t e les 31 d e r n i e r s nucl~ot i d e s de la m o l e c u l e , t a n d i s que le f r a g m e n t 6 comp r e n d les 37 p r e m i e r s n u c l t o t i d e s (fig. 7 B et t a b l e a u II). A p r t s m a r q u a g e au b o r o h y d r u r e , le f r a g m e n t 7 est r a d i o a c t i f , t a n d i s que Ie f r a g m e n t 6 ne l'est pas (fig. 10). Nous s o m m e s d o n c stirs que le m a r q u a g e c o n c e r n e le n u c l t o t i d e 3 ' - t e r m i n a l et lui seul. La c h r o m a t o g r a p h i e sur c o l o n n e de DEAE-cellulose s t p a r e d ' a p r t s l e u r c h a r g e les o l i g o n u c l t o tides r t s u l t a n t d ' u n e d i g e s t i o n p a r la r i b o n u c l t a s e T 1 (fig. 11). T r o i s o l i g o n u c l ~ o t i d e s 3'-term i n a u x s o n t m i s en 6 v i d e n c e d a n s le RNA 5 S. Le p r e m i e r est 61u6 u n p e u apr~s le p i c de G ; il cont i e n t 90 h 9,5 p. c e n t de la r a d i o a c t i v i t 6 r e t e n u e p a r la DEAE-cellulose. Les 2 autres p i c s s o n t 61uts a v a n t et a p r t s le p i c des d i n u c l t o t i d e s (fig. 11).
1146
H. Denis et M. Wegnez. TABLEAU I I I .
Oligonucldotides 3'-terminaux obtenus aprbs hydroIyse par Ia ribonucl~ase T~ du RNA 5 S marqu~ au s2p. Proportion Taehe
Sdquence
Up Cp
XI
X~
CpUpU CpUpUpU CpUpUpUpU
{i.80 Ii , I 9 0,05
Attendue
Observde
0,81) o, 38 O. 15
1,01 1,06 0,35
1 ,(~4 Les o l i g o n u c l d o t i d e s t e r m i n a u x [7, 2~] o n t 6t6 h y d r o l y s d s p a r la r i b o n u c l 6 a s e T._,. P o u r le c a l c u l des p r o p o r t i o n s , o n p r e n d c o m m e b a s e l ' a c t i v i t 6 spdcifique d ' u n n u c l 6 o t i d e d u RNA 5 S. Les v a l e u r s p r d s e n t 6 e s s o n t les m o y e n n e s de 4 h 9 mesures.
3H
©
32p
-55 00(
1-120 -50 OOC c.w I
r-J 13
@ ~J8120
C? c,el. -20 ooi
45000
5~,-I2'0
z
5000
90~120 '10000 '2000
4942~
• .5000 IlO00
~'o 2'o ~'o
;'0 ,oo DISTANCE PARCOURUE (mm)
,,o
Fro. 10. - - E l e c t r o p h o r 6 s e e n gel de p o l y a c r y l a m i d e h 12,3 p. c e n t d u RNA 5 S m a r q u 6 a u m o y e n de b o r o h y d r u r e [SH], p u i s s o u m i s & u n e h y d r o l y s e m o d d r d e p a r l a r i b o n u c l d a s e T1. On a t r a i t 6 p e n d a n t 10 m i n u t e s h 5°C 200 ug de RNA 5 S p a r 0,5 u n i t 6 de r i b o n u e l d a s e T1. Le RNA a 6t6 s o u m i s & u n e p r e m i 6 r e 61ectrop h o r 6 s e p e n d a n t 20 h e n r e s sous 10 v o ! t s / e m . Le m a t e r i e l q u i m i g r e h la m ~ m e v i t e s s e q u e le RNA 5 S n o n dig6rd a dtd r e p r i s et s o u m i s h u n e seconde 61ectrop h o r b s e e n p r e s e n c e d ' u r ~ e 7 M. Le bloc de p o l y a c r y l a m i d e a dr6 color6 h ta p y r o n i n e , pass6 a u d e n s i t o m 6 t r e , p u i s ddcoup6 en t r a n c h e s de I m m d ' @ a i s s e u r p o u r la m e s u r e de la r a d i o a c t i v i t d . Les n u m 6 r o s plac6s a u - d e s s u s de cert a i n s pics c o r r e s p o n d e n t A ceux des b a n d e s de la fig. 7 B. L a figure m o n t r e a u s s i le profil de r a d i o a c t i v i t 6 o b t e n u d a n s u n e a u t r e e x p 6 r i e n c e off le RNA 5 S m a r q u 6 a u 32p p e n d a n t 3 j o u r s a 6t6 s o u m i s au m 6 m e t r a i t e m e n t que le RNA 5 S m a r q u 6 a u b o r o h y d r u r e [all].
