Intérêt de la numération absolue par cytométrie en flux et du quadruple marquage des sous-populations lymphocytaires lors de l'infection par le VIH

nt@r@tde la num@rationabsolue par cytom@trieen flux et du quadruple marquage des sous-populationslymphocytaires lors de l'infection par le VIH

C. B L A N C , G. C A R C E L A I N ,

L. P E R I E S , I. P O R C H E R , P. D E B R E , e t B. A U T R A N

*

R(:SUMF:

SUMMARY

La d@termination des sous-populations lymphocytaires CD4 et CD8 pour le suivi des patients VIH+ est devenue, du fait de l'essor technologique de la cytom@trie en flux, un examen n@cessitant une standardisation. Parmi les diff@rentes m@thodes utilis@es, une nouvelle m@thodologie d'analyse ouvre la voie vers un d@but de standardisation. Elle consiste a d@terminer les pourcentages des souspopulations lymphocytaires ~ l'aide de quatre marqueurs membranaires en quadruple fluorescence ainsi que la valeur absolue de ces sous-populations ~ l'aide d'un @taIon interne constitu@ de billes fluorescentes. Cette nouvelle m@thodologie s'effectue sur un seul appareil de cytom@trie en flux. Le recul de cette nouvelle technologie n'est pas tr@s important mais les donn@es de l'@tude d'@valuation montrent que les r@sultats sont comparables a ceux obtenus' par une m@thode dite de r@f@rence, tant sur le plan de l'exactitude des r@sultats que de la reproductibilit@ de la m@thode.

The determination of CD4 and CD8 Tcell subpopulations for therapeutic HIV folowing became, with the expansion of cytometry technology a test required standardization. A m o n g the different methods used, a new test open the way toward standardization. This test consisted to determine simultaneously the percentage of Tcells subsets and the absolute value. The percentage is determined with the analysis of simultaneously four antigen markers in four colours cytometry analysis with an internal standard as fluorescent beads for the absolute count. This test is too close for a proper view, nevertheless first results are nearly the same as the reference method as reproductivity and accuracy.

MOTS-CLf:S

KEY-WORDS

quadruple marquage - valeur absolue - cytom@trie en flux - standardisation - VIH - sous-populations lymphocytaires.

quadruple color analysis - lymphocyte number - f l o w cytometry - standardization - H I V - T lymphocyte subsets.

Introduction La num@ration des sous-populations lymphocytaires T CD4+ et C D 8 + par cytom@trie en flux (CMF) est un test de plus en plus r@alis@ darts les laboratoires d'analyses biologiques du fait de son importance consid@rable au cours de l'@volution de la maladie li@e au VIH. I1 a en effet @t@ mis en @vidence une corr@lation entre le stade de la maladie et le taux de cellules T CD4+, et ce marqueur biologique est ainsi devenu le marqueur immunologique de r@f@rence pour le suivi de l'infection VIH, tant sur le plan pronostique que sur le plan th~rapeutique (3, 7, 8, 9). Les nouvelles molecules anti-r@trovirales permettent de mettre en Revue frangaise des laboratoires, octobre 1996, N ° 287

place de nouveaux traitements et d'esp@rer ainsi une remont@e du taux des cellules T C D 4 + importante et durable en parall@le & la diminution majeure de la charge virale. De nombreuses @valuations d'associao tions de deux ou trois anti-r@troviraux sont actuelleo ment en cours, le plus souvent multicentriques, elles n@cessitent une tr@s grande standardisation des * Laboratoire d'immunologie cellulaire et tissulaire Groupe hospitalier Piti@-Salp@tri@re 47-83, bd de l'H6pital 75651 PARIS CEDEX 13 TIRES A PART Mrne le Pr B. AUTRAN

