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Utilisation de cultures de cellules de lignée continue hela pour la mise en evidence de potentialités toxiques in vitro
B,l,,r Rese~rch Vol. 13. pp. 739 to 743 Pergamon Press Ltd 1979. Printed in Great Britain.
UTILISATION DE CULTURES DE CELLULES DE LIGNITE CONTINUE HELA POUR LA MISE EN EVIDENCE DE POTENTIALITIES TOXIQUES IN VITRO G. GERIN-RozEt, D. HEMON*,C. BEgOt* et B. FEsrYt (Reeu 4 Decembre 1978)
Rt~am6--La d6tection pr6ventive ou curative des potentialit6s toxiques 6ventuelles de divers produits, substances ou facteurs susceptibles de venir au contact de renvironncment ou r6suitant de sa contamination, implique en particulier de disposer de tests biologiques indicateurs aussi satisfaisants que possible pour appr6cier, dam un premier temps, un risque potentiel pour ia sant6. Data cet esprit, nous proposons et d6crivons en d6tail, arguments statistiques/t I'appui, un test biologique in vitro relativement simple et fiable utilisant des cellules Hela en culture pour d6celer des effets cytotoxiques globaux. Ce test, applicable selon deux modalit6s techniques, en tube ou sur plaque, se pr;~te /t de grandes s6ries d'essais et donne des r6ponses semi-quantitatives au plus en 7 jours` par r6fh'ence "~une substance toxique 6talon, le p. chloroph6noi, sous forme d'une dose inhibitrice 50% (D.i. 50). Ce test est couramment appliqu¢~au laboratoire, seul ou en association, "~la detection et h la mesure des effets biologiques et toxiques d'extraits de mierocontaminants des eaux et des particules atmosph6riques. Almtract--A simple andd reliable test is proposed for the detection of potentially toxic substances and described in detail. This test detects the total toxic effects of chemical or compounds on Hela cells incubated in vitro, either within tubes or over plates. This test can be carried out with large number of samples andd its results can be obtained within 7 days. Based on semi-quantitative readings, the final result of the test is expressed as an inhibitory dose (D.I. 50) and/or as a relative potency with respect to a reference toxic chemical: p. chlorophenol. This test has been routinely used, sometimes in association with other tests, to measure the toxic effects of water micropollutants and of atmospheric particles.
INTRODUCTION La recherche de potentialit6s toxiques ~ court, moyen ou long terme de divers produits, substances ou facteurs n6cessite la mis~ en oeuvre simultan6¢ ou ind6pcndante d'essais r6alis6s in vivo, in vitro ou mixtes qui sont d'int6r6t in6gal quant aux dillicult6s qu'ils impliquent et aux informations qu'ils fournisscnt. A priori, on est tent6 d'accorder davantage de cr6dit aux cssais portant sur les organismes animaux car ces derniers constituent des mod/:ies exph'imcntaux relativemerit proches de l'~.tre humain. Les exp6rimcntations animales sont limit6¢s darts leurs applications par des imp6ratifs techniques de tons ordres et souffrent, pour les essais /t long terme, d'un d61ai de r6ponse tr~s important (1-2 arts). Aussi, bicn qu'il ne faille pas oublier les diff6rences biologiques fondamentales entre organismes multicellulaires et unicellulaires, notamment quant aux processus de p6n~tration et de m6tabolisation en g6n6ral, on a essay6 depuis de nombreuses ann6es d'utiliser des syst6mes ceilulaires in * Unit6 de Recherches Statistiques de I'INSERM-16bis` Avenue Paul Vaillant Couturier, 94800, Villejuif. ? Laboratoire d'Hygi~e de la Ville de Paris, 1 bis, rue des Hospitalih'es St Gervais, 75004, Paris, et U.E.R. des Sciences Pharmaceutiques de Caen-l, rue Vaubenard, 14000, Caen.
vitro (Deysson, 1969; Thomas, Goldstein & Wilcox, 1973); ce sont des moch?:les ceilulaires simplifi6s ne mettant en jeu ClU'Un minimum de probi6mes techniques et capables de fournir darts un d61ai court des informations toxicologiques au moths indicatives (notion d'indicateur biologique exp6rimental d'exposition toxique). Ce souci de simplification exp6rimentale apparait tr6s nettement depuis queiques ann6es en ce qui concerne la d6tection des potentialit6s carcinog6nes des multiples facteurs nous environnant et il a 6t6 propos6/t cet effet d'utiliser des syst6mes procaryotes, ou eucaryotes pour d6celer des effets mutag6nes dont la probabilit6 d'association aux effets canc6rog~:nessemble tr6s 61ev6e (Ames et al., 1975; Purchase et ai., 1976; Bridges, 1976). Pour notre part, et darts un souci de protection de renvironnement et de la sant6 publique, nous proposons a p r ~ pinsieurs ann6es d'exp6rimentation au Laboratoire d'Hygi6ne (Coin et ai, 1968; Guinot & Coin, 1971) un test tr6s simple utilisam un syst6me e,cllulaire classique de ceUules de lign6e continue Hela, Celles-ci ont 6t~ choisies d 6 1 i b ~ e n t , malgr6 ieur caracth'e tramform6, en raison de leur facile adaptation i des essais syst6matiques de cytotoxicit6. De fait, une 6tude statistique approfondie a r6v616 q u e ce test permet d'6valuer en quelques jours avec une
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pr6cision biologique satisfaisante et une bonne fiabilit6 les potentialit6s cytotoxiques de substances ou produits divers. I. PRINCIPE DU TEST P R O P O S E
L'effet biologique d'une substance pure, d'un produit complexe ou d'un extrait ~ examiner est 6valu6 par I'importance de l'effet cytotoxique qu'il exerce in vitro vis-h-vis d'une culture standardis~e de cellules de lign6e continue Hela. Cet effet est appr6cie macroscopiquement et microscopiquement en 7 jours au maximum en suivant rimportance des alterations provoqu~es et notamment de la lyse globale du tapis cellulaire; les r6sultats sont rendus semi-quantitatifs par l'utilisation en cinq exemplaires de plusieurs dilutions du produit b, examiner et I'expression d'une D.I. 50 (dose inhibitrice 50%) calcul6e selon la m6thode statistique de Spearman-Karber (Finney, 1951, 1952). Deux modalit6s techniques sont applicables seion que l'on met le facteur toxique au contact d'un tapis cellulaire complet form6 pr6alablement (technique "en tubes") ou d'une suspension cellulaire engendrant un tapis cellulaire en cours d'essai (technique "sur plaques"). Celle-ci, bien que 16g6rement moins sensible, se pr6te plus facilement fi de grandes s6ries d'essais.