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 9,
Recherches biochimiques sur l'oogen~se (7). Si la m6me exp6rience est faite apr6s une digestion par la ribonucl6ase A, presque toute la radioactivit6 sort de la colonne avant le pic de C + U (exp6rience non repr6sent6e). Les 3 oligonucl6otides t e r m i n a u x s6par6s p a r la DEAE-cellulosc (fig. 11) diff6rent p a r leur longueur. Ils corres-
1147
pics 1, 2, 3, 5 et 7 (fig. 13) en f o n c t i o n de leur poids mol6culaire pr6sum6, on constate que les points s'alignent p a r f a i t e m e n t , sauf celui qui corr e s p o n d au pic 7 (fig. 13). Ceci ne peut se produire que si les oligonucl6otides a p p a r t i e n n e n t h une s6rie homologue (purique ou p y r i m i d i q u e ;
©
-I 20 000
0.5
-100 000
CCCG ACCG CCUC~ UCUG UUACz
E ,- 0,4-
[
80000 O Frl.
AUG (~
CAG
UCG A5
f-Ct 0.3-
Oo,7.2- ~oo, ....
~
10
....
20
30
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CCUACG AuCUCG
60 000 TM
/ .......~ -~
40
....
~.r..~._;,
50
4020~ ooo
.~.~l
60
70
80
.90
100
II0
120
130
TUBE N °
FIG. 11. - - C h r o m a t o g r a p h i e sur c o l o n n e de D E A E - e e l l u l o s e (20 × 1 em) d ' u n h y d r o l y s a t de RNA 5 S m a r q u 6 a u m o y e n de b o r o h y d r u r e [aH]. On a m d l a n g 4 3 m g de RNA 5 S n o n m a r q u 6 et I00 .~g de RNA 5 S m a r q u 6 et t r a i t 6 le t o u t h 37°C p e n d a n t 30 m i n u t e s p a r 750 u n i t 6 s de r i b o n u c l 6 a s e Tx. L ' h y d r o l y s a t a 6t5 fix6 s u r la c o l o n n e en pr6sence d ' u r 6 e 7 M. L'61ution est f a i t e p a r u n grad i e n t l i n d a l r e de NaG1 0 h 0,3 M d a n s l ' u r d e 7M. F r a c t i o n s de 5 ml. EnviroJt 15 p. c e n t de la r a d i o a e t i v i t d a p p l i q u 4 e s u r l a c o l o n n e n ' a pas 6t6 r e t e n u e p a r la I ) E A E - c e l l u l o s e . L ' a c i d e g u a n y l i q u e 2', 3' c y c l i q u e n ' a pas 6t6 r e t e n u n o n plus.
p o n d e n t p r o b a b l e m e n t h CpUpU, CpUpUpU et CpUpUpUpU (tableau III). Mais la composition de ces oligonucl6otides ne peut pas 6tre d6duite de leur p o i n t d'6lution de la DEAE-cellulose, car ils sont d6pourvus de p h o s p h a t e t e r m i n a l et se cornp o r t e n t de ce fait de manibre anormale p a r rapp o r t aux autres oligonucl6otides. Si on traite par la ribonucl6ase T 1 le R NA 5 S marqu6 au b o r o h y d r u r e et passe l ' h y d r o l y s a t sur colonne de S e p h a d e x G-25, on obtient 5 pics de radioactivit6 et quelquefois un sixi6me, intercal6 entre les pics 3 et 5 (fig. 1,2). Le pic 3 c o r r e s p o n d au p i c 1 obtenu apr6s c h r o m a t o g r a p h i e snr colonne de DEAE-cellulose (fig. 11). Le pic 7 (fig. 12) est form6 p a r U' et C' (tableau IV). Tous les autres pics sont form6s d'oligonucl6otides se t e r m i n a n t par U'. Les pics 1, 2, 3 et 5 comprennent un h o m b r e d6croissant de nucI6otides pyrimidiques avant I'U terminal. En effet, si l'on porte en coordonn6es semi-logarithmiques le K d des
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 9.