article regu le 2 ao~t, accept@ le 20 septembre 1996. 59

m6thodes utilis6es. I! est donc important d'utiliser une technique fiable de num6ration des sous-populations lymphocytaires en cytom6trie en flux, limitant au maximum les 6cueils des variations dues ~ la technologie. Deux m6thodes, bas6es sur deux principes diff6rents, de num6ration des sousopopulations lymphocytaires T en comptage direct, ont 6t6 d6velopp6es. La premiere consiste ~ calibrer le cytom~tre en volume. Les pr6parations sont analys6es pendant un temps fixe et l'on suppose que le m~me volume de pr6paration est ensuite analys6 sur chaque 6chantillon. Nous d&crirons ici la deuxi~me m6thode qui utilise un 6talon interne de numeration constitu6 de billes fluorescentes. Cette technique r6alise quatre d6terminations simultan6es diff6rentes bas6es sur : - la caract6risation immunologique des leucocytes, - la mesure du pourcentage des lymphocytes T parmi les leucocytes, - l a mesure du pourcentage des sous-populations parmi les lymphocytes, - la mesure de la valeur absolue des sousopopulations lymphocytaires calcul6e par rapport au hombre de cellules et de billes compt6es. Au regard des diverses techniques utilis6es ~ ce jour pour cette analyse, cette nouvelle m6thodologie permet d'6voluer vers un d~but d'automatisation et de standardisation (6).

I. Les m6thodes d'analyse et de num6ration des sous-populations lymphocytaires T en comptage direct 1. T e c h n i q u e actuelle i n d i r e c t e La technique actueUe de numkration des lymphocytes T CD4+ repose sur deux mesures distinctes. Une analyse en cytom6trie en flux qui permet de d~terminer le pourcentage de cellules exprimant les antigknes CD4 et CD8. Cette analyse est effect@e en simple, double ou triple fluorescence ; la population lymphocytaire T ~tant sklectionnke selon des crit~res morphologiques (taille/structure) corrklks & l'kvaluation des cellules marquees positivement par l'anticorps anti-CD4 et/ou anti-CD8 (kventuellement coexprimant l'anti-CD3, marqueur pan-lymphocytaire T) (2, 5). Parall61ement, la numeration formule sanguine rkaliske sur un hkmocytom~tre permet d'avoir acc~s au nombre absolu de lymphocytes par mm 3 de sang. La conjugaison de ces deux m~thodes permet de d6terminer la valeur absolue des lymphocytes T CD4+ et/ou CD8+ par mm 3 dans le sang circulant. L'utilisation d'une technique associant deux mesures, faites si ce n'est dans deux laboratoires diff~rents au moins sur deux automates diffkrents, augmente les risques d'erreur. S'il a kt6 montrk que la variabilit6 de la mesure des pourcentages de lymphocytes T CD4+ et CD8+, dkterminks par des techniques de marquage sur sang total, ktait fiable (10), il a 6t~ constatk une plus grande variabilitk des r~sultats h~matologiques. Ces variations sont pour la plupart likes aux diffkrents types d'appareil d'h~matologie utilisks, chaque appareil d'h6matologie ayant sa propre calibration qui n'est pas standardiske (4, 11, 12). De plus, il faut noter que l'association de deux techniques multiplie le risque d'erreurs dans la saisie et la gestion des r~sultats (possibilit~s d'autant multipli~es sur de grandes skries d'analyse). 2. P r i n c i p e de la n u m 6 r a t i o n a b s o l u e en c o m p t a g e direct Afin de pallier ces sources d'erreurs, il a ktk propos~ une nouvelle m~thode de numeration absolue des lymphocytes T CD4+ et/ou T CD8+. Elle consiste & effectuer, sur le m~me 60

appareil, & partir d'un kchantillon de sang total une d~termination simultanke de quatre antigknes : le CD45, le CD3, le CD4, et le CD8. La valeur absolue est d6terminke par l'adjonction & la pr@aration d'un ~talon interne constituk de billes fluorescentes de concentration connue. D'aprks les pourcentages de cellules exprimant simultan6ment le CD45, le CD3 et le CD4 ou le CD8, il est possible de d6duire la valeur absolue des sous-populations T du sang circulant.

2.1. Le principe La num6ration absolue quant & elle est r~alis6e selon le principe suivant : un volume de billes fluorescentes, identique au volume de sang total utilisk pour le marquage, est mklangk la pr6paration. La valeur absolue ou le nombre de billes/mm 3 de Flow-Count TM est d~termin6e par le fabricant. Pendant l'analyse, ces billes sont comptkes en m~me temps que les cellules de l'~chantillon. Puisque la concentration en billes est connue, que les volumes de billes et de sang dans la prkparation sont les m~mes, le nombre de cellules en valeur absolue est calcul6 & partir de la formule suivante : nombre de cellules comptkes nombre de cellules/mm3= x valeur absolue des biUes nombre de billes comptkes Ce calcul se fait automatiquement sur toutes les nouvelles versions de Iogiciels informatiques des cytom6tres en flux.

