Variations des phospholipides au cours de la métamorphose de Tribolium confusum (Coléoptère)

J. Insect Physiol., 1968, Vol. 14, pp. 831 to 840. Pergamon Press. Printed in Great Britain

VARIATIONS DES PHOSPHOLIPIDES AU COURS DE LA MJ?TAMORPHOSE DE TRIBOLIUM CONFUSUM (COLfiOPTfiRE) A. R. BEAUDOIN,

J.-L.

VILLENEUVE,

et A. LEMONDE

Departement de Biochimie, FacultC de Medecine, Universite Lava& Quebec (Received

18 December 1967)

Abstract-The changing phospholipid pattern of the last instar larva and during metamorphosis has been studied by a new method. After extraction by the usual method of FOLCH et al. (1957), the total lipids were separated into polar and neutral fractions by a fixation technique on silicic acid. The phospholipids were subfractionated into classes and quantities estimated by thin-layer chromatography. Phosphatidylchohne and phosphatidylethanolamine were the major constituents. Sphingomyelin was found in relatively high concentration but other constituents identified were lysophosphatidylcholine, lysophosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, and cardiolipin. A relationship was found between this last group of compounds and oxygen consumption. The major changes were noted at the time of pupation and adult emergence. At the beginning of pupal period, a considerable amount of phosphatidylcholine is transformed into lysophosphatidylcholine. Reacylation of lysophosphatidylcholine to form phosphatidylcholine is suggested for the first time in an insect. There is a probability of phosphatide transfer between serine and phosphatidylethanolamine on adult emergence. The significance of these variations is discussed. INTRODUCTION

L’J~TUDEdes lipides chez les insectes suscite depuis la dernikre decade un inter&t toujours croissant. Cependant, peu de travaux ont CtC consacres aux phospholipides et, de ce fait, nos connaissances sont fragmentaires et superficielles. Les revues de GILBY (1965), SRIDHARA(1966) et GILBERT (1967) ont signale et comment& les travaux les plus importants concernant les phospholipides des insectes; quoique semblables a ceux des mammiferes du point de vue qualitatif, ils en different considerablement du point de vue quantitatif. Les etudes traitant des variations de ces lipides au tours du developpement de l’insecte sont tres fructueuses puisqu’elles permettent d’assigner a tel phospholipide une fonction donnee. Ainsi ALLAIS et al. (1964) relient-ils les lecithines au phenomtne de blastocynkse chez le criquet Locustu migratoria. CRONE (1964) suggere I’existence d’une correlation entre le contenu en ctphalines et l’activid respiratoire chez Musca domestica. KINSELLA (1966) soutient la mCme hypothbe a la suite des resultats qu’il a obtenus chez Penplaneta americana. 831

832

A. R. BEAUDOIN, J.-L. VILLJZNEUVE, ET A. LEMONDE

Chez Tribolium confusum, VILLENEUVEet LEMONDE(1963) ont not6 une accumulation graisseuse au tours de la periode larvaire, suivie d’une utilisation de cette Cnergie de reserve durant le stade du pupe. CHAUDHARY et LEMONDE(1963) ont mesure les variations du phosphore lipidique au tours du cycle vital de T. confusum. Pour completer cette etude et afin de preciser le role que peuvent jouer les phospholipides chez les coleopdres, nous presentons l’etude des variations de ces lipides pendant la derniere partie du stade larvaire, le stade pupe et le debut de la vie adulte de T. confusum. Ces divisions du cycle vital de T. confusum sont basees sur la mue (ecdysis) et non sur l’apolysis (JENKIN et HINTON, 1966). MATeFUEL

