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Métabolisme de la glutamine dans les lymphocytes humains
METABOLISME
DE LA GLUTAMINE (570 mg/kg/j) de glutamine. Les bilans azot6s ont 6t6 am61ior6s lorsque la glutamine 6tait ajout6e/t la nutrition parent6rale. Les concentrations de glutamine n'ont pas vari6 significativement et aucune alt6ration du m6tabolisme de l'ammoniaque n'a 6t+ observ~e. I1 apparah donc que l'administration de glutamine chez des patients de soins intensifs pr6sentant une fonction h6patique normale a des effets toxiques n6gligeables.
administrations de glutamine et il n'a pus 6t6 observ6 d'effets secondaires. Les constantes vitales n'ont pas 6t6 modifi6es de fagon consistante tout au long de l'6tude. Les concentrations plasmatiques de glutamine atteignaient leur maximum entre 30 et 45 minutes ; le pic 6tait li6/t la dose administr6e. La plus haute dose a entrain6 une augmentation des concentrations plasmatiques d'environ 1 300 ~tmol/l et la glutamin6mie est revenue progressivement ~ la normale en 4 heures. Les concentrations de glutamate et d'ammoniaque n'ont pas augment6 significativement. Les s6cr6tions d'hormone de croissance et d'insuline ont 6t6 stimul6es par l'ingestion de glutamine mais la glucagon6mie n'a pas chang6. La citrulline et l'arginine (connues pour ~tre des produits du m6tabolisme intestinal de la glutamine) ont augment+ proportionnellement fi la dose de glutamine administr6e. Le temps de demi-vie de la glutamine btait d'environ 110 minutes. Des 6tudes similaires ont 6t6 r6p6t6es en administrant la glutamine par voie intraveineuse. Les doses de glutamine 6taient de 0, 12,5 et 25 mg/kg/h, perfus6es en solution saline fi 0,2 %, pendant 4 heures. Les constantes physiologiques ont 6t6 suivies routes les heures et n'ont pas chang6 lors de la perfusion de glutamine. Aucun symptome toxique n'a ~t6 observ6. Les concentrations de glutamine ont atteint un maximum/~ 30-60 minutes apr6s le d6but de la perfusion et sont ensuite rest6es en plateau. La glutamin6mie a augment6 en fonction de la dose administr6e, de 625/t 700 gmol/1 avec la dose de 12,5 mg/kg/heure et/t 875 gmol/1 avec la dose de 25 mg/kg/heure. Le calcul des param6tres pharmacocin6tiques de la glutamine chez les trois patients qui ont regu une dose en bolus de cet acide amin6 indiquait une demi-vie de 67 rain. L'ammoniaque et les concentrations hormonales n'6taient pus significativement modifi6es mais le glutamate tendait /t augmenter 16g6rement (mais pas significativement) de faqon dose-d6pendante. Nous avons aussi 6tudi6 l'innocuitd d'une administration & long terme de glutamine ajout6e/t une nutrition parent~rale perfus6e chez des individus sains. Ceux-ci ont 6tO admis dans le centre de recherche clinique et plac6s sous nutrition intraveineuse pour une p6riode d'6tude de 5 jours. Trois essais ont @6 r6alis~s chez chaque sujet et l'intervalle entre chacun ~tait d'au moins deux semaines. La nutrition iso-azotOe iso-calorique fournissait des quantit~s ad6quates d'6nergie et de prot6ines qui variaient seulement par la quantit6 de glutamine, 0, 285 et 570 mg/kg/j. Les deux doses apportaient environ 20 et 40 g de glutamine par j o u r / t chaque sujet qui recevait environ 100 g d'acides amines par jour (1,5 g/kg). Dans deux 6tudes suppl~mentaires, nous avons administr6 57 g de glutamine par jour avec d'autres nutriments parent6raux. Des 6tudes de stabilit6 de ces solutions ont montr6 qu'elles ne g6n6raient pas de quantit6s appr6ciables d'ammoniaque quand elles 6taient conserv6es fi + 4°C pendant 7 fi 10 jours. A la temp6rature ambiante la d6gradation de la glutamine 6tait d'environ 0,1% par 24 heures et nous n'avons pus pu d6tecter d'augmentation appr6ciable des concentrations en ammoniaque dans les solutions conserv~es dans ces conditions. Aucun symptome toxique n'a 6t~ not6 et les 6valuations psychologiques qui ont 6t6 r6alis6es n'ont pus permis de d6tecter d'alt6ration des fonctions du syst+me nerveux central tout au long de l'~tude. A la fin des 5 jours de perfusion, les concentrations de glutamine 6taient d'environ 800 gmol/l, en augmentation 16g6re par rapport aux 700 gmol/l mesur~es avant la perfusion. Les concentrations d'ammoniaque et de glutamine restaient stables et n'ont pus vari6 avec la quantit~ de glutamine pr6sente dans les diff6rentes solutions. Des 6tudes similaires ont ~t~ r6alis6es chez des patients ayant subi une greffe de moelle osseuse et une irradiation corporelle totale. Cinq sujets ont regu une nutrition t6moin, quatre ont regu environ 20 g/jour (285 mg/kg/j) et cinq ont regu 40 g/j
M6tabolisme de la glutamine dans les lymphocytes humains Peter Schauder Division of Gastroenterology and Endocrinology, Department of Medicine, University of G6ttingen, FRG.