2.2. La preparation de l'~chantillon La rigueur apport6e ~ la prkparation de l'kchantillon est indispensable. Pour cela, il est utilisk des kits commerciaux comprenant un rkactif de lyse, un fixateur et un lot de billes fluorescentes. Ces rkactifs sont soumis & des contr61es de qualitk stricts par le fabricant. La technique elle-m~me nkcessite une rigueur extr@me. II est imp6ratif de pipeter de faqon tr~s prkcise le sang puisqu'il doit ~tre analysk comparativement & un volume identique de billes fluorescentes. II peut @tre recommand~ d'utiliser une pipette automatique. Apr~s incubation du sang avec les anticorps monoclonaux, les globules rouges sont ]ys6s et la pr@aration fixke n'est pas centrifugke pour conserver l'intkgralit~ de la population leucocytaire. La variabilitk du pipetage reprksente une des principales limites de ces mkthodes.

2. Le quadruple marquage pour la num6ration absolue des sous-populations lymphocytaires 1. Le q u a d r u p l e m a r q u a g e II est proposk d'augmenter la spkcificitk de l'analyse en analysant simultankment plusieurs marqueurs antigkniques, le CD45, le CD3, le CD4 et le CD8. La dktermination des lymphocytes T au sein de la population leucocytaire de la prkparation de sang total est dkfinie au moyen de plusieurs param~tres. Ainsi, les paramktres taille (FSC), structure (SSC) sont corrklks & la fluorescence like & l'expression du CD45 (marqueur pan-leucocytaire), celle like & l'expression du CD3 (marqueur pan-lymphocytaire T), du CD4 (marqueur des cellules T dites "helper") et enfin, la fluorescence li~e & l'expression du CD8 (marqueur des cellules T dites "cytotoxiques"). Cette nouvelle mkthodologie permet, en l'absence de centrifugation apr~s lyse du sang total, de sklectionner la population lymphocytaire en structure et expression du CD45 pour ~liminer la presence de globules rouges non totalement lysks projetks dans la r~gion lymphocytaire. La coexpression CD3+CD4+ permet d'~liminer les monocytes de la population lymphocytaire et ]a coexpression CD3+CD8+ prkcise l'analyse des lymphocytes CD8+. Ceci peut-ktre rkalis~ par une analyse en triple fluorescence des combinaisons C D 4 5 / C D 3 / C D 4 et C D 4 5 / C D 3 / C D 8 et au mieux en quadruple fluorescence C D 4 5 / C D 3 / C D 4 / C D 8 aboutissant & la Revue fran~aise des laboratoires, octobre 1996, N ° 287

m~me precision du r~sultat. En revanche, la triple fluorescence double le nombre de tubes prepares et analys~s. La combinaison en triple fluorescence C D 3 / C D 4 / C D 8 diminue quant & elle la precision de l'analyse en s~lectionnant des globules rouges non lys~s et des monocytes dans la population lymphocytaire sous estimant le r~sultat de fagon al~atoire. D'ofi l'int~r~t pour une precision du r~sultat d'une analyse simultan~e de ces quatre expressions antig~niques.