ET MBTHODES

Insectes Les insectes utilises au tours de ce travail provenaient de cultures conservees dans Les conditions un incubateur maintenu a 28 + 1°C et a 70 + 5% d’humidite relative. d’elevage ont CtC d&rites precedemment (CHAUDHARYet LEMONDE, 1962). Extraction des lipides Nous extrayons les lipides totaux par la methode de FOLCH et aZ. (1957). Nous homogeneisons environ 2000 insectes au Virtis en utilisant 20 ml de solvant/g de poids frais. Aprb lavage avec une solution de NaCl 0,9%, la phase inferieure est Cvaporee sous vide et s&h&e en presence de CaCl,. Se’paration des lipides polaires et des lipides non-polaires Nous inspirant des principes de la chromatographie sur colonne d’acide silicique, nous separons ces deux groupes de lipides selon le processus suivant. Nous dissolvons l’extrait total dans Y&her de petrole (200 ml/g de lipides totaux) et nous ajoutons de l’acide silicique (Mallinckrodt 100 mesh) active au prealable a 150°C durant 1 h (8 g/g de lipides totaux). Le melange est agite mecaniquement selon un mouvement rotatif durant 10 min puis nous filtrons sur verre frite aprb avoir laisse deposer l’acide silicique au fond du ballon. Nous repetons cette operation a deux reprises en nous servant de l’ether biethylique, ce qui complete l’elution des lipides non-polaires. Nous Cluons ensuite les phospholipides par trois lavages au methanol. Cette methode permet de &parer quantitativement chacune des deux fractions lipidiques. L’absence de phospholipides dans la fraction des lipides non-polaires a CtC confirm&e par le reactif de DITTMERet LESTER (1964) vaporise sur couche mince en presence d’echantillons tres concentres. Nous retrouvons dans la fraction des phospholipides environ 3 pour cent de lipides polaires de nature sdroidienne. Chromatographie sur couche mince Nous utilisons le silica gel H (Desaga) que nous etalons en couches de 0,5 mm. Les plaques sont activees et developpees selon la methode de ROUSERet al. (1964). Nous avons en premier lieu identifie les composants au moyen des reactifs specifiques proposes par MANGOLD(1961) et Cgalement par cochromatographie avec

LES PHOSPHOLIPIDES

833

AU COURS DE LA MkTAMORPHOSE

des standards. Le reactif de FLEURY et al. (1953) nous a permis de verifier I’absence des phosphatidylinositols (ce test a Ctt effect& sur papier filtre). Pour les mesures quantitatives, nous avons rCvClCles taches sur les chromatogrammes avec des vapeurs d’iode et les phospholipides etaient Cl& selon la methode de SEMINARIO et al. (1965). Minbalisation

et dosage du phosphore

Apres evaporation de l’eluat, nous ajoutons 0,9 ml d’acide perchlorique (70%). La mineralisation s’effectue d’abord B 100°C pendant 5 min et nous Clevons la temperature pour obtenir une ebullition constante de 15 min. Nous combinons cette technique de mineralisation a la methode de dosage colorimetrique de SHIN (1962). L a coloration produite est mesuree a 830 rnp au spectrophotometre Beckman DU. Dans ces conditions, la loi de Beer est suivie pour des quantites de l’ordre de l-12 pg de phosphore. Pour chacun des chromatogrammes Ctudies, nous avons dose le phosphore d’un ichantillon de silica *gel. Nous n’en avons dCcelC que des traces. Nous avions d’ailleurs choisi ce silica gel en raison de sa faible teneur en phosphore.

16.0 .I e

12

14 LARVL

I6

2

4

6

Age

en

2

4

6

ADULTE

PUPE jOUrs

A), des lipides neutres (0 -0) FIG. 1. Variations des lipides totaux ( Aet 0) au tours de la mktamorphose de T. confusum. des phospholipides (O-

834

A. R. BEAUDOIN,J.-L. VILLENEWE, ET A. LEMONDE

Nous estimons taches mesurables,

le phosphore lipidique laisse sur la plaque apres enlevement a environ 1 pour cent du phosphore lipidique total.

