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Utilisation des dextranes modifiés pour le fractionnement du venin de cobra
a41
NOTES
CNROM.
Utilisation
des dextranes
modifi&
pour le fractionnement
du venin de cobra
Les celluloses modifies ainsi que les gels moleculaires ont permis ccs dernieres de nombreuses nouvelles recherches dans le domaine des venins de serpents. 11now a semblr5 interessant d’&udier d’une maniere systematique les possibilites de separation offertes par les dextranes modifies recemment commercialis&* pour le fractionnement du venin de Naja rmja atra sur lequel nous travaillons plus particuli&rementl. Ces supports clironiatograpl~iques n’ont Bt6 clue peu utilises jusqu’a present pour le fractionnement des venins de serpents-0-s et B notre connaissance seuls VICK et ~011.0ont fractionne le venin de cobra par cette technique (CM-Sephadex) dans le but d’en isoler les fractions toxiques. Les donrkes bibliographiques7 ainsi que les etudes 6lectropboretiques realisees prQc&.demment ‘clans notre laboratoin+ montrent que la majorite des constituants du venin de Naja naja atra se comportent comme des proteines basiques et nous nous sommes de ce fait principalement attach& A l’etude du fractionnement de ce venin sur des supports de type cationique: CM-Sephadex et SE-Sephadex. Les essais d’orientation ont et6 effectues sur des quantites de venin de l’ordre de 30 mg au moyen de microcolonnes de 0.7 x 30 cm. Les gradients de concentration et de PI-I ont 6te obtenus au moyen d’un appareil & deux chambres du type de celui dkrit par HENRY et ~011”. an&es,
T
A
%
1 %
40.
40.
60-
60-
60-
80.
100 T %
100 0
300
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ml
loo-’ T %
C
0 ,
40-
40-
60.
60-
100
200
360
ml
0
Fig. I. l&de comparative sur microcolonne (cliam&tre: 0.7 cm, hnutcur: 25 cm) des diffdrents dextranes modifiies. (A) CM-Scphades C 25. fichantillou : 30 rug venin. Graclicnt lint&ire : o --t 0.5 M A ~5. &hantillon : 30 mg venin. NaCI. Tampon: pl?I 6.0 (P0.t3-, 0.05 M). (B) DEAE-Scphaclex Gradient lindaire: o + 0.5 M NaCl. Tampon: pE1 8.0 (Tris-I-Xl, 0.05 M). (C) SE-Sephadex C “-5. fichantillon : 30 rng venin. Gradient 1inBaire : o + 0.5 II4 NaCl. Tampon: pItI 6.0 (l.0,3-, 0.05 M). (D) SE-Sephadex C 50. @hantillon : 30 mg venin. Gradient lindaire: o -> 0.9 F NaCl. Tampon: pW 60 (P0,,3-, 0.05 M).
* Pharmacia,
Uppsala,
Suede. J. ChlOorna~og.,36 (1968)
2411~24.3,
242
NOTES (a)
_ ._. T,1:i’l
100
3
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11
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3
4
. _ _ ...
Point
d’application
Fig. 2. (a) I?ractionnement du venin de Naju. uaja a&a sur SE-Scphadcx C 25. Colonne: diambtre, 1.5 cm ; hauteur: 40 cm. lkhantillon: 500 mg venin lyophilis6. D&it: 0.5 ml/min (pompe ptkistaltique). Gradient lindaire : NaCl, o+ 0.6 M. Tampon : 6.0 (PO,“-. 0.05 M). (b) Electrophor&se en disque (gel cl’acrylamiclc). (A) gel B 7.5 y0 de monom&re, PI-I S.g; (B) gel & 15 y. de monom&re, pH 4,3.
Le debit de la colonne est r&l& par une pomp& pkristaltique; il varie pcrur les microcolonnes entre 0.1: et 0.3 ml/min. L’hluat est analysh directemcnt B la sortie de la colonne par passage dans une unit6 optique type Uvicord II (280 111~) qui permet l’enregistrement en continu de la courbe d’htion. De la s&ie d’essais d’orientation effectuh sur microcolonnes (Fig. I), il rhulte clue : (a) Comme p&vu les khangeurs cationiques (CM et SE) donnent de meilleurs rhultats que les anioniques (DEAE). Le CM-Sephadex fractionne mieus les protbines les moins basiques (oh l’on retrouve principalement les enzymes) tandis que le SESephadex donne une r&solution supkieure des substances plus basiques (principalenient protdines et peptides ne prhsentant aucune cles activitth enzymatiques classiques du venin de cobra), (b) Toutes les autres conditions &ant &gales, la rhsolution est meilleure avec les gels Bchangeurs type C ‘25 (forte rkticulation) qu’avec les C 50 (faible r&iculation) ce qui peut s’expliquer par le fait que la majorit des cohstituants du venin sont des substances h faible poids molhulaire. (6) Un gradient de concentration s’est av&4 plus efficace qu’un gradient de PH. Sur base des rksultats obtenus au moyen de ces microcolonnes analytiques nous awns tent6 l’extrapolation & des colonnes preparatives, Dans ce but nous avons soumis J.