r6f. 20). Or il en va pr6cis6ment ainsi pour les 3 extr6mit6s observ6es darts le RNA 5 S marqu6 au a2p (tableau III). Nous en concluons que les pics 1, 2 et 3 (fig. 12) c o r r e s p o n d e n t respectivemerit /~ C'pUpUpUpU, CpUpUpU et CpUpU. Le pic 7 (fig. 12) n ' a p p a r t i e n t pas ~ cette s6rie, puisque ses constituants (U' et C') ne p o r t e n t pas de groupe phosphate. C'est p o u r q u o i It p o i n t qui repr6sente le tKd du pic 7 (fig. 13) ne s'aligne pas avec les autres. I1 reste ~ i d e n t i f i e r le pic 5 (fig. 12). I1 ne peut s'agir que de CpU ou UpU. CpU est le constituant It plus vraisemblable du pic 5 car il n'existe pas de s6quence GpUpU prbs de l'extr6mit6 3' darts It RNA 5 S marqu6 au a2p (fig. 8). En analysant plus en d6tail le contenu des pics 3 et 5 (fig. 12), on s'aper¢oit qu'ils ne r e n f e r m e n t pas seulement CpUpU et CpU. En effet, si le contenu du pic 5 est r6cup6r6, dig6r6 au m o y e n de la ribonucl6ase A e t pass6 de nouveau sur colonne
H. Denis el M. Wegnez.
1148
de S e p h a d e x , on n ' o b t i e n t pas s e u l e m e n t U', m a t s 1 p i c s u p p l 6 m e n t a i r e , 61u6 vers le t u b e 158 (fig. 12). Le p i c 3 d o n n e 2 p i c s s u p p l 6 m e n t a i r e s , 61u6s vers les tubes 1~6 et 158 (fig. 12). Darts ces
URiDiNE
C
1000000-
B00000-
I Z
600 000-
I
I I
400000-
L ' a e t i o n c o m b i n 6 e de la r i b o n u c l b a s e T1. et de la r i b o n u e l 6 a s e A r 6 d u i t l ' i m p o r t a n c e du p i c 6 (fig. 12 et t a b l e a u IV). Ce d e r n i e r c o n t i e n t d o n c , o u t r e le d i n u c l 6 o t i d e ApU, le d i n u c l 6 o t i d e GpU. L es m o l 6 c u l e s qui se t e r m i n e n t p a r GpU d o n n e n t Ie n u c l 6 o s i d e U' apr6s u n e d i g e s t i o n ',k la r i b o n u cl6ase T~ (fig. 12 et t a b l e a u IV). De tout ce qui p r 6 e 6 d e , n o u s p o u v o n s c o n c l u r e que le RNA 5 S stock6 d a n s l ' o o c y t e p o s s 6 d e 8 extr~mit6s 3' diff6rentes (tableau IV). La s6q u e n c e e x a c t e des o l i g o n u e l 6 o t i d e s "ierminaux n'est pas a b s o l u m e n t c e r t a i n e , e a r elle a 6i6 d6d u i t e u n i q u e m e n t de Ieur p o i n t d'61ution du S e p h a d e x G-25, aprbs t r a i t e m e n t p a r la r i b o n u el6ase A ou T 1. Seul le n u c l 6 o t i d e t e r m i n a l (U et C) a 6t6 i d e n t i f i 6 a v e e c e r t i t u d e . Les extr6mit~s G p C p U p U p U p U , Gp,CpUpUpU et G p C p U p U corr e s p o n d e n t h celles que l ' o n o b s e r v e d a n s le RNA 5 S m a r q u 6 au 32p (tableau III). Les e x t r 6 m i t 6 s GpCpU et GpC p r o v i e n n e n t de m o l 6 c u l e s plus c o u r t e s que les moI6cules n o u v e l l e m e n t s y n t h 6 t i s6es. Quant aux extr6mit6s G p ~ p A p A p U , Gp C p A p U
@
et ~ p G p U (tableau IV), elles ne sont pas repr(%
200000.