La glutamine est un m6tabolite essentiel pour la division des lymphocytes. La s6quence des 6v6nements m6taboliques dans l'activation immunologique de ces cellules est: 1) l'augmentation de la vitesse de transport des nutriments, 2) l'induction de la synth~se d'ARN, de protbines et d'ADN, suivie de la division cellulaire. Ce texte concerne les aspects du m6tabolisme de la glutamine dans les lymphocytes p6riph6riques humains en relation avec la prolif6ration cellulaire.
Isolement des cellules Les cellules mononucl~aires humaines ont 6t6 isol6es du sang veineux par centrifugation en gradient, puis purification par adh6sion des monocytes sur des godets en plastique. La pr6paration finale contenait des lymphocytes B et T avec environ 2 % de monocytes.
Transport de la glutamine La vitesse initiale de transport de la glutamine en fonction de la concentration 6tait saturable, aussi bien pour des concentrations physiologiques de chlorure de sodium que lorsque le milieu 6tait d6ficient en ions N a +. Le Km apparent 6tait de 1421~M et 180 gM, et les Vmax de 30 et 13 pmol/106 cellules/30 secondes pour le transport mesur~ respectivement avec des concentrations physiologiques et faibles en cblorure de sodium. Dans les cellules cultiv6es pendant 24 heures, en pr6sence ou non de concanavaline A (10 gg/ml), le Km apparent 6tait de 70 gM vs 90 gM et la Vmax de 73 vs 26 pmol/106 cellules/30 secondes. Le transport de [U J4 C]-glutamine (0,4 raM) en pr6sence de concentrations physiologiques de NaC1 ~tait diminu6 par l'histidine, l'asparagine, la s6rine et la leucine mais pas par l'a-m6thylamino-isobutyrate et l'acide 2-aminobicyclo-[2-2-1]-heptane-2-carboxylique. Ces r6sultats d6montrent l'existence de syst+mes de transport de haute affinit6 sodiumd6pendant et ind6pendant dans le lymphocyte humain. Le syst~me sodium-d~pendant semble impliquer des /ransporteurs similaires fi ceux des syst6mes N e t ASC d6crits dans d'autres cellules. La concanavaline A stimule le transport de glutamine en augmentant la capacit6 de transfert mais pas l'aff'mit6 pour la glutamine.