2. Le choix des fluorochromes et des combinaisons d'anticorps monoclonaux Pour une analyse en quadruple marquage, il est n~cessaire d'utiliser des anticorps monoclonaux (ACM) directement conjugu~s & un fluorochrome pour permettre une homog~n~it~ dans les intensit~s de fluorescence d~livr~es Iors de l'analyse. Ceci facilite le r~glage des hautes tensions des photomu]tiplicateurs et des compensations de fluorescence du cytom~tre. Les fluorochromes utilis~s sont fonction de ]a combinaison laser du cytom~tre. Sur un cytom~tre ~quip~ d'un seul laser (laser argon 488 nm), il sera utilis~ les fluorochromes suivants : FITC (525 nm), PE (575 nm), PE-TexasRed (613 nm), PE-Cyanine5 (675 nm) ou PerCP (680 nm). Sur un cytom~tre ~quip~ de deux lasers (laser argon 488 nm et h~lium/n~on 633 nm), avec le laser argon, les fluorochromes utilis~s seront : FITC (525nm), PE (575 nm), PE-TexasRed (613 nm), PE-Cyanine5 (675 nm) ou PerCP (680 nm). Avec le laser h~lium/n~on, il s'agira des fluorochromes : APC (675 nm) ou TexasRed (613 nm) ou encore Cyanine5 (675 nm). Le syst~me d'analyse d'un quadruple marquage avec un seul laser n~cessite une attention toute particuli~re quant & I' optimisation des r~glages de la compensation de fluorescence, parfois tr~s d~licats & effectuer. Cet inconvenient est actuellement r~solu par l'arriv~e de nouveaux Iogiciels qui permettent dans des conditions pr~cises de combinaisons de fluorochromes d'optimiser automatiquement les r~glages & chaque s~rie d'analyse. En ce qui concerne en revanche l'utilisation d'un syst~me ~ double laser, les ACM directement conjugu~s avec I'APC ou le TexasRed commencent & arriver sur le march~ et les syst~mes sont en cours d'~valuation. Cependant la technologie double laser n'est pas une nouvelle technologie, elle existe sur les cytom~tres en flux analyseurs-trieurs de cellules, parfois m~me dans des configurations lasers encore plus ambitieuses. La performance de la technologie multi-laser est donc d~j& connue en cytom~trie en flux. Le choix des ACM reste tr~s important dans l'analyse en quatre couleurs. Les m~langes commerciaux sont en g~n~ral conseill~s car parfaitement titr~s et surtout optimis~s dans le choix des conjugaisons des fluorochromes aux diff~rentes sp~cificit~s d'anticorps. En effet, il est important de r~server certaines fluorescences plus faibles & des antig~nes fortement exprim~s & la surface cellulaire pour permettre de diminuer la sensibilit~ du d~tecteur et, par consequent, de faciliter les r~glages de compensation de fluorescence.

3. Standardisation de la m thode 1. Automatisation de la preparation La cha~ne de preparation des ~chantillons est loin d'etre standardis~e. Seul un syst~me de d~livrance automatique des r~actifs de lyse et de fixateur est actuellement fonctionnel. Mais l'~tape cruciale de la preparation, c'est-&-dire la prise d'essai tr~s precise de sang et ~ventuellement de biUes, n'est pas automatis~e. Un gros effort reste donc& faire par les industriels pour automatiser enti~rement cette cha~ne de preparation.

2. Le cytom~tre Avant le passage effectif des ~chantillons sur le cytom~tre, il est impos~ quotidiennement une v~rification de la calibration de l'appareil, v~rification garantissant son bon fonctionneRevue frangaise des laboratoires, octobre 1996, N ° 287

ment (13). Pour cela, diff~rents types de calibrants sont utilis~s. Des billes fluorescentes vont garantir l'alignement du laser du cytom~tre tandis qu'un autre type de billes fluorescentes contr61era la lin~arit~ et la sensibilit~ du syst~me. De plus, pour standardiser ]'experimentation, un nouveau contr6le de qualit~ interne quotidien est ajout~. II consiste & analyser une suspension de lymphocytes humains normaux conserves et r~hydrat~s juste avant leur utilisation. On obtient une suspension de lymphocytes purs avec lesquels il est possible d'une part de contr61er l'activit~ des anticorps monoclonaux utilis~s pour le test et d'autre part de standardiser le protocole experimental. Pour standardiser une experimentation, il suffit d'analyser dans les m@mes conditions l'~chantillon contr61e et de noter les moyennes de fluorescence obtenues. II faut ensuite, pour retrouver ces conditions tr~s pr~cises, ajuster ]es r~glages des d~tecteurs de telle sorte que ]es moyennes de fluorescence soient identiques & celles pr~alablement not~es. Un nouveau Iogiciel (System-llTM) permet d'automatiser cet ajustement des hautes tensions des d~tecteurs ainsi que les r~glages de compensation de fluorescence. Grace & cet encha~nement de contr61es, qu'il sera n~cessaire d'am~liorer r~guli~rement, les ~chantillons seront analys~s t o u s l e s jours dans les m~mes conditions.