Bo]tes de Roux de 1 t. Etuves /t 37r'C. Microscope invers6. Centrifugeuse/l faible vitesse. Autres mat6riels courants de laboratoire. N.B. La pr6paration des r6actifs et l'essai proprement dit doivent ~tre r6atises dans les meilleures conditions de st6rilit~ habituelles/~ un laboratoire de microbiologie. 2.2. Mdthodoloyie
2.2.1. Entretien de la souche. II est assur6 habitueUement en bo]tes de Roux de 11. Une bo]te prt~senrant un tapis cellulaire complet contient sensiblement 5 × 10 7 cellules. Chaque boite est systhnatiquement v6rifi6e au microscope invers6 avant tout essai. II est alors proc6d6 au d6coilement et /l la dissociation du tapis cellulaire grfice au r6actif dissociant fi I'EDTA: pour ce faire, apr6s 61imination du mitieu de culture par renversement, 30ml de ce r6actif sont incorport~s par b6ite de Roux. Les bootes sont plac6ts lOmin A l'6tuve :h 37°C puis agit~s A la main le plus db,licatement possible jusqu'/~ d6collement apparent du tapis. La suspension cellulaire obtenue est aiors ¢¢ntrifugee /~ 103 tours/minute pendant 5rain /~ temp6rature du laboratoire. Le culot de centrifugation est remis en suspension dans 30ml de milieu de culture neuf; apr~s unc nouvellc centr'ffugation dans ies rndmes 2. TECHNIQUE EN TUBES conditions que pr6cedemment, les cellules sont reprises par 50 ml de milieu de culture neuf. La sus2.1. Rdactifs et materiel pension est plac6e en bo~te de Roux et incub6e/l 37:C Cellules de lign6e continue Hela fournies initialeapr6s addition de milieu neuf pour recouvrir le tapis ment par rlnstitut Pasteur de Paris, cellulaire en formation. S6rum de veau (Sorga). 2.2.2. Prdparation du tapis cellulaire pour ressai de Ampoules de 20ml de H N a C O 3 + r o u g e de cytotoxicit6. Une suspension ceilulaire titrant environ ph6nol (Institut Pasteur). 2.5 × 10s cellules mi-~ est pr6par6e scion le sch6ma Ampoules de 50 ml d'hydrolysat de cast~ine (Institut pr6c6dent fi I'exception de rultime remise en suspenPasteur). sion qui met en jeu 200ml de milieu neuf et non Milieu de culture cellulaire semi-synth~tique ~t 50 ml. l'hydrolysat de cas6ine. Cette suspension est incorpor6e /t raison de l ml dans des tubes de culture. Ces tubes, inclin6s fi enHNa CO~ + rouge de ph6nol 2 ampoules viron 20° et munis de rep6res, sont plac6s pendant Hydrolysat de cas~ine 2 ampoules 3 jours /l l'6tuve fi 37°C. L'existence de tapis ceiluS~rum de veau 100 ml laires complets sur la surface ¢xpos6e est v6rifi6¢ au P6nicilline Diamant 106 unit~s microscope invers6 pour chaqu¢ tube. Les tubes sont N/mmycine Diamant 10 mg alors pr&s pour I'essai de cytotoxicit& Eau bidistill6e qsp I1 2.2.3. Essai de cytotoxicitd proprement dit. Apr6s pH du milieu: environ 7,6 rejet du milieu de chaque tube par renversement, on R6actif de dissociation des tapis ceilulaires. introduit 0,5 ml de dilution de la substance ou du produit ii examiner dans le milieu de culture neuf. Chiorure de sodium 40g Les tubes sont alors rep|ao6s/i r6tuve ~ 37°C dans Chlorure de potassium 1g la m~me position que pr'~6demment. Phosphate disodique 12 H~O 5,75g La lecture s'effeetu¢ 7 jours plus tard au microscope Phosphate monopotassique Ig invers& L'6tat des tapis cellulaircs en fin d'essai est EDTA disodique 1,25 g appr6ci6 selon les crit&es empiriques suivants: Eau bidistiil6e qsp 51 Parachloroph6nol pur. Tubes de verre 12ram x 120mm et bouchons correspondants de caoutchouc n6opr6ne (M&liscience).
0 = tapis normal. + = tapis partieliement altt~r6. + + = tapis totalement d6truit.