sent6es
IO0
IIO
120
14o
150
TUBE
{50
160
170
dans
].5~
le
RNA
5
S
marqu6
s;o
~
,~oo '
au
32p
URiOiNE
N°
Fro. 12. - - Sdparation des oligonuel~otides 3'-terminaux du RNA 5 S marqn6 par le borohydrure [aH! Environ 50 I~g de RNA 5 S ont 6t~ m61ang~s avec 5 mg de RNA 28 S + 18 S (entraineur) et digdr6s pendant 30 minutes h 37°C soit au moyen de ribonucl6ase % ( © - - © ) soit au moyen de ribonucl6ase T~ et de ribonucldase A ( o - - e ) , avant d'dtre filtrds sur colonne de Sephadex G-25 (125 X 1,5 cm). Le graphique est dour la superposition de 2 profils d'dlution diff6rents. La fl6che montre l'endroit off est 61ude l'uridine. Fractions de 1 ml.
i.o
0,5
~ ®
4;0
,600
PO]DS MOL ECULAiRE
o l i g o n u e l 6 o t i d e s , I'U t e r m i n a l ne p e u t 6tre pr6c6d6 ni de C, ni de U, ni de G. Nous en d 6 d u i s o n s q u ' i l s'agit de ApApU et ApU ( ~ p A p A p U
et ~ p A p U
avant le traitement par
la ribonucl6ase A ; tableau IV). I1 est probable que l'oligonucl6otide C pApApU obtenu apr6s l'hydrolyse initiale par la ribonucl6ase T~ est 61u6 sur le front du pic 3 (fig. 12), tandis que l'oligonucl6otide CpApU est
]qG. 13. - - Relation entre ]e Kd des oligonuc!~otides
3'-terrr~inaux s4p,ar~s par la colonne de Sephade.~ (fig. 12) et le poids moI4cutaire pr6sum6 de ces oligonucl6otides. Les K,~ de l'uridine et de l'uracile sont indiquds comme points de rep6re. Le Ka est d6fini par ta relation suivante : Kd -- Ve - - Vo, oh V~ est le volume d'Siution de la Vl substance 6tudide, Vo est l e volume exclu et V~ le volume indus. Vo co.rrespond au volume d'61ution dt~ dextrane. V~ correspond au volume d'61ution de l'eau triti6e moins le volume d'61ution du dextrane.
61u6 entre le pic 3 et le pic 5 (fig. 12). Aprbs digestion par la ribonucl6ase A et filtration sur colonne de Sephadex 6-25, le RNA 5 S marqu6 au borohydrure fournit 3 pics de radioactivit6 (4, 6 et 7 : tableau IV). ,Le pic 6 contient 11 p. c e n t de la radioactivit6 totale (tableau IV).
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 9.
(tableau III). les m o l 6 c u l e s cl6otides sont les m o l 6 c u l e s
I1 est d o n c i m p o s s i b l e de d i r e si qui se t e r m i n e n t p a r ces o l i g o n u plus l o n g u e s ou plus c o u r t e s que n6oforn16es c o r r e s p o n d a n t e s .
Recherches biochimiques sur l'oogendse (7).
1149
TABLEAU IV.
Oligonucldotides 3'-terminaux obtenus apr~s hgdrolyse du RNA 5 S d'ovaires marqu~ au borohydrure [~H]. Hydrolyse Extrdmitds
Na
du pie (fig. 121
RNase T~ P. cent de la radioaetivit6 0.4
2,5
RNase A
Composition probable
RNase A + "1"~
Composi- P. cent P. ceUL de la radiotion de la radio- Composition probable activite problable activit6
CpUpUpUpU CpUpUpU --~pApApU (7,3)
75,6
CpUpU ~pApU
!61,2) (7,1) 6,9
16,2
---•pApU I CpU
(,,6, (3,7)
[ ApU GpU
82,1
Nous p r o p o s o n s le sch6ma suivant pour la matur a t i o n du RNA 5 S dans l'oocyte. Le RNA 5 S est synth6tis6 sous la forme d'un p r 6 c u r s e u r (A) comp o r t a n t au moths 135 nucl6otides. Le p r 6 c u r s e u r A subit une coupure e n d o n u c l 6 o l y t i q u e entre les r6sidus 120 et 12,1, 121 et 12~2 ou 122 et 123, engend r a n t ainsi une seconde forme (B) du RNA 5 S. La forme B se t r a n s f o r m e tr6s lentement en la forme d6finitive (C). La forme C ne r e n f e r m e presque plus de mol6cules c o m p o r t a n t 121 et 122 nucl6otides, mats d i e contient une p r o p o r t i o n notable (15 h 20 p. cent) de mol6cules c o m p r e n a n t 119 et m6me 118 nucl6otides. Le sch6ma esquiss6 ci-dessus n'est qu'hypoth6tique. En ce qui c o n c e r n e la forme <
ApApU
p. cent
GpCpUpUpUpU GpCpUpUpU GpCpUpU GpCpU GpC C GPuPApApU
0,5 2,5 63,0 14,5 1,5 6,5
C GPuPApU
8,0
~pGpU
3,5
(14,2)
DilSCUSSION.