4. Evaluationde cette nouvelle m thodologie 1. Numeration absolue en quadruple marquage 1.1. Materiel et m~thodes Cette nouvelle m~thode a ~t~ compar~e ~ une m~thode dite de r~f~rence utilis~e & ce jour dans la majorit~ des laboratoires (les pourcentages des cellules CD4+ et CD8+ sont d~termin~s apr~s lyse des globules rouges et lavages, ces r~sultats sont ensuite combin~s & la numeration formule sanguine pour obtenir les valeurs absolues correspondantes). Les r~actifs utilis~s ont ~t~ les suivants : - r~f~rence du laboratoire : - anticorps IOT3, IOT4, IOT8 (Immunotech) - solution de lyse (solution Facs lysing) (Becton-Dickinson) - analyse sur cytom~tre Facscan Lysis II (Becton-Dickinson) - N F S du laboratoire central d'h~matologie, h6pital Piti~Salp~tri~re - r~f~rence de l'~tude : - anticorps Cyto-Stat TetraChrome (Coulter) CD45-FITC/CD4-RD 1/CD8-ECD/CD3-PC5 - kit Cyto-Comp (Coulter) - Flow-CheckTM et Flow-Set TM (Coulter) - Flow-Count TM (Coulter) - solution de lyse Immunoprep (Coulter) -analyse sur cytom~tre XL System-IP (Coulter), Iogiciel TetraOne TM (Coulter). L'~tude a inclus 20 sujets normaux et 31 sujets VIH+ (24 ayant un taux de lymphocytes T CD4 > 5 0 / m m 3 et 7 < 50/mm3).

1.2. Evaluation de i'exactitude des pourcentages et des valeurs absolues Les coefficients de correlation entre les r~sultats obtenus par la m~thode de r~f~rence et ceux obtenus avec la nouvelle m~thode sont sup~rieurs & 0,957 pour tous les param~tres compares (sujets normaux et VIH+) (figures 1A et 1B). Le test-t n'a mis en ~vidence aucune difference significative en ce qui concerne les valeurs des pourcentages de CD4 ainsi que les valeurs absolues CD4. En ce qui concerne les valeurs absolues CD8, aucune difference significative (p=0,01) n'a ~t~ mise en ~vidence si l'on int~gre l'analyse du CD3 ~ la technique de r~f~rence et compare les valeurs des CD3+CD8+ (tableau I). En revanche, des differences significatives sont observ6es sur les pourcentages de lymphocytes CD8 totaux 61

FIGURE 1A Correlation entre les valeurs absolues de CD4 m~thode de r,~f~rence et m~thode quadruple fluorescence Coulter coefficient de correlation = 0,986

1200-!

difference significative n'a ~t~ mise en ~vidence pour les CD4, seule une diff&rence significative a ~t& observ~e (p=0,002) en ce qui concerne la reproductibilit~ de la d~termination du pourcentage de CD8 (1). Cette observation a d~j& &t~ rapport~e & plusieurs reprises et semble li~e & l'expression h~t~rog~ne du marqueur CD8. Les valeurs absolues ont ~galement &t~ d&termin&es sur la m&me pr¶tion analys~e 16 fois. Aucune des valeurs observ~es ne sort des limites m o y e n n e + / 2 ~carts-type.

1000 !

1.4. Stabilit~ du marquage de tO t= 2 4 h

lSOO T [ 1400 +

Les pourcentages et les valeurs absolues ont ~t~ d~termin~s sur deux preparations diff~rentes de 9 ~chantillons & J0 et 24 h et n'ont pas montr& de difference significative pour les C D 4 ; une difference significative a ~t~ observ~e seulement pour la stabilit& de la d~termination du pourcentage de CD8 J0 et & 24 h (p=0,0013).