des

Rl?SULTATS

La Fig. 1 illustre les variations des lipides totaux, des lipides neutres et des phospholipides. Du on&me jour de la vie larvaire jusqu’a la transformation en pupe, les lipides totaux augmentent de 15,l a 19,6 pour cent du poids frais. Au tours de la m&me periode, les phospholipides diminuent de 2,6 a 2,l pour cent du poids frais. Lors du passage de la prepupe a la pupe, l’organisme utilise 31 pour cent des phospholipides qui passent de 2,lO a 1,45 pour cent du poids frais. Les lipides neutres diminuent de 0,75 pour cent du poids frais, ce qui se traduit par une baisse globale de 7,2 pour cent des lipides totaux. Les phospholipides se maintiennent pendant le stade pupe B un niveau constant soit environ 1,45 pour cent du poids frais. 11s augmentent legtrement a la mue imaginale et au debut de stade adulte. Les lipides neutres montrent une baisse de 4,0 pour cent du poids frais durant la m&me periode. C’est chez l’adulte de 4-5 jours que l’on trouve le plus faible pourcentage de lipides totaux soit 14,7 pour cent du poids frais. Le Tableau 1 montre la repartition du phosphore pour chacun des phospholipides. Nous donnons la valeur en pourcentage du phosphore total mesure et nous ajoutons entre parentheses la valeur en pourcentage des phospholipides totaux. Le poids des phospholipides est obtenu a partir du phosphore en multipliant par les facteurs de conversion suivants que nous avons Ctablis en utilisant les donnees de FAST (1966) sur la composition des phospholipides des coleopteres: Phosphatidylcholines, sphingomyklines, cardiolipides PhosphatidylsCrines Phosphatidylkhanolamines Lysophosphatidylcholines

La Fig. 2 nous permet de visualiser par rapport au poids frais de l’insecte. Les phosphatidylethanolamines et les phospholipides de la larve et de la pupe total). Chez l’adulte, ils representent 70

les variations

de chacun

25,0 26,0 23,s 16,0

de ces groupes

phosphatidylcholines sont les principaux (80-90 pour cent du phosphore lipidique pour cent du phosphore lipidique total.

Phospholipides choliniques Nous observons du onzieme au quinzieme jour une degradation marqute des phosphatidylcholines qui passent de 1,39 a 0,95 g/100 g de poids frais soit une diminution de 3,2 pour cent. A la fin du stade larvaire, les phosphatidylcholines augmentent legerement et, au moment de la transformation en pupe, nous notons une nouvelle chute de 1,06 a 0,60 g/100 g de poids frais. Au tours du stade larvaire et du stade pupe, la teneur en lysophosphatidylcholines est faible. Des quantites notables de ces composes apparaissent a la

Adulte

637 (455) 2,6 (197) 1s (190) 124 (-_)t 1,s (1,O) 193 (-)t 696 (4,4) 638 (435)

39,3 (41,3) 4-%0 (45,s) 4380 W,8) 41,9 (43,6) 40~7 (42~) 39,O (40,7)

35,0 (36,4) 35,8 (37,s)

;-;;

-c-H I,0 (-) t - (-_)t

I

(53,4) (4599) (4486) (43,4) (50,6)

52,9 44,6 43,s 42,2 49,6

Lysophosphatidylcholines

8,7 (990) 10,3 (10,8)

$9 (692) 597 (599) 5,7 (5,9) 7,2 (7s) 8,O (%3) 8,2 (8,6)

5,4 (5s) $3 (6,s) 622 (634) 5,3 (5,4) 5,1 (5,2)

Sphingomyelines

(37,3) (41,2) (41 ,l) (41,l) (36,2)

36,4 (35,s) 35,3 (34,7)

40,9 W4) 42,s (41,3) 4538 (4439) 46,O (4590) 47,1 (45,8) 48,2 (47,3)

37,0 42,4 42,6 42,6 37,7

PhosphatidylCthanolamines

en %)

B i

-wt 1,O GPO) 2,l (2,2) 7,3 (797)

10,2 (11,O) 3,s (3,8)

E

I

0

g

iii 1,O (1SO) 1,O (1 SO) 130 (1SO) 3,2 (3,4) 2,O (292) 1,s (1,6) l,l (132) 1,3 (1,4)

f

g

5

F ii ii B

190(l,O)