Utilisation dc cultures dc cellules de lign6c Los substances ou produits ainsi test6s sont utilis6s en diff6rcntes dilutions (75, 150, 225, 300, 375, 450 et 525 #g ml-1 de milieu de culture)* /l raison de 5 tubes identiqucs par dilution. En outre, des ¢ssais t6moins sont r6alis6s syst6matiquement pour chaque s6rie d'essais et toujours en quintuple pour chaque dilution 6ventuelle: cultures cellulaires t6moins en l'absence de toxique (essai n6gati0; cultures cellulaires en pr6sence des r6actifs utilis6s lors de la pr6paration des 6chantillons A examiner, si n6cessaire (blanc); cultures cellulaires en pr6sence d'une substance chimique pure de r6f6rence/t activit6 cytotoxique, par exemple le parachloroph6nol (r6f6rence). L'utilisation d'une telle substance est indispensable pour "6talonner" la capacit6 de r6ponse du syst6me biologique dans les conditions standard choisies et corriger, si n6cessaire, ia variabilit6 de cette r6ponse ~ terme. II a en effet 6t6 remarqu6 que les cellules Hela d'un m6me lot sont significativement moins sensibles aux effets eytotoxiques en p6riode estivale. L'utilisation de l'6taIon parachloroph6nol permet done en toute circonstance de ma$triser statistiquement cette variabilit6. 2.2.4. Ddtermination statistique de la dose inhibitrice (DI 50) selon Karber. La d6termination statistique de la dose inhibitrice 50% a 6t6 faite selon la m6thode de Spearman et Karber d6crite par Finney (1951). La r6ponse de chaque culture a 6t6 quantifi6e en attribuant la valeur 0 fi un tapis normal, ½ ~ un tapis partiellement alt6r6, 1 h un tapis totalement d6truit, suivant en cela les recommandations de Finney (1952). On a d'abord calcul6 le logarithme de la D.I. 50 en exprimant les doses logarithmiquement, puis • on est revenu aux /zg ml-1 pour obtenir la D.I. 50 elle-m~.me. 3. TECHNIQUE SUR PLAQUES
3.1. Rdactifs et matdriel Cellules de iign~e continue Hela (Institut Pasteur). S~rum de veau (Sorga). Ampoules de 50 ml d'hydrolysat de cas6ine (Institut Pasteur). Solution tampon concentr6e de tris hydroxy-m6thyl amino m6thane-HCl. (Tris-HCl). Tris 15 g HCI conccntr6 5,8 ml Ph6nolsuifone phtal6ine 0,2 g Eau bidistill6¢ qsp 100 ml Milieu de culture cellulaire semi-synth6tique /~ rhydrolysat de cas6ine HydrOlysat de cas6ine 2 ampoules S~rum de veau 100 ml Solution concentr6e de Tris-HCI l0 mi P6nicilline Diamant 10°'unit6s N6omydne Diamant l0 mi Eau bidistili~e qsp ii * Par exemple, pour le p. chloroph6nol ou des extraits
de micropolluants des eaux.
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R6actif de dissociation des tapis cellulaires (cf. 2.1.). Parachloroph6nol {cf. 2.1.). Huile de vaseline pure (Touzart et Matignon). Plaques Disposo-TRAYS sp6cialement trait6es pour cultures c¢llulaires: module 96, CVTC (diam6tre des cupules 14 mm)--couverclcs en polystyr6ne moul6 mod61e 912-S (Polylabo Paul Block et Cie). BoStes de Roux de ! I. Etuve/l 37°C. Microscope invers6. Centrifugeus¢ fi faible vitesse. Autres maff:rieis courants de laboratoire.
3.2. M(thodoloyie 3.2.1. Emretien de la souche: Section 2.2.1. 3.2.2. Prdparation d'une suspension cellulaire pour ressai de cytotoxicit~. Une suspension c¢llulaire titrant environ 5 x 106 cellules mi-t est pr6par6e par reprise du 2~me culot de centrifugation obtenu en 2.2.1 dam 10ml d'hydrolysat de cas6ine tamponn~ par le Tris-HCl. 3.2.3. Essai de cytotoxicitd proprement dit. Dam chaque cupule d'une plaque, on introduit successivement: 0,5 mi de substance fi examiner, dilu6e dans' le milieu de culture tamponn~ au Tris-HCi, 005 ml de la suspension c¢llulaire pr6c6dente et, apr6s une homog6n6isation d~licate, 0,5 ml d'huile de vaseline"st6rile d6pos6e en surface. La plaque est plac6e fi i'6tuve /~ 37°C pendant 7 jours, au bout desquels la lecture s'effectue comme pr6c6demment. I1 convient de r6aliser leg essais t6moins d6ja d6crits (Section 2.2.3) et, dam tousles cas, t6moins et essais sont effectu6s en quintuple pour chaque dilution. Les r6sultats sont exprim6s comme pr6o6demment (Sections 2.2.3-2.2.4). Remarques. Le tampon Tris-HCI est pr6f6r6 au tampon HCO~-H,CO3 car il est fixe, et rhuile de vaseline 6rite r6vaporation du milieu au cours de I'essai. 3.2.4. Ddtermination statistique de la dose inhibitrice (D.I. 50). La d6termination statistique de la D.I. 50 dans le cas des essais sur plaques a 6t6 faite en suivant la m6thode d6crite (Section 2.2.4).