Catabolisme de la glutamine L'utilisation de la glutamine par ces cellules quiescentes ou stimul6es par les mitog6nes a 6t6 d6termin6e par la diff6rence de concentrations en glutamine dans le milieu (0,4 mM) au commencement et fi la fin d'une p6riode d'incubation de 120 rain. L'utilisation du glucose (5,6 mM dans le milieu) a ~t6 aussi not6e. L'utilisation de la glutamine et du glucose par les cellules quiescentes et stimul6es ~taient de 49 + 3 (n = 12) vs 157 ± 12 (n =12) et 261 ± 34 (n =11) vs 633 ± 46 (n = 11) nmol/2.107 cellules/120 min., indiquant une vitesse d'utilisation de la glutamine relativement plus grande que celle du glucose, bas6e sur leurs concentrations dans le milieu. 187
REUNIONS L'accumulation intracellulaire de glutamate en r6ponse aux incubations avec la glutamine 6tait de 12 4- 3 vs 97 4- 6 nmol/2.107 cellules/120 rain dans les cellules quiescentes et stimul6es indiquant que la glutaminase ne semble pas devenir une +tape limitante durant la stimulation lymphocytaire. Le m6tabolisme de la glutamine au-del/t du glutamate dans les cellules quiescentes et stimul6es, c'est/t-dire l'accumulation d'asparate (21 4- 3 vs 60 ± 10nmol/2.10:cellules/120 min.) et la production d'ammoniaque (71 4- 8 vs 146 ± 19 nmo|/2.107 cellules/120 min.) et de ~4CO2 /t partir [UJ~C]-glutamine (984 4- 88 vs 4548 4- 346 pmol/2.107 cellules/40 min..) sugg~re que la glutamine joue un r61e important dans l'apport 6nerg6tique des lymphocytes stimul6s.
une hydrolyse extracellulaire. Une activit6 hydrolase tr6s
importante dans le plasma, de m~me qu'un travail r6cent d~crivant la d6gradation h6patique des dipeptides par des enzymes situ~es au niveau de la membrane plasmique sinuso,dale du foie, affirme aussi l'id6e d'une hydrolyse extracellulaire. De m~me, une hydrolase de dipeptides a r6cemment ~t6 identifi6e au niveau des membranes plasmiques de muscle squelettique. Les mesures in vitro d'activit~ plasmatique d'hydrolase peuvent donc faciliter l'appr~ciation de la capture et de l'utilisation in vivo des dipeptides.
Essais in vitro de I'activite hydrolase plasmatique Du sang art6riel humain, pr6lev6 dans des conditions de jefine ou en situation post-prandiale, a 6t6 imm6diatement centrifug6 (1 550g, 20min.). Des 6chantillons de plasma (500 lal) ont 6t6 incub6s avec 50 gl de solution de peptides (12 et 24 mM en milieu salin) pendant des temps vari6s (jusqu'/t 1 heure) fi 37°C. Les concentrations d'acides amin6s et de peptides ont 6t6 mesur6es dans le surnageant non prot+ique par chromatographie en phase inverse en utilisant une d6rivation pr6-colonne avec l'orthophtalald6hyde/3-MPA ou avec le chlorure de dansyl. L'activit6 hydrolase maximum (Vmax) a ~t~ calcul6e en consid~rant les diff6rences de concentration mesur6es apr6s 2 et 20 minutes (cin6tiques d'ordre 0).
Modulation in vivo Afin d'obtenir quelques informations sur le m6tabolisme de la glutamine dans les lymphocytes expos6s in vivo /t des facteurs d'agression, deux 6tudes ont 6t6 r6alis6es. Dans la premi6re, le ~4CO2 produit & partir de la [UJ4C]-glutamine a 6t6 d6termin6 chez 10 sujets ; la production de ~CO2 augmentait en r610onse /t la chirurgie, de 817 /t 1135 et 1274 pmol/2.10Ocellules/40 min. au 1er, 3° et 6~ jour respectivement ; aucun changement n'a 6t6 observ6 chez les t6moins. Dans la seconde 6tude, l'utilisation de glutamine par les lymphocytes d'athl6tes a 6t6 mesur6e avant et apr+s une course d'entrMnement de 10 000 m6tres. Chez 7 coureurs, l'utilisation de glutamine a d6clin6 significativement, en moyenne entre 103 et 131 nmol/mg de prot6ines/120 min. Ceci n'6tait pas observ6 quand les mames sujets 6taient ~tudi6s fi nouveau au repos. I1 reste /t d6terminer si la diminution de l'utilisation de glutamine par les lymphocytes en r6ponse/t un exercice important interf6re avec |'immunocomp6tence de ces cellules.
