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SPD1-05 Recherche Par Une Approche Protéomique De Biomarqueurs Associés À La Résolution De L'infection Par Le Virus De L'hépatite C
Sessions posters discut6s / Transfusion clinique et biologique 12 (2005) $44-$56
ces inoculums aibles, la prolifdration durable des bactEries dans les CGR conserv6s h +4°C est difficile. L'enrichissement H24 favorise la d&ection et le test pool permet de d6tecter 103 CFU/ml darts le CGR. Darts ces conditions la valeur pr6dictive negative du test ~ J14 est tr~s bonne.
SPD1-03 FAUT-IL INTRODUIRE LE DGV DU VIRUS DE L'HI~PATITE B DANS LA QUALIFICATION BIOLOGIQUE DES DONS ? ASSAL A.*, MOREL P.**, COSTE J.***, REBIBO D.****, MANIEZ M.*****, LAPERCHE S.******, PILLONEL J.*******, CORNILLOT C.****, ANDREU G.**** *EFS CENTRE ATLANTIQUE, TOURS, F R A N C E ; **EFS B O U R G O G N E FRANCHE-COMTE, DIJON, F R A N C E ; ***EFS P Y R E N E E S MEDITERRANEE, MONTPELLIER, F R A N C E ; ****EFS, PARIS, F R A N C E ; *****EFS N O R D D E FRANCE, F R A N C E ; ******INTS, PARIS, F R A N C E ; *******INVS, PARIS, F R A N C E
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Introduction: Le d@istage du VHB en qualification biologiquc du don cst aujourd'hui bass sur le d6pistage de l'Ag HBs et de l'anticorps anti-HBc. Nous avons 6tudi6 la r6duction de la fen~tre sErologique par le DGV VHB. Materiels et in6thodes : Nous avons estim6 la reduction de la fen~tre sErologique par le nouveau test Procleix Ultrio Assay (Chiron) comparativement au dEpistage s6rologique de 1'Ag HB s (Prism Abbott) sur 10 panels de s6roconversion commerciaux. La comparaison des deux tests a 6t6 r6alis6e sur les 6chantillons des panels purs et diluEs au 1/8, 1/16 et 1/24. Nous avons ensuite calcul6 le gain apport6 par le DGV en nombre de dons infectEs EcartEs par an. R~sultats : Le DGV permettrait de dEpister le VHB 15 jours avant la d&ection de 1 'AgHBs darts des Echantillons non dilu6s et de 5, 4 et 2 jours darts des pools de 8, 16 et 24 &hantillons respectivement. Le gain annuel par rapport ~t la serologic, sur une base de 2,4 millions de dons collect& par an, serait de un don infectE Ecart6 tous les 2,5 ans avec le DGV en pools et de un h deux dons par an avec le DGV sur dons unitaires. Conclusion: L'introduction du DGV VHB sur pools d'6chantillons n'apporterait pas de gain notable par rapport aux techniques sErologiques les plus sensibles. Seul le dEpistage unitaire ou le d6pistage en pools de plus petite taille et/ou avec des protocoles modifids pourrait amEliorer la sEcurit6 transfusionnelle vis ~t vis du VHB. Le d6pistage unitaire ne serait possible qu'g l'aide d'automates integrals ~t haut debit. Cependant, le DGV VHB a 6tE introduit dans les DOM depuis d6cembre 2004, pour le double motif d'une prevalence VHB plus 61ev6e qu'en m&ropole et d'un DGV pratique sur dons unitaires.