BIOCHIMIE, 1973,
5,4
(2,0)
11,0 5,3
ApApU
S6quence
7,6 87,0
ApU (85,8)
le x6nope (25 000 par g6nome h a p l o i d e : r6f. 29) et distribu6s sur plusieurs chromosomes [30]. I1 se p o u r r a i t que certains g6nes soient plus longs que la m o y e n n e des autres et p r o d u i s e n t p a r cons6quent du RNA 5 S c o m p o r t a n t plus de 130 nucl6otides (fig. 1). Pour d 6 m o n t r e r que la forme A est r6ellement un p r 6 c u r s e u r du RNA 5 S, il faudrait 6tudier sa cin6tique de marquage. Mats ceci est difficile /~ r6aliser parce que les oocytes poss6dent un <
H. Denis et M. W e g n e z .
1150
m a t o g r a p h i q u e (fig. 9'). Le s6jour p r o l o n g 6 du R,NA 5 S d a n s l ' o o c y t e e n t r a l n e d o n c le r a c c o u r e i s s e m e n t d ' u n e p a r t i e des m o l $ c u l e s h l'extr6mit6 3', de m~me q u ' n n e p e r t e des g r o u p e s p h o s p h a t e s h l ' e x t r 6 m i t 6 5' [26]. Le r a c e o u r e i s s e m e n t d u R:N.A 5 S est p r o b a b l e m e n t p r o d u i t p a r u n e exonucI6ase. C'est peut-~tre Ie mSme e n z y m e qui ajoute des r6sidus u r i d y l i ques h l ' e x t r 6 m i t 6 3' (tableau III). Ce p h 6 n o m 6 n e n'est p a s i n c o m p a t i b l e avec le r a c c o u r c i s s e m e n t de la mol6eule observ6 h l o n g terme. Ce qui se p r o d u i t v r a i s e m b l a b l e m e n t , c'est u n e a b l a t i o n de I'U t e r m i n a l , suivie de son r e m p l a e e m e n t p a r un n u e l 6 o t i d e pr61ev6 duns le ~
pr6sence
des
extr6mit6s
8tre lo.calis6es (tableau II) : aprbs les n u c l 6 o t i d e s 25, 37, 48, 53, 75 et 89. I1 y a d o n c 2 r 6 g i o n s p a r t i c u l i 6 r e m e n t expos6es d a n s la mol6cule : celle qui est c o m p r i s e e n t r e les n u c l 6 o t i d e s 25 et 53 et celle qui est c o m p r i s e e n t r e les n u c l d o t i d e s 75 et 89. A u c u n e c o u p u r e ne se p r o d u i t a v a n t le r~sidu 25 et apr~s le r~sidu 89. Ceci c o n f i r m e que les 2 extr&nit6s de la mol6cule sont a p p a r i 6 e s en u n e <( tige >~ bifflaire, p e u s e n s i b l e h la r i b o n u c l 6 a s e (fig. 8). Les zones c o r r e s p o n d a n t aux r 6 s i d u s 25 53 et 75 h 89 t o r m e n t p r o b a b I e m e n t des boucles expos6es ~ l ' e n z y m e . La f r 6 q u e n c e de c e r t a i n e s c o u p u r e s v a r i e d ' u n e h y d r o l y s e fi l ' a u t r e (fig. 7 et 10 et t a b l e a u II). P a r e x e m p l e , de n o m b r e u s e s moI6cules ont 0 6 coup6es apr6s le r 6 s i d u 53 d a n s l ' e x p 6 r i e n c e de la figure 10, m a t s b e a u c o u p m o t h s l ' o n t 0 6 d a n s l ' e x p 6 r i e n c e d6crite sur la fig. 7. I1 est difficile d ' e x p l i q u e r ces v a r i a t i o n s .