Variations inter- et intra-individuelles Les mesures r6p6t6es de l'activit6 hydrolase vis-fi-vis du dipeptide L-alanyl-L-glutamine (Ala-Gln) dans des 6chantillons plasmatiques identiques ont indiqu~ des variations intra-individuelles n6gligeables (46,6 4- 3,5 nmol.ml -~. rain ~ ; moyenne i 6cart-type, n = 7). La disparition de l'Ala-Gln ~tait accompagn6e d'une augmentation 6quimolaire des concentrations d'alanine et de glutamine, les profils des autres acides amin6s plasmatiques n'6tant pas chang6s. I1 n'y avait pas de diff6rence selon les sexes mais des variations inter-individuelles consid6rables de l'activit6 hydrolase fi 1 ~tat de jefme (fourchette : 15,5 - 46,6 nmol.mlL min-~). I1 faut remarquer que l'activit6 hydrolase 6tait diminu6e de 50% /t l'6tat post-prandial. Les explications pour cette observation incluent le fait que la provision de peptidases suit 6puis6e en raison de l'ingestion d'acides amin6s dans la di+te ou une inhibition, par un processus de r6tro-contr61e n6gatif, des peptidases /t la suite de l'augmentation des concentrations plasmatiques d'alanine et de glutamine.
Resume Ces donn~es indiquent que la glutamine joue un r6le extr~mement important dans les lymphocytes humains stimul6s in vitro et in vivo. La compr6hension de ces processus est indispensable si l'on souhaite apporter de la glutamine dans des conditions o/~ les functions lymphocytaires sont perturb+es.
Hydrolyse in vitro de peptides b chaine courte contenant de la glutamine, de la tyrosine et de la cyst~ine
Influence de la structure moleculaire L'influence de la structure mol6culaire sur l'importance de la vitesse d'hydrolyse plasmatique a 6t6 6tudi6e en mesurant l'activit6 peptidasique vis-/t-vis de six di- et tri-peptides : Ala-Gln, glycyl-L-glutamine (Gly-Gln), bis-L-alanyl-L-cystine ([Ala-Cys]2), bis-L-glycyl-cystine [(Gly-Cys]2), L-alanyl-L-tyrosine (Ala-Tyr) et glycyl-tyrosine (Gly-Tyr). Bien que les plasmas humains montraient une activit6 hydrolase mesurable vis-fi-vis de tousles peptides ~tudi~s, des differences importantes selon la structure 6talent tout/t fait 6videntes. Les plus grandes activit6s ont 6t6 observ6es pour Ala-Gln et [Ala-Cys]2 (42,6 et 51,1 nmol.ml-~.min-~, respectivement) ; ces valeurs 6taient significativement plus 61ev6es que celles mesur6es pour Gly-Gln et [Gly-Cys]2 (9,2 et 9,7 i I nmol.ml-.min respectivement). L'activit~ hydrolase contre les peptides renfermant de la tyrosine 6tait similaire (19,0 et 22,0 nmol.ml -l.min ~), ind6pendamment du fait que l'alanine ou la glycine occupe ou non la position N-terminale. Ces r6sultats indiquent que les acides amin6s constitutifs en N e t en C influencent la vitesse d'hydrolyse. La disparition des peptides 6tait accompagn6e par une augmentation 6quimolaire des concentrations des acides amin6s libres constitutifs tandis que le profil plasmatique des autres acides amin6s
Peter Stehle et Peter Fiirst Inst. Biol. Chem. A n d Nutrition, University of Hohenheirn, Stuttgart, FRG.
Les 6tudes in vivo r6alis6es sur des animaux, des volontaires humains et des patients cataboliques ont montrb de fagon formelle que les peptides synth6tiques fi cha?ne courte 6taient facilement hydrolys6s apr~s leur administration intraveineuse. Cependant, des variations consid6rables dans la cin6tique et/ou l'importance de l'assimilation des peptides impose de savoir si la structure mol6culaire du peptide influence le mode et/ou le site d'hydro|yse et ainsi d6termine leur vitesse de disparition du plasma. Le clivage intracellulaire des dipeptides a 6t6 d6montr6 aprbs leur administration ent6rale, pr6f6rentiellement au niveau des cellules r6nales et des bordures en brosse intestinales. Cette interpr6tation de l'hydrolyse intracel|ulaire apr~s apport intraveineux du peptide n6cessiterait un bilan efflux/r6absorption 6quimolaire des acides amin6s lib6r6s au niveau des tissus et des organes, un concept difficile /t accepter 6tant donn6 l'h6t6rog6n6it6 des diff6rents syst6mes de transport et des m6tabolismes interm6diaires suivis par |es diff6rents acides amin6s. La lib6ration 6quimolaire rapide des acides amin6s libres apr~s administration intraveineuse de dipeptides sugg+re au contraire 188_
DE LA GLUTAMINE (570 mg/kg/j) de glutamine. Les bilans azot6s ont 6t6 am61ior6s lorsque la glutamine 6tait ajout6e/t la nutrition parent6rale. Les concentrations de glutamine n'ont pas vari6 significativement et aucune alt6ration du m6tabolisme de l'ammoniaque n'a 6t+ observ~e. I1 apparah donc que l'administration de glutamine chez des patients de soins intensifs pr6sentant une fonction h6patique normale a des effets toxiques n6gligeables.