191 (1J) 395 (336) 5,1 (5,2) 2,6 (2,7) 190 (1,O)

Cardiolipides

z D g

c

51 (5,6)

198 (1,9) 1s US) 1,3 (194) 5,3 (5,7) 5,6 (539)

Phosphatidylserines

du phosphore lipidique total (poids relatif des phospholipides

l Nous Cvaluons B 1 O/ela quantite de phosphore lipidique laissee sur la plaque. t Les valeurs infkieures g l,O% sont omises du tableau.

O-l 4-5

fipe

12-13 13-14 1415 15-16

1112

Age

O-l l-2 2-3 3-4 4-5 5-6

Larve

Stade

Phosphatidylcholines

%

TABLEAU I-VARIATIONS DFS POURCRNTAGRSDU PHOSPHORE LIPIDIQUE* ET DES PHOSPHOLIPIDES CORRRSPONDANTSAU COURS DE LA h&TAhlORPHOSE DE T. C@?lfUSU?Tl

836

A. R. BEAUDOIN,J.-L. VILLJXNEUVE, ET A. LEMONDE

1.40

PC

M

PEA

M

S

-

lyso

PC

-

PS

M

CAR

D-----Q

I,10

.n

I

,oo

z!

LANE

PUPE I

Age

en

jours

I

ADULTE

FIG. 2. Variations des difftkents phospholipides au tours de la mt%amorphose de T. cmfumm. (PC: phosphatidylcholme; PEA: phosphatidylCthanolamine; S : sphingomykline ; lyso PC : lysophosphatidylcholine ; PS : phosphatidyls&ine ; CAR: cardiolipide).

pupaison et a l’emergence imaginale (65 et 58 mg/lOO g de poids frais). Ces augmentations correspondent respectivement a 6,6 et 5,3 pour cent du phosphore lipidique total. Nous remarquons Cgalement que du premier au deuxieme jour du stade pupe, le pourcentage du phosphore iipidique des lysophosphatidylcholine9 diminue de 4,l pour cent alors que celui des phosphatidylcholines augmente de 4,7 pour cent.

IRS PHOSPHOLIPIDES AUCOURS DELAMBTAMORPHOSE

837

La teneur en sphingomyelines est maximale chez la larve de 12-13 jours (155 mg/lOO g de poids frais) et chez l’adulte de 4-5 jours (200 mg/lOO g de poids frais). Elle est a son plus bas niveau chez la pupe de 2-3 jours (84 mg/lOO g de poids frais). Le phosphore des sphingomyelines s’eleve jusqu’a 10,3 pour cent du phosphore lipidique total chez l’adulte de 4-5 jours. Phospholipides amint%

Les phosphatidylethanolamines decroissent continueliement du trek&me jour de la vie larvaire jusqu’a la formation de la pupe (de 0,985 a 0,585 g/100 g de poids frais). Ceci represente une baisse relative de 40 pour cent de la quantite initiale. Au stade pupe, les phosphatidylethanolamines augmentent de 100 mg/lOO g de poids frais et, h la fin de ce stade, le phosphore de cette fraction constitue 48,2 pour cent du phosphore lipidique total. A l’emergence ad&e, elles passent de 0,68 H 0,57 mg/lOO g de poids frais; cette baisse est accompagnee d’une forte elevation du poids des phosphatidylserines qui augmentent de 20 a 176 mg/lOO g de poids frais. Nous avons tgalement dCcelC des traces d’un compose dont le Rf correspond a celui des lysophosphatidylethanolamines. Cardiolipides

Les chromatogrammes montraient Cgalement deux taches sit&es a la hauteur des cardiolipides. L’une d’elles reagissait positivement a la nynhydrine. Nous avons regroup& ces deux taches et la courbe fait voir deux pits, le premier chez la larve de 12-13 jours (120 mg/lOO g de poids frais) et le second chez l’adulte de 4-5 jours (142 mg/lOO g de poids frais). DISCUSSION