ChO?FZatO~.,
36 (1968)
241-243
243
NOTES
500 mg de venin de cobra formosan (Baja rtaja a&a) A la chromatographie sur SESephadex C 25 sur une colonne de 1.5 cm de diametre et 40 cm de haut, dans les conditions qui nous avaient pr&Ademment fourni la meilleure resolution. Le fractionnement obtenu est illustre a la Fig. 2; il nous a permis d’obtenir 14 fractions distinctes ; l’analyse Blectrophoretique en gel d’acrylamide de chaque fraction permet de se faire une idbe de leur degre de complexite. Nous nous pruposons, dans un prochain travail, d’etudier du point de vue chimique, physicochimique et enzymatique, la composition des fractions obtenues par Certaines activites biologiques de ces la technique que nous venons de d&rim. fractions seront egalement prises en consideration. La methode nous semble prksenter des possibilites intkessantes et ouvrir de nouvelles voies d’investigation dans le domaine des venins de cobra. Nous tenons a voulu se charger des Province de Brabant qu’elles ont accordde
exprimer nos remerciements a Madame KEPPENS qui a bien analyses electrophoretiques des fractions. Nous remercions la et la F. W. Breth Foundation pour l’aide morale et financier-e a ce travail,
I+astitzct des I~adzcstries de Fermentation, Imtitact Mewice Chimie, Service de Biochimie, Ida, rue Simortis, BruxelLes 5, (Belgiqzce)
J- SLEGERS J. SIMON
L. BRISBOIS
J.PEETERS L. GILLO
GILLO, Ann. Sot. Roy. Sci. Med. Nat. Bruxelles, rg (Ig66) 12~. W. VOGT EC G. SCHMIDT, Expevie&a, 20 (1964) 207. S.,'JXE;VRASWIGE, Y. HARA, M. EAM'AIiAMI ET S. MITSUHASHI, ~apa?Z J. n~icrobio!., IO (1966)23. 11.C. CHEN ET C. OUYANG, Toxico~z, 4 (1967) 235. L. GROTTO, C. MOROZ, A. DEVRIES ET N. GOLDBLUM, Biocirim.Bio$i&ys. Acta, 133 (1967) 356. J. A.VICII, A. P.CIUCHTA,C. BRoonmELD BTB. T. CURRIE, Toxicop, 3 (x966)237. E.M. BERTICE, D.D. WATT m!T.Tu, Toxicoti, 4 (1966) 73. I?.DELORI ET L. GILLO, J. Ckromatog.,34 (1968)531. R. HENRY, G. WIRIOT ET LE BALC'H, Bzcll.Sot.Clrinz.BioZ., 47 (1965) 503.
I L. 2
Recu le 5 avril 1968 J. C?~~omatOg., 36 (rg68) 24I-243
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CNROM.
Utilisation
des dextranes
modifi&
pour le fractionnement
du venin de cobra
Les celluloses modifies ainsi que les gels moleculaires ont permis ccs dernieres de nombreuses nouvelles recherches dans le domaine des venins de serpents. 11now a semblr5 interessant d’&udier d’une maniere systematique les possibilites de separation offertes par les dextranes modifies recemment commercialis&* pour le fractionnement du venin de Naja rmja atra sur lequel nous travaillons plus particuli&rementl. Ces supports clironiatograpl~iques n’ont Bt6 clue peu utilises jusqu’a present pour le fractionnement des venins de serpents-0-s et B notre connaissance seuls VICK et ~011.0ont fractionne le venin de cobra par cette technique (CM-Sephadex) dans le but d’en isoler les fractions toxiques. Les donrkes bibliographiques7 ainsi que les etudes 6lectropboretiques realisees prQc&.demment ‘clans notre laboratoin+ montrent que la majorite des constituants du venin de Naja naja atra se comportent comme des proteines basiques et nous nous sommes de ce fait principalement attach& A l’etude du fractionnement de ce venin sur des supports de type cationique: CM-Sephadex et SE-Sephadex. Les essais d’orientation ont et6 effectues sur des quantites de venin de l’ordre de 30 mg au moyen de microcolonnes de 0.7 x 30 cm. Les gradients de concentration et de PI-I ont 6te obtenus au moyen d’un appareil & deux chambres du type de celui dkrit par HENRY et ~011”. an&es,
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Fig. I. l&de comparative sur microcolonne (cliam&tre: 0.7 cm, hnutcur: 25 cm) des diffdrents dextranes modifiies. (A) CM-Scphades C 25. fichantillou : 30 rug venin. Graclicnt lint&ire : o --t 0.5 M A ~5. &hantillon : 30 mg venin. NaCI. Tampon: pl?I 6.0 (P0.t3-, 0.05 M). (B) DEAE-Scphaclex Gradient lindaire: o + 0.5 M NaCl. Tampon: pE1 8.0 (Tris-I-Xl, 0.05 M). (C) SE-Sephadex C “-5. fichantillon : 30 rng venin. Gradient 1inBaire : o + 0.5 II4 NaCl. Tampon: pItI 6.0 (l.0,3-, 0.05 M). (D) SE-Sephadex C 50. @hantillon : 30 mg venin. Gradient lindaire: o -> 0.9 F NaCl. Tampon: pW 60 (P0,,3-, 0.05 M).