administrations de glutamine et il n'a pus 6t6 observ6 d'effets secondaires. Les constantes vitales n'ont pas 6t6 modifi6es de fagon consistante tout au long de l'6tude. Les concentrations plasmatiques de glutamine atteignaient leur maximum entre 30 et 45 minutes ; le pic 6tait li6/t la dose administr6e. La plus haute dose a entrain6 une augmentation des concentrations plasmatiques d'environ 1 300 ~tmol/l et la glutamin6mie est revenue progressivement ~ la normale en 4 heures. Les concentrations de glutamate et d'ammoniaque n'ont pas augment6 significativement. Les s6cr6tions d'hormone de croissance et d'insuline ont 6t6 stimul6es par l'ingestion de glutamine mais la glucagon6mie n'a pas chang6. La citrulline et l'arginine (connues pour ~tre des produits du m6tabolisme intestinal de la glutamine) ont augment+ proportionnellement fi la dose de glutamine administr6e. Le temps de demi-vie de la glutamine btait d'environ 110 minutes. Des 6tudes similaires ont 6t6 r6p6t6es en administrant la glutamine par voie intraveineuse. Les doses de glutamine 6taient de 0, 12,5 et 25 mg/kg/h, perfus6es en solution saline fi 0,2 %, pendant 4 heures. Les constantes physiologiques ont 6t6 suivies routes les heures et n'ont pas chang6 lors de la perfusion de glutamine. Aucun symptome toxique n'a ~t6 observ6. Les concentrations de glutamine ont atteint un maximum/~ 30-60 minutes apr6s le d6but de la perfusion et sont ensuite rest6es en plateau. La glutamin6mie a augment6 en fonction de la dose administr6e, de 625/t 700 gmol/1 avec la dose de 12,5 mg/kg/heure et/t 875 gmol/1 avec la dose de 25 mg/kg/heure. Le calcul des param6tres pharmacocin6tiques de la glutamine chez les trois patients qui ont regu une dose en bolus de cet acide amin6 indiquait une demi-vie de 67 rain. L'ammoniaque et les concentrations hormonales n'6taient pus significativement modifi6es mais le glutamate tendait /t augmenter 16g6rement (mais pas significativement) de faqon dose-d6pendante. Nous avons aussi 6tudi6 l'innocuitd d'une administration & long terme de glutamine ajout6e/t une nutrition parent~rale perfus6e chez des individus sains. Ceux-ci ont 6tO admis dans le centre de recherche clinique et plac6s sous nutrition intraveineuse pour une p6riode d'6tude de 5 jours. Trois essais ont @6 r6alis~s chez chaque sujet et l'intervalle entre chacun ~tait d'au moins deux semaines. La nutrition iso-azotOe iso-calorique fournissait des quantit~s ad6quates d'6nergie et de prot6ines qui variaient seulement par la quantit6 de glutamine, 0, 285 et 570 mg/kg/j. Les deux doses apportaient environ 20 et 40 g de glutamine par j o u r / t chaque sujet qui recevait environ 100 g d'acides amines par jour (1,5 g/kg). Dans deux 6tudes suppl~mentaires, nous avons administr6 57 g de glutamine par jour avec d'autres nutriments parent6raux. Des 6tudes de stabilit6 de ces solutions ont montr6 qu'elles ne g6n6raient pas de quantit6s appr6ciables d'ammoniaque quand elles 6taient conserv6es fi + 4°C pendant 7 fi 10 jours. A la temp6rature ambiante la d6gradation de la glutamine 6tait d'environ 0,1% par 24 heures et nous n'avons pus pu d6tecter d'augmentation appr6ciable des concentrations en ammoniaque dans les solutions conserv~es dans ces conditions. Aucun symptome toxique n'a 6t~ not6 et les 6valuations psychologiques qui ont 6t6 r6alis6es n'ont pus permis de d6tecter d'alt6ration des fonctions du syst+me nerveux central tout au long de l'~tude. A la fin des 5 jours de perfusion, les concentrations de glutamine 6taient d'environ 800 gmol/l, en augmentation 16g6re par rapport aux 700 gmol/l mesur~es avant la perfusion. Les concentrations d'ammoniaque et de glutamine restaient stables et n'ont pus vari6 avec la quantit~ de glutamine pr6sente dans les diff6rentes solutions. Des 6tudes similaires ont ~t~ r6alis6es chez des patients ayant subi une greffe de moelle osseuse et une irradiation corporelle totale. Cinq sujets ont regu une nutrition t6moin, quatre ont regu environ 20 g/jour (285 mg/kg/j) et cinq ont regu 40 g/j
M6tabolisme de la glutamine dans les lymphocytes humains Peter Schauder Division of Gastroenterology and Endocrinology, Department of Medicine, University of G6ttingen, FRG.