GpCpApApU,
G p C p A p U et ~ipGpU (tableau IV) d a n s le RNA 5 S
Remerciements.
stock6 est difficile :k c o m p r e n d r e p u i s q u ' a u c u n e extr6mit6 c o r r e s p o n d a n t e n ' e x i s t e duns le RNA 5 S n o u v e l l e m e n t s y n t h 6 t i s 6 (fig. 8). P l u s i e u r s e x p l i c a t i o n s sont possibles. 1) On b i e n ces oligonucl6otides n ' o n t p a s 6t6 d~tect6s duns le RNA 5 S n~oform6 (tableau III). Cect p a r a i t p e u v r a i s e m b l a b l e , p u i s q u e la molaritO a d d i t i o n n 6 e des oligonucl6ot i d e s Xx, X2 et X 3 est s u p 6 r i e u r e h 1 (tableau III).
Nous remereions le Pro.fesseur R. Monier d'avoir bien voulu aecueillir M. Wegnez pendant la r~alisation d'une pattie de ce travail. Nous remereions aussi le Fonds National de la Recherche Scientifique pour son aide fin,anci6re. M. Wegnez est boursier du Patrimoiue de l'Universit~ de Libge.
2) Ou b i e n les extr6mitOs G p C p A p A p U , Gp~,pApU et ~ p G p U
proviennent
d'une
contamination
du
RNA 5 S p a r d ' a u t r e s esp~ces de RNA. C e t t e d e u x i & n e possibilit6 est aussi p e u p r o b a b l e . Le RNA 5 S a 6t6 p u r i f i 6 p a r f i l t r a t i o n sur c o l o n n e de S e p h a d e x G-100, suivie de 2 61ectrophor6ses en gel de p o l y a e r y l a m i d e , d o n t l ' u n e en p r S s e n e e d'urSe 7 M. T o u t o l i g o n u e l 6 o t i d e q u i a d h 6 r e r a i t a n RNA 5 S d e v r a i t 6tre 61imin6 au e o u r s de la p u r i f i c a tion. 3) I1 reste u n e t r o i s i 6 m e possibilit6 : u n e p a r t i e du RNA 5 S ,(___ 15 p. cent) p o u r r a i t 6tre m o d i f i 6 e h l ' e x t r 6 m i t 6 3'. Une a b l a t i o n se p r o d u i r a i t j u s q u ' a u n u e l 6 o t i d e .118 ( C ; fig. 8) et s e r a i t suivie de l ' a d d i t i o n soit de GpU, soit de ApU, soit de A p A p U (tableau IV). A p r e m i 6 r e r u e , eette suite d ' 6 v 6 n e m e n t s p a r a l t p e u p r o b a b l e . Mats il ne t a u t pus o u b l i e r que le RNA 5 S s 6 j o u r n e duns l ' o o c y t e p e n d a n t de n o m b r e u x m o i s [9] et p e u t s u b i r des r e m a n i e m e n t s i m p o r t a n t s qui n ' a p p a r a i s s e n t pus q u a n d l ' i n c o r p o r a t i o n duns Ie r i b o s o m e a l i e u tout de suite apr6s la s y n t h 6 s e , e o m m e c'est le cas duns les cellules s o m a t i q u e s (fig. 6). Les h y d r o l y s e s mod6r6es p a r la r i b o n u c l 6 a s e T~ a p p o r t e n t c e r t a i n e s i n f o r m a t i o n s c o n c e r n a n t la s t r u c t u r e s e c o n d a i r e du RNA 5 S de x6nope. Six c o u p u r e s i n t r o d u i t e s p a r la r i b o n u c l 6 a s e Tx o n t p u
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 9.