4. COMPARAISON DES DEUX
TECHNIQUES
4.1. M/se en oeuvre La technique sur plaques pr6sente par rapport /~ ia technique en tubes ies avantages suivants: elle s¢ prate mieux/t des essais en grandes s6ries, elle n6cessite en princip¢ un mat6riel /l usage unique qui 6vite alors tout entretien. Cependant, il est possible de r6cup6rer les plaques ayant 6t6 utilis6es moyennant un nettoyage m6ticuleux suivi d'une st6rilisation par rayonnement ultraviolet; la surface des
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tapis cellulaires form6s est mieux standardis6e; le contact cellules-toxique est plus 6troit car I'op6ration initiale met en jeu une suspension cellulaire; la lecture des r6sultats est plus commode. 4.2. Corrdlation Les deux techniques ont 6t6 compar6es au moyen d'extraits de micropolluants organiques des eaux (S.E.C.)* et de p. chloroph6nol. L'interpr6tation statistique des r6sultats obtenus "en aveugle" a montr6 qu'il existe une forte corr61ation entre les deux s6ries de mesures: r -- 0,70 (p < 0,001). Le tableau ci-dessous montre que l'activit6 des extraits en test sur plaques est bien li6e A ractivit6 de ces m6mes extraits en test sur tubes. D.I. 50 en test sur tubes
Nombre d'extraits test6s D.I. 50 moyenne en test sur plaques
4.4. Sensibilitd Les d6terminations r6p6t6es de la D.I. 50 de la substance 6talon "parachloroph6nor' (279 essais en tubes et 114 sur plaques r6v61ent une sensibilit6 sup6rieure de la m6thode en tubes (p < 0,01), le rapport de la D.I. 50 moyenne du parachloroph6nol en essais sur plaques/l sa valeur en essais en tubes ~tant de 1.17. 4.5. Choix d'une technique En d6finitive, l'6tude statistique des deux techniques montre qu'elles appr6cient le re+me ph6nom6ne: certes, la mesure en apparait moins bonne sur plaques qu'en tubes. Cependant, compte-tenu de r6norme simplification mat6rielle apport6e par la technique sur plaques notamment en fonction de la r6alisation de grandes s6ries d'essais, notre pr6f+rence va fi cette modatit6 technique.
75 il 140 156 it 265 268 it 556 10
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4.3. Pricision 4.3.1. Technique en tubes. L'analyse statistique des mesures faites sur 289 extraits a montr6 que rimpr6cision de la D.I. 50 mesur6e par la technique en tubes correspond A un facteur muttiplicatifde 2;/t titre d'exemple, une D.I. 50 mesur6,e de 200#g ml-1 correspond /t une D.I. 50 exacte comprise entre 50 et 400/~g m l - l au risque d'erreur 5%. L'ordre de grandeur de ce facteur d'impr6cision, bien qu'important, est courant pour un test d'activit6 biologique; la r6p6tition des mesures permet bien entendu de r6duire ce facteur. I1 convient de pr6ciser que la sensibilit6 des souches cellulaires varie au cours du temps; si l'on tient compte de cette source suppl6mentaire de variation des mesurcs, Ic facteur d'impr6cision devient 6gal fi 2.5. On a done, en g6n6raL int6r~t/i utiliser une substance chimique pure comme r6f6rence pour exprimer les D,I. 50 par rapport/i cette substance. 4.3.2. Technique sur plaques. L'impr6cision de la mesure de la D.L 50 par la technique sur plaques correspond/t un facteur multiplicatif de 2,3 pour des mesures fares lors du m6m¢ essa-I, de 2~9 _pour des mesures faites iors d'essais diff6rents. 4.3.3. Comparaison des prdczswns. La comparaison des pr6cisions des deux m6thodes montre que la m6thode en tubes est significativement plus pr6cise que la m6thode sur plaques. Le rapport des deux facteurs d'impr6cision n'est cependant pas tr6s important, 1,15 pour des mesures d'un m~:me essai 1,16 pour des mesures d'essais diff6rents.
* Substances extractibles par le ehloroforme.
5. APPLICATIONS-CONCLUSION
En pratique nous avons appliqu6 ces tests :~ 1'6valuation des potentialit6s bioiogiques et toxiques de moi6cules, substances, produits ou extraits pr6sentant un int6r6t darts la protection de renvironnement et de la sant6 publique. En particulier des informations toxicologiques int6ressantes ont 6t6 ol~tenues concernant des mol6cules organiques naturelles ou de synth6se d'int6r6t th6rapeutique, des mol6cules organiques, organomin&ales ou inorganiques toxiques susceptibles de contaminer le milieu du fait d'une utilisation agricole ou industrielle (pesticides. PCB . . . . ), des produits proposb,s comme additifs des eaux d'alimentation ou de Ioisirs. des extraits pr6par6s /I partir d'eaux de diff6rentes natures ou de poussieres atmosph6riques. Dam ces deux derniers cas, il s'agit d'un m61ange de substances micropolluantes pouvant avoir des effets ~i terme sur la sant6 de I'homme. extractibles par solvant organique (cbloroforme ou autre solvant) ou concentr6es par tout autre procede. S'agissant des eaux, l'application de ce test de cytotoxicit6 permet d'ajouter/t la determination ponderalc de ces concentrats et/~ leur d61icate analyse physicoch/mique, une appr6ciation des effets biologiques de l'ensemble: ainsi, par example, peut-on mieux contr61er la qualit6 des ressources en eau, 1'6volution de la qualit6 des eaux au cours des traitements d'affinage en eau alimentaire et en fonction des diff6rentes fili6res utilis6es et entreprendre des recherches sur la toxicit6 animale des micropolluants des eaux apres s61ection de lots d'activit6s diff6rentes par 6tudes m vitro. . . . . Ces possibilit6s ont 6t6 abondamment utilis6es par le Laboratoire d'Hygi6ne en assooauon avec d'autres organismes gnlce a des actions de recherches concert+es du Minist6re de la Culture el de I'Environnement. Dans le cas de rair. cet essai bioiogique permet de suivre I'+volution du degr6 de qualit6 des atmosph6res en appr6ciant I'activit+ des molecules organiques pr6sentes dans les particules atmosph6ri-
Utilization de cultures de ceilules de lign~e ques en fonction des saisons, des conditions climatiques et m~t~oroiogiques et des modifications r~glementaires. D'autres applications sont possibles darts le domaine de l'environnement. Nous associons cet essai de cytotoxicit~ "~ r~ponse giobale "~ d'autres tests r~alisables in vitro sur des bact~ries ou levures et perinerrant de diversifier et de pr~ciser les r~ponses biologiques (cytotoxicit~, inhibition de croissance, mutag~n~se, etc .... ). Cet ensemble de tests peut tr/:s utilement et assez simplement, mais moyennant certaines limites qu'il ne faut jamais perdre de rue, concourir it la prevention du risque r6suitant d'une contamination chimique croissante de notre environnement. BIBLIOGRAPHIE