La glutamine est un m6tabolite essentiel pour la division des lymphocytes. La s6quence des 6v6nements m6taboliques dans l'activation immunologique de ces cellules est: 1) l'augmentation de la vitesse de transport des nutriments, 2) l'induction de la synth~se d'ARN, de protbines et d'ADN, suivie de la division cellulaire. Ce texte concerne les aspects du m6tabolisme de la glutamine dans les lymphocytes p6riph6riques humains en relation avec la prolif6ration cellulaire.
Isolement des cellules Les cellules mononucl~aires humaines ont 6t6 isol6es du sang veineux par centrifugation en gradient, puis purification par adh6sion des monocytes sur des godets en plastique. La pr6paration finale contenait des lymphocytes B et T avec environ 2 % de monocytes.
Transport de la glutamine La vitesse initiale de transport de la glutamine en fonction de la concentration 6tait saturable, aussi bien pour des concentrations physiologiques de chlorure de sodium que lorsque le milieu 6tait d6ficient en ions N a +. Le Km apparent 6tait de 1421~M et 180 gM, et les Vmax de 30 et 13 pmol/106 cellules/30 secondes pour le transport mesur~ respectivement avec des concentrations physiologiques et faibles en cblorure de sodium. Dans les cellules cultiv6es pendant 24 heures, en pr6sence ou non de concanavaline A (10 gg/ml), le Km apparent 6tait de 70 gM vs 90 gM et la Vmax de 73 vs 26 pmol/106 cellules/30 secondes. Le transport de [U J4 C]-glutamine (0,4 raM) en pr6sence de concentrations physiologiques de NaC1 ~tait diminu6 par l'histidine, l'asparagine, la s6rine et la leucine mais pas par l'a-m6thylamino-isobutyrate et l'acide 2-aminobicyclo-[2-2-1]-heptane-2-carboxylique. Ces r6sultats d6montrent l'existence de syst+mes de transport de haute affinit6 sodiumd6pendant et ind6pendant dans le lymphocyte humain. Le syst~me sodium-d~pendant semble impliquer des /ransporteurs similaires fi ceux des syst6mes N e t ASC d6crits dans d'autres cellules. La concanavaline A stimule le transport de glutamine en augmentant la capacit6 de transfert mais pas l'aff'mit6 pour la glutamine.