R~SUM~. Comme nous l'avons montr6 prdc6demment, le RNA 5 S synthdtis4 par les petits oocytes de Xenopus laevis est mis en r6serve pendant plusieurs mois avant d'etre irLcorpor6 dans les ribosomes. Duns cet article, nous comparons les pro~pri6t6s du RNA 5 S nouvellement synthdtis6 avec eelles du RNA 5 S stock6 dana l'oocyte. Le RNA 5 S ndoform6 diffSre du RNA 5 S total par sa mobilit6 61ectrophor6tique et par son comportement chromatographique. Nous p.roposons le schdma suivant p o u r la maturation du RNA 5 S dans l'oocyte. Le RNA 5 S apparatt to,at d'abord sons la forme d'un prdeurseur (forme A) contenar~t plus de 135 nacldotides. Ce pr&nrseur subit rapidement une ablatiorL h l'extr6mit6 3' et donne naissance h la deuxi6me forme (B) du RNA 5 S. CelIeci comprend 80 p. cent de mol&ules longues de 12:0 uuel~otides et 20 p. cent de mol&ules longues de 121 ou 1~2 nttcl~otides. La fovme B se convertit tr6s lentement en uue troisi&me forme (C), qui est la forme de stockage. La p lupart des molecules de la forme C comportent 12'0 nucI6otides, mats 15 h 20 p. cent d'entre elles comportent 119 ou 118 nucldotides. Dans les cellules somatiques, le RNA 5 S ne subit aucune m,odification h long terme semblable h celle qui s'o.bserve darts les o,ocytes. Le schema esquiss6 ei-dessus est ap,puy~ par les observations suivantes. 1) Le RNA 5 S marqud an 32p contient une faible proportion de mol6cules qui contiennent au moins 135 aucl6otides. Les nucl~otides suppldmentaires sont localis6s h l'extr&nit6 3' du RNA 5 S. 2) Le RNA 5 S nouvellement synth~tisd (forme B) est 16g6rement plus long que le RNA 5 S stock& Ceei peat ~tre d6montr5 en mesurant la mobilit6 61ectro-
Recherches biochimiques sur l'oogen~se (7). phor6tique du f r a g m e n t 3 ' - t e r m i n a l (nucl6otides 90120) obtenu apr6s n n e h y d r o l y s e partielle du RNA 5 S p a r la ribonncl6ase T1. Si I'on en[6ve les nucI6otides qui suivent le r6sidu n ° 118 par u n t r a i t e m e n t & !a phosphodiest6rase de v e n i n de serpent, le comportem e n t c h r o m a t o g r a p h i q u e du RNA 5 S n o u v e l l e m e n t f o r m 5 devient identique h celui du RNA 5 S stock~ dans i'oocyte. 3) Apr6s h y d r o t y s e p a r la ribonucldase T , le RNA 5 S m a r q u 6 au 32p f o u r n i t 3 oligonucl6otides 3'-termi-imux (CpUpU, CpUpUpU et CpUpUpUpU). La p l u p a r t des mol6cules no u v e l l e m e n t synth6tis~es se t e r m i n e n t par l'oligonucl6otide CpUpU. Le RNA 5 S stock6 dans l'oocyte poss6de 8 extr6mit6s 3' diff~rentes. La plus fr~quen~e est CpUpU, c o m m e d a n s le RNA 5 S nouvell e m e n t synth6tis6 (63 p. cent de routes les extr6mit6s). Les extrdmit~s CpUpUpU et CpUpUpUpU ne se r e n c o n t r e n t que darts 3 p. cent des mol6cules. Deux e x t r ~ mit6s (CpU et C : 16 p. cent de routes les extr6mitds) c o r r e s p o n d e n t h des molecules c o n t e n a n t 1 h 4 nucl~otides en m o i n s que le RNA 5 S n o u v e l l e m e n t synth6tis~.
Les 3 derni~res extr6mit6s (Gp~ pApApU~ Gp~ pApU et ~ pGpU : 18 p. cent de routes les extr~mit~s) n ' o n t Std d6tect6es que clans le RNA 5 S stock~ dans l'oocyte. Ces extr~mit6s ne p e u v e n t pas d6river de celles que l'on a observ~es dans le RNA 5 S naissant p a r une simple a b l a t i o n des nucldotides t e r m i naux. 4) Apr6s m a r q u a g e au 32p, les r6sidus u r i d y l i q u e s des oligonucl6otides 3 ' - t e r m i n a n x (CpUpU, CpUpUpU et CpUpUpUpU) ont t o u j o u r s u n e activitd sp6cifique p.lus dlev~e que le r6sidu c y t i d y l i q u e . Ceci suggbre un r e ~ o u v e l l e m e n t de l'extr~mit~ 3', qui p o u r r a i t ~tre en r a p p o r t avec le r a c e o u r c i s s e m e n t tr6s lent que le RNA 5 S subit p e n d a n t son stockage dans l'oocyte. BIBLIOGRAPHIE. 1. Gall, J. G. (1968) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S., 60, 553-560. 2. Evans, D. ,~ Birnstiel, M. L. (1968) Biochim. Biophys. Acta, 1'66, 274-276. 3. Bro,wn, D. D. a Dawid, I. B. (1968) Science, 160, 272-280. 4. Wegnez, M. ~ Denis, H. (1972) Biochimie, 54, 10691072. 5. Mairy, M. & Denis, H. (1971) Develop. Biol., 24, 143165.
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