$45
SPD1-04 DISTRIBUTION DES GI~NOTYPES ET EPIDI~MIOLOGIE MOLI~CULAIRE DU VIRUS DE L'HI~PATITE C CHEZ LES DONNEURS DE SANG DE LA RI~GION PROVENCE-COTE D'AZUR CANTALOUBE J.-F., GALLIAN P., DE LAMBALLERIE X., DE MICCO P. UNITIE DES VIRUS E M E R G E N T S - EA 3292 - EES ALPESME, DITERRANEE, MARSEILLE, F R A N C E
j fc-ets-ap @gulliver.fi" Nous avons analys6 l'6volution de la distribution des g6notypes du virus de l'h6patite C (VHC) chez les donneurs de sang originaires du sud-est de la France sur une p6riode de 12 ans (1991-2002). Les gEnomes viraux, obtenus 5 partir de 321 &hantillons, ont Et6 gEnotypEs par amplification et sEquen~age des regions E1 et NS5b. Les gEnotypes les plus repr6sentEs sont les sous-types lb (30,2 %), la (27,7 %) et 3a (22,4 %). Le gEnotype 2 est moins present mais il est caract&is6 par la pr6sence de souches appartenant 5 11 sous-types diffErents parmi lesquels cinq n'avaient jamais Et6 identifi6es ~ ce jour. Les g6notypes la, 3a, 4a et lb ont des profils 6pidEmiques avec un grand nombre d'isolats et des distances g6n&iques moyennes faibles entre isolats tandis que le type 2 montre un profil end& rnique typique avec un grand nombre de sous-types avec tr~s peu d'isolats dans chacun. La distribution des gfinotypes du VHC a 6tE profondEment modifiEe durant cette p6riode en relation avec la modification des facteurs de risques. Nous observons l'6mergence de nouveaux sous-types 6pidEmiques (1 a et 3 a, lies ~tl'injection de drogue par voie intra-veineuse) et une diminution des types li6s ~ la transfusion et ~ l'infection nosocomiale (le soustype lb qui est le sous-type 6pidEmique le plus ancien dans notre region, et le type 2 endEmique). Finalement la comparaison des souches virales provenant des donneurs de sang avec celles d'une cohorte de patients, dans la m~me region et durant la m~me p6riode dEmontre pour la premiere lois que le suivi des donneurs de sang est globalement un indicateur valide de l'~pidEmiologie du VHC en terme de distribution des gEnotypes.
SPD1-05 RECHERCHE PAR UNE APPROCHE PROTI~OMIQUE DE BIOMARQUEURS ASSOCII~S A LA RESOLUTION DE L'INFECTION PAR LE VIRUS DE L'Hl~PATITE C MOLINA S.*, MAUREL P.*, COSTE J.**, FOURNIER-WIRTH C. ** *INSERM U 632, MONTPELLIER, F R A N C E ; **EFS PM, MONTPELLIER, F R A N C E
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$46
Sessionsposters discutds/ Transfusion clinique et biologique 12 (2005)$44-$56
Introduction : L'identification de biomarqueurs repr6sente l'une des Etapes les plus pr6coces et difficiles du d6veloppemerit d'outils diagnostiques et de stratdgies th6rapeutiques. Malgr6 les progrbs r6cents r6alisEs dans le d6pistage du virus et la prise en charge des patients, de nombreux aspects de l'infection demeurent incompris. L'objectif de ce projet est de rechercher grace h une approche prot6omique des biomarqueurs signant la resolution de l'infection par le VHC. M6thodes : La raise en oeuvre en transfusion sanguine du d6pistage gEnomique viral permet de detecter des donneurs dans la phase pr6coce de l'infection VHC. La recherche de biomarqueurs a Et6 basEe sur la comparaison de profils prot6iques de plasmas de donneurs ayant r6solus leur infection avec ceux de porteurs chroniques et de donneurs n4gatifs. La technologic SELDI (Ciphergen Biosystem) utilisEe, combinant la capture de prot4ines directement ~ paz~ir d'un extrait brut sur des surfaces actives (puces ~ prot6ines) avec l'analyse par spectrometric de masse, a permis de sdlectionner deux candidats. AprOs chromatographic, les fractions purifi6es ont 6t6 analys6es par 61ectrophor~se bidimensionnelle en vue de l'identification des candidats par sEquenqage. Perspectives : Les candidats biomarqueurs d6couverts doivent ~tre Evalu6s en tant qu'outils de d6pistage. Leur effet sur le ph6notype h6patique et sur l'infection sera 6tudi6 in vitro dans notre modble de cultures primaires d'h6patocytes humains. Conclusion : Le SELDI permet de rechercher des prot6ines d'int6r~t directement dans le plasma humain. Les nouveaux outils hdrit6s de la g6nomique fonctionnelle pr6sentent un rdel potentiel dans le cadre du diagnostic.