Catabolisme de la glutamine L'utilisation de la glutamine par ces cellules quiescentes ou stimul6es par les mitog6nes a 6t6 d6termin6e par la diff6rence de concentrations en glutamine dans le milieu (0,4 mM) au commencement et fi la fin d'une p6riode d'incubation de 120 rain. L'utilisation du glucose (5,6 mM dans le milieu) a ~t6 aussi not6e. L'utilisation de la glutamine et du glucose par les cellules quiescentes et stimul6es ~taient de 49 + 3 (n = 12) vs 157 ± 12 (n =12) et 261 ± 34 (n =11) vs 633 ± 46 (n = 11) nmol/2.107 cellules/120 min., indiquant une vitesse d'utilisation de la glutamine relativement plus grande que celle du glucose, bas6e sur leurs concentrations dans le milieu. 187
REUNIONS L'accumulation intracellulaire de glutamate en r6ponse aux incubations avec la glutamine 6tait de 12 4- 3 vs 97 4- 6 nmol/2.107 cellules/120 rain dans les cellules quiescentes et stimul6es indiquant que la glutaminase ne semble pas devenir une +tape limitante durant la stimulation lymphocytaire. Le m6tabolisme de la glutamine au-del/t du glutamate dans les cellules quiescentes et stimul6es, c'est/t-dire l'accumulation d'asparate (21 4- 3 vs 60 ± 10nmol/2.10:cellules/120 min.) et la production d'ammoniaque (71 4- 8 vs 146 ± 19 nmo|/2.107 cellules/120 min.) et de ~4CO2 /t partir [UJ~C]-glutamine (984 4- 88 vs 4548 4- 346 pmol/2.107 cellules/40 min..) sugg~re que la glutamine joue un r61e important dans l'apport 6nerg6tique des lymphocytes stimul6s.
une hydrolyse extracellulaire. Une activit6 hydrolase tr6s
importante dans le plasma, de m~me qu'un travail r6cent d~crivant la d6gradation h6patique des dipeptides par des enzymes situ~es au niveau de la membrane plasmique sinuso,dale du foie, affirme aussi l'id6e d'une hydrolyse extracellulaire. De m~me, une hydrolase de dipeptides a r6cemment ~t6 identifi6e au niveau des membranes plasmiques de muscle squelettique. Les mesures in vitro d'activit~ plasmatique d'hydrolase peuvent donc faciliter l'appr~ciation de la capture et de l'utilisation in vivo des dipeptides.
Essais in vitro de I'activite hydrolase plasmatique Du sang art6riel humain, pr6lev6 dans des conditions de jefine ou en situation post-prandiale, a 6t6 imm6diatement centrifug6 (1 550g, 20min.). Des 6chantillons de plasma (500 lal) ont 6t6 incub6s avec 50 gl de solution de peptides (12 et 24 mM en milieu salin) pendant des temps vari6s (jusqu'/t 1 heure) fi 37°C. Les concentrations d'acides amin6s et de peptides ont 6t6 mesur6es dans le surnageant non prot+ique par chromatographie en phase inverse en utilisant une d6rivation pr6-colonne avec l'orthophtalald6hyde/3-MPA ou avec le chlorure de dansyl. L'activit6 hydrolase maximum (Vmax) a ~t~ calcul6e en consid~rant les diff6rences de concentration mesur6es apr6s 2 et 20 minutes (cin6tiques d'ordre 0).
Modulation in vivo Afin d'obtenir quelques informations sur le m6tabolisme de la glutamine dans les lymphocytes expos6s in vivo /t des facteurs d'agression, deux 6tudes ont 6t6 r6alis6es. Dans la premi6re, le ~4CO2 produit & partir de la [UJ4C]-glutamine a 6t6 d6termin6 chez 10 sujets ; la production de ~CO2 augmentait en r610onse /t la chirurgie, de 817 /t 1135 et 1274 pmol/2.10Ocellules/40 min. au 1er, 3° et 6~ jour respectivement ; aucun changement n'a 6t6 observ6 chez les t6moins. Dans la seconde 6tude, l'utilisation de glutamine par les lymphocytes d'athl6tes a 6t6 mesur6e avant et apr+s une course d'entrMnement de 10 000 m6tres. Chez 7 coureurs, l'utilisation de glutamine a d6clin6 significativement, en moyenne entre 103 et 131 nmol/mg de prot6ines/120 min. Ceci n'6tait pas observ6 quand les mames sujets 6taient ~tudi6s fi nouveau au repos. I1 reste /t d6terminer si la diminution de l'utilisation de glutamine par les lymphocytes en r6ponse/t un exercice important interf6re avec |'immunocomp6tence de ces cellules.