La courbe des variations des lipides totaux est en accord avec les resultats obtenus anterieurement dans notre laboratoire (VILLENEUVEet LEMONDE, 1963) bien que le pourcentage en soit un peu moins ClevC. Cette marge est attribuable a des techniques differentes d’extraction des lipides. La courbe des phospholipides suit les variations du phosphore mesurees par CHAUDHARYet LEMONDE(1963) quoique les changements soient un peu moins accent&. Nous pouvons affirmer a la lumiere de nos resultats, que la diminution du phosphore lipidique observee par ces auteurs a la fin de la periode larvaire est imputable aux phosphatidylcholines et aux phosphatidylethanolamines et que, mCme si, durant le stade pupe, la somme de ces deux phospholipides donne un taux constant de phosphore, l’augmentation des phosphatidylethanolamines est contrebalancee par la baisse des phosphatidylcholines. Etant donne que la pupe constitue un systeme clos, il est tentant d’affirmer que ces deux groupes de composes peuvent s’interconvertir. Ces reactions de transmethylation n’ont pas encore CtCmises en evidence chez les insectes. Au stade adulte, l’importance des composes mineurs est accrue et ceux-ci sont en partie responsables du gain enregistrk dans la fraction des phospholipides.

838

A. R. BBAUDOIN, J.-L. VILLENEUVE, ET A. LEMONDE

La repartition du phosphore dans les dif%rents phospholipides chez la larve de 12-13 jours ressemble a celle que KAMIENSKI et al. (1965) ont observte chez la larve Tenebio mlitor. De plus, le rapport phosphatidylcholines/phosphatidylCthanolamines Concorde avec les don&es obtenues par FAST (1966) chez quatre coleopdres pris a divers stades. Les variations observees dans les differents phospholipides montrent que le role joue par ceux-ci ne se limite pas a un r6le structural. 11 semble que lorsque les besoins sont trb grands (e.g. a la pupaison) en plus d’utiliser les lipides neutres, l’insecte ferait appel aux phosphatidylcholines, REISER et al. (1960) ont signale l’activid metabolique de ces composes et ils les ont ranges apres les triglycerides comme source d’cnergie respiratoire. Avec la disparition des phosphatidylcholines, nous notons l’apparition d’une quantite appreciable de Iysphosphatidylcholines. Ceci s’expliquerait par une difference d’activitt de la lecithinase et de la lysolecithinase. L’augmentation des phosphatidylcholines que nous observons du premier au deuxieme jour du stade pupal serait due ?I une acylase qui resynthetiserait celles-ci a partir des lysophosphatidylcholines accumulees a la pupaison. Un mecanisme analogue a CtC propose par LANDS (1960) dans les microsomes du foie de rat. La concentration des sphingomytlines suit le metabolisme global et la hausse notee a la fin du stade pupal serait due a l’elaboration de tissus riches en ces lipides (KINSELLA, 1966). Nous crayons que la transformation des phosphatidylethanolamines en phosphatidylserines est possible chez T. confusum. Ceci parait vraisemblable en particulier a l’emergence adulte alors que nous mesurons une forte baisse des phosphatidylethanolamines et une hausse concomitante dans la fraction des phosphatidylserines. CRONE (1967) a mis en evidence la transformation des phosphatidylserines en phosphatidylethanolamines chez Musca domestica. 11 a suggCrC que cette transformation se ferait par un &change des bases aminees, 1’Cthanolamine remplacant la serine des phosphatidylserines. Nous n’avons pas trouvC de relation entre le contenu en cephalines et l’activitt respiratoire bien que certains auteurs aient mention& le fait chez d’autres especes d’insectes (CRONE, 1964; KINSELLA, 1966). En revanche, la courbe des variations des cardiolipides ressemble d’assez prb a la courbe de la consommation d’oxygene (LEMONDE et al., non publies). 11 est maintenant reconnu que ces lipides acidiques constituent une partie essentielle B l’integrite structurale et fonctionnelle des mitochondries (GREEN et TZAGOLOFF, 1966). Globalement, les plus fortes variations se manifestent aux periodes de la pupaison et de l’emergence adulte.