SPD1-06
R E C H E R C H E DE L'ADN DU P A R V O V I R U S B19 DANS DES POOLS DE P L A S M A DU L.F.B SUR L ' A U T O M A T E L I G H T C Y C L E R V2.0 A L'AIDE DE DEUX TROUSSES C O M M E R C I A L E S . C O M P A R A I S O N DES RI~SULTATS OBTENUS L'AFSSAPS ET AU L.F.B. LAPEYRE M.*, GOUJON N.*, LIEVRE V.*, MOUILLOT L.*, TISSIER M.-H.*, VISSE C.** *AFSSAPS, ST-DENIS, FRANCE ; **L.F.B., LES ULIS, FRANCE [email protected] La PharmacopEe Europdenne 5 eme6dition parue en juin 2004 et applicable au ] e~janvier 2005 rend obligatoire la recherche de I'ADN du parvovirus B19 dans les pools de plasma destin6s ?t la fabrication de certains m6dicaments ddriv6s du sang. Elle fixe le seuil d'exclusion ~ 104 UI/ml et recommande d'utiliser un rEactif capable de ddtecter les variants du B19. Une Etude en aveugle a 6t6 effectude ~ l'Afssaps et au LFB sur des 6chantillons de pools de 300 dons provenant du LFB,
chacun d'entre eux @ant constitu6 de six pools de 50 dons. Une extraction automatique sur MagNA Pure suivie d'une amplification/d6tection Roche sur LightCycler V1.2 a 6tE raise en oeuvre au LFB, une extraction manuelle High Pure Viral suivie de deux amplifications/d6tections Roche et Artus sur LightCycler V2.0 ont 6t4 effectu6es ~ l'Afssaps. Au total 101 pools de 300 dons, le standard international d'ADN du parvovirus B 19 diluE h 104 UI/ml et utilis6 comme tEmoin seuil ainsi que la souche du variant A6 de la Pharmacopde Europ6enne ont 6t6 test6s. R6sultats : sur les 101 pools de plasma testes, trois ont Et6 d6tectEs supdrieurs h 10 4 UI/ml et confirmds sur les pools de 50 dons. Cette 6tude nous a en outre permis de comparer la sensibilitE et la sp6cificit6 des deux trousses vis ~ vis d'un variant du B 19.
SPD1-07
MISE AU POINT LA MI~THODE D'AMPLIFICATION P M C A (PROTEIN MISFOLDING CYCLIC AMP L I F I C A T I O N ) P O U R LA DI~TECTION DE LA PROTI~INE PRION INFECTIEUSE LEON F., SEGARRA C., COSTE J. LABO DE RECH. ET DEV. AGENTS TRANSMISSIBLES PAR TRANSFUSION, EFS P YRENEES-MEDITERRANEE, MONTPELLIER, FRANCE [email protected] Introduction : Depuis les publications de deux cas probables de transmission de la variante de la maladie de Creutzfeldt-Jacob par transfusion chez des patients britanniques, l'hypothbse de la pr6sence de la prot6ine prion pathologique (PrPsc) dans le sang ne peut plus Otre exclue. La m6thode PMCA, bas6e sur l'amplification de la PrPsc, permettrait la raise en 6vidence dans le sang de faibles concentrations de PrPsc non d6tect6es ~ ce jour. Objectif : D6velopper un test de d6pistage de la PrPsc dans les composants cellulaires du sang humain. La premibre 6tape consiste ~ reproduire et ~ optimiser la technique PMCA ddcrite initialement sur des cerveaux de hamster, en vue de son adaptation sur le sang de hamster puis sur le sang humain. Mat6riel et m6thode : La PMCA repose sur des cycles successifs d'incubation et de sonication. Lors de l'incubation, des aggr6gats de prot6ines PrPsc sont form6s a partir d'une faible quantit6 de PrPsc initiant la transconformation de la prot6ine prion normale (PrPc) en PrPsc. La sonication des aggr6gats entraine la formation de nombreux noyaux de nucl6atiou permettant de nouvelles amplifications. La PrPsc amplifi6e est d6tect6e par Western Blot. R6sultats : La PMCA permet d'amplifier 35 fois la quantit6 initiale de PrPsc. L'optimisation de cette technique (x120) a pu 8tre obtenue par l'apport de cofacteurs. La m6thode est reproductible et sp6cifique.
ces inoculums aibles, la prolifdration durable des bactEries dans les CGR conserv6s h +4°C est difficile. L'enrichissement H24 favorise la d&ection et le test pool permet de d6tecter 103 CFU/ml darts le CGR. Darts ces conditions la valeur pr6dictive negative du test ~ J14 est tr~s bonne.