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UTILISATION DE CULTURES DE CELLULES DE LIGNITE CONTINUE HELA POUR LA MISE EN EVIDENCE DE POTENTIALITIES TOXIQUES IN VITRO G. GERIN-RozEt, D. HEMON*,C. BEgOt* et B. FEsrYt (Reeu 4 Decembre 1978)
Rt~am6--La d6tection pr6ventive ou curative des potentialit6s toxiques 6ventuelles de divers produits, substances ou facteurs susceptibles de venir au contact de renvironncment ou r6suitant de sa contamination, implique en particulier de disposer de tests biologiques indicateurs aussi satisfaisants que possible pour appr6cier, dam un premier temps, un risque potentiel pour ia sant6. Data cet esprit, nous proposons et d6crivons en d6tail, arguments statistiques/t I'appui, un test biologique in vitro relativement simple et fiable utilisant des cellules Hela en culture pour d6celer des effets cytotoxiques globaux. Ce test, applicable selon deux modalit6s techniques, en tube ou sur plaque, se pr;~te /t de grandes s6ries d'essais et donne des r6ponses semi-quantitatives au plus en 7 jours` par r6fh'ence "~une substance toxique 6talon, le p. chloroph6noi, sous forme d'une dose inhibitrice 50% (D.i. 50). Ce test est couramment appliqu¢~au laboratoire, seul ou en association, "~la detection et h la mesure des effets biologiques et toxiques d'extraits de mierocontaminants des eaux et des particules atmosph6riques. Almtract--A simple andd reliable test is proposed for the detection of potentially toxic substances and described in detail. This test detects the total toxic effects of chemical or compounds on Hela cells incubated in vitro, either within tubes or over plates. This test can be carried out with large number of samples andd its results can be obtained within 7 days. Based on semi-quantitative readings, the final result of the test is expressed as an inhibitory dose (D.I. 50) and/or as a relative potency with respect to a reference toxic chemical: p. chlorophenol. This test has been routinely used, sometimes in association with other tests, to measure the toxic effects of water micropollutants and of atmospheric particles.
INTRODUCTION La recherche de potentialit6s toxiques ~ court, moyen ou long terme de divers produits, substances ou facteurs n6cessite la mis~ en oeuvre simultan6¢ ou ind6pcndante d'essais r6alis6s in vivo, in vitro ou mixtes qui sont d'int6r6t in6gal quant aux dillicult6s qu'ils impliquent et aux informations qu'ils fournisscnt. A priori, on est tent6 d'accorder davantage de cr6dit aux cssais portant sur les organismes animaux car ces derniers constituent des mod/:ies exph'imcntaux relativemerit proches de l'~.tre humain. Les exp6rimcntations animales sont limit6¢s darts leurs applications par des imp6ratifs techniques de tons ordres et souffrent, pour les essais /t long terme, d'un d61ai de r6ponse tr~s important (1-2 arts). Aussi, bicn qu'il ne faille pas oublier les diff6rences biologiques fondamentales entre organismes multicellulaires et unicellulaires, notamment quant aux processus de p6n~tration et de m6tabolisation en g6n6ral, on a essay6 depuis de nombreuses ann6es d'utiliser des syst6mes ceilulaires in * Unit6 de Recherches Statistiques de I'INSERM-16bis` Avenue Paul Vaillant Couturier, 94800, Villejuif. ? Laboratoire d'Hygi~e de la Ville de Paris, 1 bis, rue des Hospitalih'es St Gervais, 75004, Paris, et U.E.R. des Sciences Pharmaceutiques de Caen-l, rue Vaubenard, 14000, Caen.
vitro (Deysson, 1969; Thomas, Goldstein & Wilcox, 1973); ce sont des moch?:les ceilulaires simplifi6s ne mettant en jeu ClU'Un minimum de probi6mes techniques et capables de fournir darts un d61ai court des informations toxicologiques au moths indicatives (notion d'indicateur biologique exp6rimental d'exposition toxique). Ce souci de simplification exp6rimentale apparait tr6s nettement depuis queiques ann6es en ce qui concerne la d6tection des potentialit6s carcinog6nes des multiples facteurs nous environnant et il a 6t6 propos6/t cet effet d'utiliser des syst6mes procaryotes, ou eucaryotes pour d6celer des effets mutag6nes dont la probabilit6 d'association aux effets canc6rog~:nessemble tr6s 61ev6e (Ames et al., 1975; Purchase et ai., 1976; Bridges, 1976). Pour notre part, et darts un souci de protection de renvironnement et de la sant6 publique, nous proposons a p r ~ pinsieurs ann6es d'exp6rimentation au Laboratoire d'Hygi6ne (Coin et ai, 1968; Guinot & Coin, 1971) un test tr6s simple utilisam un syst6me e,cllulaire classique de ceUules de lign6e continue Hela, Celles-ci ont 6t~ choisies d 6 1 i b ~ e n t , malgr6 ieur caracth'e tramform6, en raison de leur facile adaptation i des essais syst6matiques de cytotoxicit6. De fait, une 6tude statistique approfondie a r6v616 q u e ce test permet d'6valuer en quelques jours avec une
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('. Gt!RIN-RozI! (q (t/.
pr6cision biologique satisfaisante et une bonne fiabilit6 les potentialit6s cytotoxiques de substances ou produits divers. I. PRINCIPE DU TEST P R O P O S E
L'effet biologique d'une substance pure, d'un produit complexe ou d'un extrait ~ examiner est 6valu6 par I'importance de l'effet cytotoxique qu'il exerce in vitro vis-h-vis d'une culture standardis~e de cellules de lign6e continue Hela. Cet effet est appr6cie macroscopiquement et microscopiquement en 7 jours au maximum en suivant rimportance des alterations provoqu~es et notamment de la lyse globale du tapis cellulaire; les r6sultats sont rendus semi-quantitatifs par l'utilisation en cinq exemplaires de plusieurs dilutions du produit b, examiner et I'expression d'une D.I. 50 (dose inhibitrice 50%) calcul6e selon la m6thode statistique de Spearman-Karber (Finney, 1951, 1952). Deux modalit6s techniques sont applicables seion que l'on met le facteur toxique au contact d'un tapis cellulaire complet form6 pr6alablement (technique "en tubes") ou d'une suspension cellulaire engendrant un tapis cellulaire en cours d'essai (technique "sur plaques"). Celle-ci, bien que 16g6rement moins sensible, se pr6te plus facilement fi de grandes s6ries d'essais.