800

600 f 400

1 [ 200

0 ,' 0

'. 400

i 600

! 800

I 1000

1200

I 1400

2. N u m e r a t i o n absolue en triple m a r q u a g e 2 . 1 . M a t e r i e l et m ~ t h o d e s

[] coordonn~es de la droite de r~gression • valeurs exp~rimentales

Les r~actifs utilis~s sont les suivants : - r~f~rence du laboratoire : - anticorps IOT4, IOT8 (Immunotech) - anticorps anti-CD3,CD4,CD8 (Becton-Dickinson) - solution de lyse solution Facs lysing (Becton-Dickinson) - analyse sur cytom~tre Facscan Lysis II (Becton-Dickinson) - N F S du laboratoire central d'h~matologie, h6pital Piti& Salp~tri~re - r~f~rence de l'~tude : - anticorps de triple fluorescence TriTest (Becton-Dickinson) C D 3 - F I T C / C D 4 - P E / C D 4 5 P e r C P et CD3-FITC/CD8-PE/CD45PerCP - billes de calibration TruCount (Becton-Dickinson) - tubes TruCount valeurs absolues, contenant une quantit~ fixe de billes TruCount - solution de lyse (solution Facs lysing Becton-Dickinson) -analyse sur cytom~tre Facscan, logiciel Cell-quest et Attractors. L'~tude a inclus 57 sujets normaux et 64 sujets VIH+ (15 ayant un taux de lymphocytes T CD4 > 5 0 0 / m m 3, 26 compris entre 200 et 5 0 0 / m m 3, 18 entre 50 et 2 0 0 / m m 3, et 14 < 50/ram3).

FIGURE I B Correlation entre les valeurs absolues de C D 8 / C D 3 m~thode de r~f~rence et m~thode quadruple fluorescence Coulter coefficient de correlation = 0,961 1400-

12oo t £3

1000 l £3

8OO +

600

I 400 t

200 l

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I

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I

200

400

600

800

1000

1200

[] coordonn&es de la droite de r~gression • valeurs exp~rimentales

2.2. Evaluation de l'exactitude de la valeur absolue et des pourcentages de la m~thode TriTest C D 3 / C D 4 / C D 4 5 Les valeurs absolues sont bien corr~l~es (figure 2A). La num&

comprenant les C D 3 + C D 8 + et CD3-CD8+ m@me en int~grant le param~tre CD3 & l'ancienne technique (sujets normaux et VIH+).

ration absolue TriTest ne diff~re pas significativement de la m~thode de r~f~rence aussi bien chez les sujets normaux (p>0,001) que chez les-sujets VIH+ et ceci pour l'ensemble des patients (p>0,001) pour les sujets ayant plus de 50 lymphocytes T C D 4 / m m 3 ( p > 0 , 0 0 1 ) et pour les sujets ayant moins de 50 lymphocytes T C D 4 / m m 3 (p>0,001) (figure 2A

1.3. Evaluation de la reproductibilit~ de la m~thode Les pourcentages et les valeurs absolues ont ~t~ d~termin~s sur deux preparations diff&rentes de 13 &chantillons. Aucune

et tableau II).

TABLEAU 1 l~valuation de l'exactitude des valeurs absolues CD4 et CD8 : comparaison de la m~thode de r~f~rence ~ la m~thode Coulter TetraOne (test de Student)

Normaux : n=20 Moyenne D~viation standard Test de Student TetraOne

995

1015

245

292

NS & p0,001 NS & p0,01

639

544

247

264

S &p0,001 NS ~ p0,001

VIH : n=31 Moyenne

243

241

743

699

D~viation standard

196

190

352

336

Test de Student TetraOne

62

NS ~ p0,001 NS &p0,01

S ~ p0,001 NS &p0,01

Revue frangaise des laboratoires, octobre 1996, N ° 287

TABLEAU !I l~valuation de l'exactitude des valeurs absolues CD4 et CD8 : comparaison de la m~thode de r~f~rence & la m~thode TriTest Count Becton-Dickinson (test de Student)

Normaux : n=57 Moyenne Deviation standard

NS NS

Test de Student TriTest Count

S & )0,001 NS & )0,01

)0,001 )0,01

VIH : n=64 Moyenne

273

280

261

896

888

766

Deviation standard

243

247

236

461

485

435

Test de Student TriTest Count

S &p0,001 NS &p0,01

NS &p0,001 NS &p0,01

Pour les pourcentages, ils ne different pas significativement (p>0,001) de la m&thode de reference pour l'ensemble des sujets etudies, y compris pour les sujets VIH+ et ce quel que soit leur nombre de CD4+o