SPD1-03 FAUT-IL INTRODUIRE LE DGV DU VIRUS DE L'HI~PATITE B DANS LA QUALIFICATION BIOLOGIQUE DES DONS ? ASSAL A.*, MOREL P.**, COSTE J.***, REBIBO D.****, MANIEZ M.*****, LAPERCHE S.******, PILLONEL J.*******, CORNILLOT C.****, ANDREU G.**** *EFS CENTRE ATLANTIQUE, TOURS, F R A N C E ; **EFS B O U R G O G N E FRANCHE-COMTE, DIJON, F R A N C E ; ***EFS P Y R E N E E S MEDITERRANEE, MONTPELLIER, F R A N C E ; ****EFS, PARIS, F R A N C E ; *****EFS N O R D D E FRANCE, F R A N C E ; ******INTS, PARIS, F R A N C E ; *******INVS, PARIS, F R A N C E
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Introduction: Le d@istage du VHB en qualification biologiquc du don cst aujourd'hui bass sur le d6pistage de l'Ag HBs et de l'anticorps anti-HBc. Nous avons 6tudi6 la r6duction de la fen~tre sErologique par le DGV VHB. Materiels et in6thodes : Nous avons estim6 la reduction de la fen~tre sErologique par le nouveau test Procleix Ultrio Assay (Chiron) comparativement au dEpistage s6rologique de 1'Ag HB s (Prism Abbott) sur 10 panels de s6roconversion commerciaux. La comparaison des deux tests a 6t6 r6alis6e sur les 6chantillons des panels purs et diluEs au 1/8, 1/16 et 1/24. Nous avons ensuite calcul6 le gain apport6 par le DGV en nombre de dons infectEs EcartEs par an. R~sultats : Le DGV permettrait de dEpister le VHB 15 jours avant la d&ection de 1 'AgHBs darts des Echantillons non dilu6s et de 5, 4 et 2 jours darts des pools de 8, 16 et 24 &hantillons respectivement. Le gain annuel par rapport ~t la serologic, sur une base de 2,4 millions de dons collect& par an, serait de un don infectE Ecart6 tous les 2,5 ans avec le DGV en pools et de un h deux dons par an avec le DGV sur dons unitaires. Conclusion: L'introduction du DGV VHB sur pools d'6chantillons n'apporterait pas de gain notable par rapport aux techniques sErologiques les plus sensibles. Seul le dEpistage unitaire ou le d6pistage en pools de plus petite taille et/ou avec des protocoles modifids pourrait amEliorer la sEcurit6 transfusionnelle vis ~t vis du VHB. Le d6pistage unitaire ne serait possible qu'g l'aide d'automates integrals ~t haut debit. Cependant, le DGV VHB a 6tE introduit dans les DOM depuis d6cembre 2004, pour le double motif d'une prevalence VHB plus 61ev6e qu'en m&ropole et d'un DGV pratique sur dons unitaires.