Bo]tes de Roux de 1 t. Etuves /t 37r'C. Microscope invers6. Centrifugeuse/l faible vitesse. Autres mat6riels courants de laboratoire. N.B. La pr6paration des r6actifs et l'essai proprement dit doivent ~tre r6atises dans les meilleures conditions de st6rilit~ habituelles/~ un laboratoire de microbiologie. 2.2. Mdthodoloyie
2.2.1. Entretien de la souche. II est assur6 habitueUement en bo]tes de Roux de 11. Une bo]te prt~senrant un tapis cellulaire complet contient sensiblement 5 × 10 7 cellules. Chaque boite est systhnatiquement v6rifi6e au microscope invers6 avant tout essai. II est alors proc6d6 au d6coilement et /l la dissociation du tapis cellulaire grfice au r6actif dissociant fi I'EDTA: pour ce faire, apr6s 61imination du mitieu de culture par renversement, 30ml de ce r6actif sont incorport~s par b6ite de Roux. Les bootes sont plac6ts lOmin A l'6tuve :h 37°C puis agit~s A la main le plus db,licatement possible jusqu'/~ d6collement apparent du tapis. La suspension cellulaire obtenue est aiors ¢¢ntrifugee /~ 103 tours/minute pendant 5rain /~ temp6rature du laboratoire. Le culot de centrifugation est remis en suspension dans 30ml de milieu de culture neuf; apr~s unc nouvellc centr'ffugation dans ies rndmes 2. TECHNIQUE EN TUBES conditions que pr6cedemment, les cellules sont reprises par 50 ml de milieu de culture neuf. La sus2.1. Rdactifs et materiel pension est plac6e en bo~te de Roux et incub6e/l 37:C Cellules de lign6e continue Hela fournies initialeapr6s addition de milieu neuf pour recouvrir le tapis ment par rlnstitut Pasteur de Paris, cellulaire en formation. S6rum de veau (Sorga). 2.2.2. Prdparation du tapis cellulaire pour ressai de Ampoules de 20ml de H N a C O 3 + r o u g e de cytotoxicit6. Une suspension ceilulaire titrant environ ph6nol (Institut Pasteur). 2.5 × 10s cellules mi-~ est pr6par6e scion le sch6ma Ampoules de 50 ml d'hydrolysat de cast~ine (Institut pr6c6dent fi I'exception de rultime remise en suspenPasteur). sion qui met en jeu 200ml de milieu neuf et non Milieu de culture cellulaire semi-synth~tique ~t 50 ml. l'hydrolysat de cas6ine. Cette suspension est incorpor6e /t raison de l ml dans des tubes de culture. Ces tubes, inclin6s fi enHNa CO~ + rouge de ph6nol 2 ampoules viron 20° et munis de rep6res, sont plac6s pendant Hydrolysat de cas~ine 2 ampoules 3 jours /l l'6tuve fi 37°C. L'existence de tapis ceiluS~rum de veau 100 ml laires complets sur la surface ¢xpos6e est v6rifi6¢ au P6nicilline Diamant 106 unit~s microscope invers6 pour chaqu¢ tube. Les tubes sont N/mmycine Diamant 10 mg alors pr&s pour I'essai de cytotoxicit& Eau bidistill6e qsp I1 2.2.3. Essai de cytotoxicitd proprement dit. Apr6s pH du milieu: environ 7,6 rejet du milieu de chaque tube par renversement, on R6actif de dissociation des tapis ceilulaires. introduit 0,5 ml de dilution de la substance ou du produit ii examiner dans le milieu de culture neuf. Chiorure de sodium 40g Les tubes sont alors rep|ao6s/i r6tuve ~ 37°C dans Chlorure de potassium 1g la m~me position que pr'~6demment. Phosphate disodique 12 H~O 5,75g La lecture s'effeetu¢ 7 jours plus tard au microscope Phosphate monopotassique Ig invers& L'6tat des tapis cellulaircs en fin d'essai est EDTA disodique 1,25 g appr6ci6 selon les crit&es empiriques suivants: Eau bidistiil6e qsp 51 Parachloroph6nol pur. Tubes de verre 12ram x 120mm et bouchons correspondants de caoutchouc n6opr6ne (M&liscience).
0 = tapis normal. + = tapis partieliement altt~r6. + + = tapis totalement d6truit.