2.3. E v a l u a t i o n de I ' e x a c t i t u d e de la valeur absolue et des pourcentages de ia m ~ t h o d e TriTest C D 3 / C D 8 / C D 4 5 En ce qui concerne les valeurs absolues de lymphocytes T CD8+, une fois encore les correlations sont aussi satisfaisantes (figure 2B). Des diff&rences faibles mais neanmoins significatives (p<0,001) sont observ&es pour l'ensemble des sujets de l'etude. II en est de meme pour les pourcentages (p<0,001) (tableau II). Les differences entre les numerations CD8 peuvent &tre facilement expliqu&es Iorsque l'on compare des cellules T CD8+ (CD8+CD3+) et des cellules CD8+ totales (cellules T CD8+CD3+ et cellules NK CD8+CD3-). On constate ici (comme attendu) que les amplitudes des diff&rences sont moindres si l'on compare les deux populations CD8+CD3+.

FIGURE 2A Correlation entre les valeurs absolues de CD4 m~thode de r~f~rence et m~thode TriTest CD3/CD4/CD45 Becton-Dickinson coefficient de correlation = 0,980 200O

El

1000 -

D ~ m~l B

2.4. E.valuation de la r e p r o d u c t i b i l i t ~ de la m ~ t h o d e Les pourcentages et les valeurs absolues ont ~t~ determines sur deux pr@arations diff&rentes de 15 echantillons. Les coefficients de variation ne montrent pas de diff&rence significative.

Conclusion

04 1000

2000

FIGURE 2B Correlation entre les valeurs absolues de CD8 m~thode de r~f~rence et m~thode TriTest CD3/CD8/CD45 Becton-Dickinson coefficient de correlation = 0,946 =

2GCO

L'essor technologique des cytom~tres en flux et la prescription accrue du typage lymphocytaire depuis ces derni/~res ann~es a conduit aujourd'hui & la n~cessit~ de d~velopper des nouvelles techniques, plus completes et plus s6res. De plus, la multiplication actuelle d'essais th~rapeutiques dans le cadre de l'infection au VIH, n~:essite la mise au point rapide d'une bonne standardisation permettant une comparaison des r~sultats inter-laboratoires. De nouvelles techniques sont apparues r~cemment sur le march~ pour r~pondre & ces nouvelles exigences. Elles conditionnent la r~alisation de l'examen sur quelques exigences principales : utiliser la CMF comme seule technique d'analyse et de numeration absolue ; effectuer un quadruple immunoomarquage pour augmenter la sp~cificit~ de l'analyse ; utiliser une technique de preparation d'~chantillons sans lavage et centrifugation pour limiter les pertes cellulaires ; et enfin, r~aliser l'analyse sur un cytom~tre quotidiennement calibre. Des efforts restent & faire Revue franc2aise des laboratoires, octobre 1996, N ° 2 8 7

m

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1000

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2000

63

dans la standardisation de la cha~ne d'analyse, tant sur le plan de l'automatisation de la preparation des ~chantillons que sur l'optimisation des contr61es de qualit~ pour valider les r~sultats. La CMF en quatre couleurs permet d'~valuer simultao n~ment les quatre param/~tres C D 4 5 , C D 3 , C D 4 , C D 8 , indispensables a la la d~termination a la fois des pourcentages et des valeurs absolues. L'int~r~t en est illustr~ au cours des nouveaux traitements de

l'infection ~ V I H o6 l'on peut d~tecter des ascensions dissoci~es des pourcentages et des valeurs absolues et ainsi mieux comprendre les m~canismes immunoloo giques en cause. Cette nouvelle m~thodologie tr~s prometteuse, mais pour laquelle nous n'avons pas encore beaucoup de recul, dolt permettre, ~ terme, d'obtenir un syst~me simple de r~f~rence de numeration des sous-populao tions lymphocytaires.

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Revue franqaise des laboratoires, octobre 1996, N ° 287