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SPD1-04 DISTRIBUTION DES GI~NOTYPES ET EPIDI~MIOLOGIE MOLI~CULAIRE DU VIRUS DE L'HI~PATITE C CHEZ LES DONNEURS DE SANG DE LA RI~GION PROVENCE-COTE D'AZUR CANTALOUBE J.-F., GALLIAN P., DE LAMBALLERIE X., DE MICCO P. UNITIE DES VIRUS E M E R G E N T S - EA 3292 - EES ALPESME, DITERRANEE, MARSEILLE, F R A N C E
j fc-ets-ap @gulliver.fi" Nous avons analys6 l'6volution de la distribution des g6notypes du virus de l'h6patite C (VHC) chez les donneurs de sang originaires du sud-est de la France sur une p6riode de 12 ans (1991-2002). Les gEnomes viraux, obtenus 5 partir de 321 &hantillons, ont Et6 gEnotypEs par amplification et sEquen~age des regions E1 et NS5b. Les gEnotypes les plus repr6sentEs sont les sous-types lb (30,2 %), la (27,7 %) et 3a (22,4 %). Le gEnotype 2 est moins present mais il est caract&is6 par la pr6sence de souches appartenant 5 11 sous-types diffErents parmi lesquels cinq n'avaient jamais Et6 identifi6es ~ ce jour. Les g6notypes la, 3a, 4a et lb ont des profils 6pidEmiques avec un grand nombre d'isolats et des distances g6n&iques moyennes faibles entre isolats tandis que le type 2 montre un profil end& rnique typique avec un grand nombre de sous-types avec tr~s peu d'isolats dans chacun. La distribution des gfinotypes du VHC a 6tE profondEment modifiEe durant cette p6riode en relation avec la modification des facteurs de risques. Nous observons l'6mergence de nouveaux sous-types 6pidEmiques (1 a et 3 a, lies ~tl'injection de drogue par voie intra-veineuse) et une diminution des types li6s ~ la transfusion et ~ l'infection nosocomiale (le soustype lb qui est le sous-type 6pidEmique le plus ancien dans notre region, et le type 2 endEmique). Finalement la comparaison des souches virales provenant des donneurs de sang avec celles d'une cohorte de patients, dans la m~me region et durant la m~me p6riode dEmontre pour la premiere lois que le suivi des donneurs de sang est globalement un indicateur valide de l'~pidEmiologie du VHC en terme de distribution des gEnotypes.
SPD1-05 RECHERCHE PAR UNE APPROCHE PROTI~OMIQUE DE BIOMARQUEURS ASSOCII~S A LA RESOLUTION DE L'INFECTION PAR LE VIRUS DE L'Hl~PATITE C MOLINA S.*, MAUREL P.*, COSTE J.**, FOURNIER-WIRTH C. ** *INSERM U 632, MONTPELLIER, F R A N C E ; **EFS PM, MONTPELLIER, F R A N C E
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Sessionsposters discutds/ Transfusion clinique et biologique 12 (2005)$44-$56
Introduction : L'identification de biomarqueurs repr6sente l'une des Etapes les plus pr6coces et difficiles du d6veloppemerit d'outils diagnostiques et de stratdgies th6rapeutiques. Malgr6 les progrbs r6cents r6alisEs dans le d6pistage du virus et la prise en charge des patients, de nombreux aspects de l'infection demeurent incompris. L'objectif de ce projet est de rechercher grace h une approche prot6omique des biomarqueurs signant la resolution de l'infection par le VHC. M6thodes : La raise en oeuvre en transfusion sanguine du d6pistage gEnomique viral permet de detecter des donneurs dans la phase pr6coce de l'infection VHC. La recherche de biomarqueurs a Et6 basEe sur la comparaison de profils prot6iques de plasmas de donneurs ayant r6solus leur infection avec ceux de porteurs chroniques et de donneurs n4gatifs. La technologic SELDI (Ciphergen Biosystem) utilisEe, combinant la capture de prot4ines directement ~ paz~ir d'un extrait brut sur des surfaces actives (puces ~ prot6ines) avec l'analyse par spectrometric de masse, a permis de sdlectionner deux candidats. AprOs chromatographic, les fractions purifi6es ont 6t6 analys6es par 61ectrophor~se bidimensionnelle en vue de l'identification des candidats par sEquenqage. Perspectives : Les candidats biomarqueurs d6couverts doivent ~tre Evalu6s en tant qu'outils de d6pistage. Leur effet sur le ph6notype h6patique et sur l'infection sera 6tudi6 in vitro dans notre modble de cultures primaires d'h6patocytes humains. Conclusion : Le SELDI permet de rechercher des prot6ines d'int6r~t directement dans le plasma humain. Les nouveaux outils hdrit6s de la g6nomique fonctionnelle pr6sentent un rdel potentiel dans le cadre du diagnostic.