Utilisation dc cultures dc cellules de lign6c Los substances ou produits ainsi test6s sont utilis6s en diff6rcntes dilutions (75, 150, 225, 300, 375, 450 et 525 #g ml-1 de milieu de culture)* /l raison de 5 tubes identiqucs par dilution. En outre, des ¢ssais t6moins sont r6alis6s syst6matiquement pour chaque s6rie d'essais et toujours en quintuple pour chaque dilution 6ventuelle: cultures cellulaires t6moins en l'absence de toxique (essai n6gati0; cultures cellulaires en pr6sence des r6actifs utilis6s lors de la pr6paration des 6chantillons A examiner, si n6cessaire (blanc); cultures cellulaires en pr6sence d'une substance chimique pure de r6f6rence/t activit6 cytotoxique, par exemple le parachloroph6nol (r6f6rence). L'utilisation d'une telle substance est indispensable pour "6talonner" la capacit6 de r6ponse du syst6me biologique dans les conditions standard choisies et corriger, si n6cessaire, ia variabilit6 de cette r6ponse ~ terme. II a en effet 6t6 remarqu6 que les cellules Hela d'un m6me lot sont significativement moins sensibles aux effets eytotoxiques en p6riode estivale. L'utilisation de l'6taIon parachloroph6nol permet done en toute circonstance de ma$triser statistiquement cette variabilit6. 2.2.4. Ddtermination statistique de la dose inhibitrice (DI 50) selon Karber. La d6termination statistique de la dose inhibitrice 50% a 6t6 faite selon la m6thode de Spearman et Karber d6crite par Finney (1951). La r6ponse de chaque culture a 6t6 quantifi6e en attribuant la valeur 0 fi un tapis normal, ½ ~ un tapis partiellement alt6r6, 1 h un tapis totalement d6truit, suivant en cela les recommandations de Finney (1952). On a d'abord calcul6 le logarithme de la D.I. 50 en exprimant les doses logarithmiquement, puis • on est revenu aux /zg ml-1 pour obtenir la D.I. 50 elle-m~.me. 3. TECHNIQUE SUR PLAQUES
3.1. Rdactifs et matdriel Cellules de iign~e continue Hela (Institut Pasteur). S~rum de veau (Sorga). Ampoules de 50 ml d'hydrolysat de cas6ine (Institut Pasteur). Solution tampon concentr6e de tris hydroxy-m6thyl amino m6thane-HCl. (Tris-HCl). Tris 15 g HCI conccntr6 5,8 ml Ph6nolsuifone phtal6ine 0,2 g Eau bidistill6¢ qsp 100 ml Milieu de culture cellulaire semi-synth6tique /~ rhydrolysat de cas6ine HydrOlysat de cas6ine 2 ampoules S~rum de veau 100 ml Solution concentr6e de Tris-HCI l0 mi P6nicilline Diamant 10°'unit6s N6omydne Diamant l0 mi Eau bidistili~e qsp ii * Par exemple, pour le p. chloroph6nol ou des extraits
de micropolluants des eaux.
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R6actif de dissociation des tapis cellulaires (cf. 2.1.). Parachloroph6nol {cf. 2.1.). Huile de vaseline pure (Touzart et Matignon). Plaques Disposo-TRAYS sp6cialement trait6es pour cultures c¢llulaires: module 96, CVTC (diam6tre des cupules 14 mm)--couverclcs en polystyr6ne moul6 mod61e 912-S (Polylabo Paul Block et Cie). BoStes de Roux de ! I. Etuve/l 37°C. Microscope invers6. Centrifugeus¢ fi faible vitesse. Autres maff:rieis courants de laboratoire.
3.2. M(thodoloyie 3.2.1. Emretien de la souche: Section 2.2.1. 3.2.2. Prdparation d'une suspension cellulaire pour ressai de cytotoxicit~. Une suspension c¢llulaire titrant environ 5 x 106 cellules mi-t est pr6par6e par reprise du 2~me culot de centrifugation obtenu en 2.2.1 dam 10ml d'hydrolysat de cas6ine tamponn~ par le Tris-HCl. 3.2.3. Essai de cytotoxicitd proprement dit. Dam chaque cupule d'une plaque, on introduit successivement: 0,5 mi de substance fi examiner, dilu6e dans' le milieu de culture tamponn~ au Tris-HCi, 005 ml de la suspension c¢llulaire pr6c6dente et, apr6s une homog6n6isation d~licate, 0,5 ml d'huile de vaseline"st6rile d6pos6e en surface. La plaque est plac6e fi i'6tuve /~ 37°C pendant 7 jours, au bout desquels la lecture s'effectue comme pr6c6demment. I1 convient de r6aliser leg essais t6moins d6ja d6crits (Section 2.2.3) et, dam tousles cas, t6moins et essais sont effectu6s en quintuple pour chaque dilution. Les r6sultats sont exprim6s comme pr6o6demment (Sections 2.2.3-2.2.4). Remarques. Le tampon Tris-HCI est pr6f6r6 au tampon HCO~-H,CO3 car il est fixe, et rhuile de vaseline 6rite r6vaporation du milieu au cours de I'essai. 3.2.4. Ddtermination statistique de la dose inhibitrice (D.I. 50). La d6termination statistique de la D.I. 50 dans le cas des essais sur plaques a 6t6 faite en suivant la m6thode d6crite (Section 2.2.4).
4. COMPARAISON DES DEUX
TECHNIQUES
4.1. M/se en oeuvre La technique sur plaques pr6sente par rapport /~ ia technique en tubes ies avantages suivants: elle s¢ prate mieux/t des essais en grandes s6ries, elle n6cessite en princip¢ un mat6riel /l usage unique qui 6vite alors tout entretien. Cependant, il est possible de r6cup6rer les plaques ayant 6t6 utilis6es moyennant un nettoyage m6ticuleux suivi d'une st6rilisation par rayonnement ultraviolet; la surface des
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tapis cellulaires form6s est mieux standardis6e; le contact cellules-toxique est plus 6troit car I'op6ration initiale met en jeu une suspension cellulaire; la lecture des r6sultats est plus commode. 4.2. Corrdlation Les deux techniques ont 6t6 compar6es au moyen d'extraits de micropolluants organiques des eaux (S.E.C.)* et de p. chloroph6nol. L'interpr6tation statistique des r6sultats obtenus "en aveugle" a montr6 qu'il existe une forte corr61ation entre les deux s6ries de mesures: r -- 0,70 (p < 0,001). Le tableau ci-dessous montre que l'activit6 des extraits en test sur plaques est bien li6e A ractivit6 de ces m6mes extraits en test sur tubes. D.I. 50 en test sur tubes
Nombre d'extraits test6s D.I. 50 moyenne en test sur plaques
4.4. Sensibilitd Les d6terminations r6p6t6es de la D.I. 50 de la substance 6talon "parachloroph6nor' (279 essais en tubes et 114 sur plaques r6v61ent une sensibilit6 sup6rieure de la m6thode en tubes (p < 0,01), le rapport de la D.I. 50 moyenne du parachloroph6nol en essais sur plaques/l sa valeur en essais en tubes ~tant de 1.17. 4.5. Choix d'une technique En d6finitive, l'6tude statistique des deux techniques montre qu'elles appr6cient le re+me ph6nom6ne: certes, la mesure en apparait moins bonne sur plaques qu'en tubes. Cependant, compte-tenu de r6norme simplification mat6rielle apport6e par la technique sur plaques notamment en fonction de la r6alisation de grandes s6ries d'essais, notre pr6f+rence va fi cette modatit6 technique.