CONCLUSIONS Nous avons mesure les variations des phospholipides phose de Tribolium confusum Duval.

au tours de la m&.amor-

LBS PHOSPHOLIPIDBS AU COURSDE LA M&TAMORPHOSE

839

Aprb extraction des lipides selon le pro&de de FOLCH et al. (1957), nous avons &pare les lipides polaires des lipides non polaires par une technique de fixation sur acide silicique. La separation des divers phospholipides a CtCrCalisCepar chromatographie en couche mince. Les principaux phospholipides de cet insecte sont les phosphatidylethanolamines, les phosphatidylcholines et les sphingomy&res. Les phosphatidylserines, les lysophosphatidylcholines, les lysophosphatidylCthanolamines ainsi que les cardiolipides se retrouvent dans des proportions plus faibles. Les principales variations de ces composk se produisent lors de la transformation des larves en pupes et des pupes en adultes. L’Ctude des variations de ces composes suggtre l’existence de certains mkcanismes d’interconversion, en particulier la reacylation des lysophosphatidylcholines pour former des phosphatidylcholines. Nous discutons de l’importance de ces reactions. Remexiements-Ce travail a BtC execute avec I’aide financiere du Conseil des Recherches Medicales, Ottawa, Canada. Les auteurs remercient sincerement Monsieur ANI& HIJDON pour l’aide technique qu’il a foumi. REFERENCES ALLAIS J. P., BERCERARD J., ETIENNE J., et POLONOV~KI J. (1964) Nature et evolution des lipides au tours de l’embryogenese de Locusta migratoria L. J. Insect. Physiol. 10, 753-772. CHAUDHARY K. D. et LEMONDEA. (1962) Phosphorus in the nutrition of Tribolium confkum Duval. Can.J. Zool. 40, 375-380. CHAUDHARY K. D. and LEMONDEA. (1963) Studies on phosphorus metabolism during the growth and metamorphosis of Tribolium confusum Duval. Camp. Biochem. Physiol. 9, 343-352. CRONE H. D. (1964) Phospholipid composition of flight muscle sarcomeres from the housefly Musca domestica L. J. Insect Physiol. 10,499-507. CRONE H. D. (1967) The relationship between phosphatide serine and ethanolamine in larvae of the housefly Musca domestica. J. Insect Physiol. 13, 81-90. DITTMERJ. C. and LESTER R. L. (1964) A simple specific spray for the detection of phospholipids on thin layer chromatograms. J. Lipid Res. 5, 126-127. FAST P. G. (1966) A comparative study of the phospholipids and fatty acids of some insects. Lipids 1,209-215. FLEURY P. E., CO~~RTOIS J. E., et MALANGEAU P. (1953) Utilisation de la chromatographie sur papier pour la separation du m-inositol et des scyllitols et pour leur identification. Bull. Sot. chim. Biol., Paris 35, 537-540. FOLCH J., LEES M., and SLOANE-STANLEYG. H. (1957) A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. biol. Chem. 226, 497-509. GILBERT L. I. (1967) Lipid metabolism and function in insects. Adw. Insect Physiol. 4, 69-211. GILBY A. R. (1965) Lipids and their metabolism in insects. A. Rew. Ent. 10, 141-160. GREEN D. E. et TZAGOLOFFA. (1%6) Role of lipids in the structure and function of biological membranes. y. Lipid Res. 7, 587-602. JENKIN P. M. and HINTON H. E. (1966) Apolysis in arthropod moulting cycles. Nature, Lotuf. 211, 871. KAMIENSKIF. X., NEW~URGHR. W., and BROOKESV. J. (1965) The phospholipid pattern of Tenebrio molitor larvae. J. Insect Physiol. 13, 653-664. 54

840

A. R. BEAUDOIN,J.-L.

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