* Pharmacia,
Uppsala,
Suede. J. ChlOorna~og.,36 (1968)
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Fig. 2. (a) I?ractionnement du venin de Naju. uaja a&a sur SE-Scphadcx C 25. Colonne: diambtre, 1.5 cm ; hauteur: 40 cm. lkhantillon: 500 mg venin lyophilis6. D&it: 0.5 ml/min (pompe ptkistaltique). Gradient lindaire : NaCl, o+ 0.6 M. Tampon : 6.0 (PO,“-. 0.05 M). (b) Electrophor&se en disque (gel cl’acrylamiclc). (A) gel B 7.5 y0 de monom&re, PI-I S.g; (B) gel & 15 y. de monom&re, pH 4,3.
Le debit de la colonne est r&l& par une pomp& pkristaltique; il varie pcrur les microcolonnes entre 0.1: et 0.3 ml/min. L’hluat est analysh directemcnt B la sortie de la colonne par passage dans une unit6 optique type Uvicord II (280 111~) qui permet l’enregistrement en continu de la courbe d’htion. De la s&ie d’essais d’orientation effectuh sur microcolonnes (Fig. I), il rhulte clue : (a) Comme p&vu les khangeurs cationiques (CM et SE) donnent de meilleurs rhultats que les anioniques (DEAE). Le CM-Sephadex fractionne mieus les protbines les moins basiques (oh l’on retrouve principalement les enzymes) tandis que le SESephadex donne une r&solution supkieure des substances plus basiques (principalenient protdines et peptides ne prhsentant aucune cles activitth enzymatiques classiques du venin de cobra), (b) Toutes les autres conditions &ant &gales, la rhsolution est meilleure avec les gels Bchangeurs type C ‘25 (forte rkticulation) qu’avec les C 50 (faible r&iculation) ce qui peut s’expliquer par le fait que la majorit des cohstituants du venin sont des substances h faible poids molhulaire. (6) Un gradient de concentration s’est av&4 plus efficace qu’un gradient de PH. Sur base des rksultats obtenus au moyen de ces microcolonnes analytiques nous awns tent6 l’extrapolation & des colonnes preparatives, Dans ce but nous avons soumis J.
ChO?FZatO~.,
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NOTES
500 mg de venin de cobra formosan (Baja rtaja a&a) A la chromatographie sur SESephadex C 25 sur une colonne de 1.5 cm de diametre et 40 cm de haut, dans les conditions qui nous avaient pr&Ademment fourni la meilleure resolution. Le fractionnement obtenu est illustre a la Fig. 2; il nous a permis d’obtenir 14 fractions distinctes ; l’analyse Blectrophoretique en gel d’acrylamide de chaque fraction permet de se faire une idbe de leur degre de complexite. Nous nous pruposons, dans un prochain travail, d’etudier du point de vue chimique, physicochimique et enzymatique, la composition des fractions obtenues par Certaines activites biologiques de ces la technique que nous venons de d&rim. fractions seront egalement prises en consideration. La methode nous semble prksenter des possibilites intkessantes et ouvrir de nouvelles voies d’investigation dans le domaine des venins de cobra. Nous tenons a voulu se charger des Province de Brabant qu’elles ont accordde
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I+astitzct des I~adzcstries de Fermentation, Imtitact Mewice Chimie, Service de Biochimie, Ida, rue Simortis, BruxelLes 5, (Belgiqzce)
J- SLEGERS J. SIMON
L. BRISBOIS
J.PEETERS L. GILLO
GILLO, Ann. Sot. Roy. Sci. Med. Nat. Bruxelles, rg (Ig66) 12~. W. VOGT EC G. SCHMIDT, Expevie&a, 20 (1964) 207. S.,'JXE;VRASWIGE, Y. HARA, M. EAM'AIiAMI ET S. MITSUHASHI, ~apa?Z J. n~icrobio!., IO (1966)23. 11.C. CHEN ET C. OUYANG, Toxico~z, 4 (1967) 235. L. GROTTO, C. MOROZ, A. DEVRIES ET N. GOLDBLUM, Biocirim.Bio$i&ys. Acta, 133 (1967) 356. J. A.VICII, A. P.CIUCHTA,C. BRoonmELD BTB. T. CURRIE, Toxicop, 3 (x966)237. E.M. BERTICE, D.D. WATT m!T.Tu, Toxicoti, 4 (1966) 73. I?.DELORI ET L. GILLO, J. Ckromatog.,34 (1968)531. R. HENRY, G. WIRIOT ET LE BALC'H, Bzcll.Sot.Clrinz.BioZ., 47 (1965) 503.
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