75 il 140 156 it 265 268 it 556 10
10
10
168
240
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4.3. Pricision 4.3.1. Technique en tubes. L'analyse statistique des mesures faites sur 289 extraits a montr6 que rimpr6cision de la D.I. 50 mesur6e par la technique en tubes correspond A un facteur muttiplicatifde 2;/t titre d'exemple, une D.I. 50 mesur6,e de 200#g ml-1 correspond /t une D.I. 50 exacte comprise entre 50 et 400/~g m l - l au risque d'erreur 5%. L'ordre de grandeur de ce facteur d'impr6cision, bien qu'important, est courant pour un test d'activit6 biologique; la r6p6tition des mesures permet bien entendu de r6duire ce facteur. I1 convient de pr6ciser que la sensibilit6 des souches cellulaires varie au cours du temps; si l'on tient compte de cette source suppl6mentaire de variation des mesurcs, Ic facteur d'impr6cision devient 6gal fi 2.5. On a done, en g6n6raL int6r~t/i utiliser une substance chimique pure comme r6f6rence pour exprimer les D,I. 50 par rapport/i cette substance. 4.3.2. Technique sur plaques. L'impr6cision de la mesure de la D.L 50 par la technique sur plaques correspond/t un facteur multiplicatif de 2,3 pour des mesures fares lors du m6m¢ essa-I, de 2~9 _pour des mesures faites iors d'essais diff6rents. 4.3.3. Comparaison des prdczswns. La comparaison des pr6cisions des deux m6thodes montre que la m6thode en tubes est significativement plus pr6cise que la m6thode sur plaques. Le rapport des deux facteurs d'impr6cision n'est cependant pas tr6s important, 1,15 pour des mesures d'un m~:me essai 1,16 pour des mesures d'essais diff6rents.
* Substances extractibles par le ehloroforme.
5. APPLICATIONS-CONCLUSION
En pratique nous avons appliqu6 ces tests :~ 1'6valuation des potentialit6s bioiogiques et toxiques de moi6cules, substances, produits ou extraits pr6sentant un int6r6t darts la protection de renvironnement et de la sant6 publique. En particulier des informations toxicologiques int6ressantes ont 6t6 ol~tenues concernant des mol6cules organiques naturelles ou de synth6se d'int6r6t th6rapeutique, des mol6cules organiques, organomin&ales ou inorganiques toxiques susceptibles de contaminer le milieu du fait d'une utilisation agricole ou industrielle (pesticides. PCB . . . . ), des produits proposb,s comme additifs des eaux d'alimentation ou de Ioisirs. des extraits pr6par6s /I partir d'eaux de diff6rentes natures ou de poussieres atmosph6riques. Dam ces deux derniers cas, il s'agit d'un m61ange de substances micropolluantes pouvant avoir des effets ~i terme sur la sant6 de I'homme. extractibles par solvant organique (cbloroforme ou autre solvant) ou concentr6es par tout autre procede. S'agissant des eaux, l'application de ce test de cytotoxicit6 permet d'ajouter/t la determination ponderalc de ces concentrats et/~ leur d61icate analyse physicoch/mique, une appr6ciation des effets biologiques de l'ensemble: ainsi, par example, peut-on mieux contr61er la qualit6 des ressources en eau, 1'6volution de la qualit6 des eaux au cours des traitements d'affinage en eau alimentaire et en fonction des diff6rentes fili6res utilis6es et entreprendre des recherches sur la toxicit6 animale des micropolluants des eaux apres s61ection de lots d'activit6s diff6rentes par 6tudes m vitro. . . . . Ces possibilit6s ont 6t6 abondamment utilis6es par le Laboratoire d'Hygi6ne en assooauon avec d'autres organismes gnlce a des actions de recherches concert+es du Minist6re de la Culture el de I'Environnement. Dans le cas de rair. cet essai bioiogique permet de suivre I'+volution du degr6 de qualit6 des atmosph6res en appr6ciant I'activit+ des molecules organiques pr6sentes dans les particules atmosph6ri-
Utilization de cultures de ceilules de lign~e ques en fonction des saisons, des conditions climatiques et m~t~oroiogiques et des modifications r~glementaires. D'autres applications sont possibles darts le domaine de l'environnement. Nous associons cet essai de cytotoxicit~ "~ r~ponse giobale "~ d'autres tests r~alisables in vitro sur des bact~ries ou levures et perinerrant de diversifier et de pr~ciser les r~ponses biologiques (cytotoxicit~, inhibition de croissance, mutag~n~se, etc .... ). Cet ensemble de tests peut tr/:s utilement et assez simplement, mais moyennant certaines limites qu'il ne faut jamais perdre de rue, concourir it la prevention du risque r6suitant d'une contamination chimique croissante de notre environnement. BIBLIOGRAPHIE
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