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R E C H E R C H E DE L'ADN DU P A R V O V I R U S B19 DANS DES POOLS DE P L A S M A DU L.F.B SUR L ' A U T O M A T E L I G H T C Y C L E R V2.0 A L'AIDE DE DEUX TROUSSES C O M M E R C I A L E S . C O M P A R A I S O N DES RI~SULTATS OBTENUS L'AFSSAPS ET AU L.F.B. LAPEYRE M.*, GOUJON N.*, LIEVRE V.*, MOUILLOT L.*, TISSIER M.-H.*, VISSE C.** *AFSSAPS, ST-DENIS, FRANCE ; **L.F.B., LES ULIS, FRANCE [email protected] La PharmacopEe Europdenne 5 eme6dition parue en juin 2004 et applicable au ] e~janvier 2005 rend obligatoire la recherche de I'ADN du parvovirus B19 dans les pools de plasma destin6s ?t la fabrication de certains m6dicaments ddriv6s du sang. Elle fixe le seuil d'exclusion ~ 104 UI/ml et recommande d'utiliser un rEactif capable de ddtecter les variants du B19. Une Etude en aveugle a 6t6 effectude ~ l'Afssaps et au LFB sur des 6chantillons de pools de 300 dons provenant du LFB,
chacun d'entre eux @ant constitu6 de six pools de 50 dons. Une extraction automatique sur MagNA Pure suivie d'une amplification/d6tection Roche sur LightCycler V1.2 a 6tE raise en oeuvre au LFB, une extraction manuelle High Pure Viral suivie de deux amplifications/d6tections Roche et Artus sur LightCycler V2.0 ont 6t4 effectu6es ~ l'Afssaps. Au total 101 pools de 300 dons, le standard international d'ADN du parvovirus B 19 diluE h 104 UI/ml et utilis6 comme tEmoin seuil ainsi que la souche du variant A6 de la Pharmacopde Europ6enne ont 6t6 test6s. R6sultats : sur les 101 pools de plasma testes, trois ont Et6 d6tectEs supdrieurs h 10 4 UI/ml et confirmds sur les pools de 50 dons. Cette 6tude nous a en outre permis de comparer la sensibilitE et la sp6cificit6 des deux trousses vis ~ vis d'un variant du B 19.
SPD1-07
MISE AU POINT LA MI~THODE D'AMPLIFICATION P M C A (PROTEIN MISFOLDING CYCLIC AMP L I F I C A T I O N ) P O U R LA DI~TECTION DE LA PROTI~INE PRION INFECTIEUSE LEON F., SEGARRA C., COSTE J. LABO DE RECH. ET DEV. AGENTS TRANSMISSIBLES PAR TRANSFUSION, EFS P YRENEES-MEDITERRANEE, MONTPELLIER, FRANCE [email protected] Introduction : Depuis les publications de deux cas probables de transmission de la variante de la maladie de Creutzfeldt-Jacob par transfusion chez des patients britanniques, l'hypothbse de la pr6sence de la prot6ine prion pathologique (PrPsc) dans le sang ne peut plus Otre exclue. La m6thode PMCA, bas6e sur l'amplification de la PrPsc, permettrait la raise en 6vidence dans le sang de faibles concentrations de PrPsc non d6tect6es ~ ce jour. Objectif : D6velopper un test de d6pistage de la PrPsc dans les composants cellulaires du sang humain. La premibre 6tape consiste ~ reproduire et ~ optimiser la technique PMCA ddcrite initialement sur des cerveaux de hamster, en vue de son adaptation sur le sang de hamster puis sur le sang humain. Mat6riel et m6thode : La PMCA repose sur des cycles successifs d'incubation et de sonication. Lors de l'incubation, des aggr6gats de prot6ines PrPsc sont form6s a partir d'une faible quantit6 de PrPsc initiant la transconformation de la prot6ine prion normale (PrPc) en PrPsc. La sonication des aggr6gats entraine la formation de nombreux noyaux de nucl6atiou permettant de nouvelles amplifications. La PrPsc amplifi6e est d6tect6e par Western Blot. R6sultats : La PMCA permet d'amplifier 35 fois la quantit6 initiale de PrPsc. L'optimisation de cette technique (x120) a pu 8tre obtenue par l'apport de cofacteurs. La m6thode est reproductible et sp6cifique.