Variations inter- et intra-individuelles Les mesures r6p6t6es de l'activit6 hydrolase vis-fi-vis du dipeptide L-alanyl-L-glutamine (Ala-Gln) dans des 6chantillons plasmatiques identiques ont indiqu~ des variations intra-individuelles n6gligeables (46,6 4- 3,5 nmol.ml -~. rain ~ ; moyenne i 6cart-type, n = 7). La disparition de l'Ala-Gln ~tait accompagn6e d'une augmentation 6quimolaire des concentrations d'alanine et de glutamine, les profils des autres acides amin6s plasmatiques n'6tant pas chang6s. I1 n'y avait pas de diff6rence selon les sexes mais des variations inter-individuelles consid6rables de l'activit6 hydrolase fi 1 ~tat de jefme (fourchette : 15,5 - 46,6 nmol.mlL min-~). I1 faut remarquer que l'activit6 hydrolase 6tait diminu6e de 50% /t l'6tat post-prandial. Les explications pour cette observation incluent le fait que la provision de peptidases suit 6puis6e en raison de l'ingestion d'acides amin6s dans la di+te ou une inhibition, par un processus de r6tro-contr61e n6gatif, des peptidases /t la suite de l'augmentation des concentrations plasmatiques d'alanine et de glutamine.
Resume Ces donn~es indiquent que la glutamine joue un r6le extr~mement important dans les lymphocytes humains stimul6s in vitro et in vivo. La compr6hension de ces processus est indispensable si l'on souhaite apporter de la glutamine dans des conditions o/~ les functions lymphocytaires sont perturb+es.
Hydrolyse in vitro de peptides b chaine courte contenant de la glutamine, de la tyrosine et de la cyst~ine
Influence de la structure moleculaire L'influence de la structure mol6culaire sur l'importance de la vitesse d'hydrolyse plasmatique a 6t6 6tudi6e en mesurant l'activit6 peptidasique vis-/t-vis de six di- et tri-peptides : Ala-Gln, glycyl-L-glutamine (Gly-Gln), bis-L-alanyl-L-cystine ([Ala-Cys]2), bis-L-glycyl-cystine [(Gly-Cys]2), L-alanyl-L-tyrosine (Ala-Tyr) et glycyl-tyrosine (Gly-Tyr). Bien que les plasmas humains montraient une activit6 hydrolase mesurable vis-fi-vis de tousles peptides ~tudi~s, des differences importantes selon la structure 6talent tout/t fait 6videntes. Les plus grandes activit6s ont 6t6 observ6es pour Ala-Gln et [Ala-Cys]2 (42,6 et 51,1 nmol.ml-~.min-~, respectivement) ; ces valeurs 6taient significativement plus 61ev6es que celles mesur6es pour Gly-Gln et [Gly-Cys]2 (9,2 et 9,7 i I nmol.ml-.min respectivement). L'activit~ hydrolase contre les peptides renfermant de la tyrosine 6tait similaire (19,0 et 22,0 nmol.ml -l.min ~), ind6pendamment du fait que l'alanine ou la glycine occupe ou non la position N-terminale. Ces r6sultats indiquent que les acides amin6s constitutifs en N e t en C influencent la vitesse d'hydrolyse. La disparition des peptides 6tait accompagn6e par une augmentation 6quimolaire des concentrations des acides amin6s libres constitutifs tandis que le profil plasmatique des autres acides amin6s
Peter Stehle et Peter Fiirst Inst. Biol. Chem. A n d Nutrition, University of Hohenheirn, Stuttgart, FRG.
Les 6tudes in vivo r6alis6es sur des animaux, des volontaires humains et des patients cataboliques ont montrb de fagon formelle que les peptides synth6tiques fi cha?ne courte 6taient facilement hydrolys6s apr~s leur administration intraveineuse. Cependant, des variations consid6rables dans la cin6tique et/ou l'importance de l'assimilation des peptides impose de savoir si la structure mol6culaire du peptide influence le mode et/ou le site d'hydro|yse et ainsi d6termine leur vitesse de disparition du plasma. Le clivage intracellulaire des dipeptides a 6t6 d6montr6 aprbs leur administration ent6rale, pr6f6rentiellement au niveau des cellules r6nales et des bordures en brosse intestinales. Cette interpr6tation de l'hydrolyse intracel|ulaire apr~s apport intraveineux du peptide n6cessiterait un bilan efflux/r6absorption 6quimolaire des acides amin6s lib6r6s au niveau des tissus et des organes, un concept difficile /t accepter 6tant donn6 l'h6t6rog6n6it6 des diff6rents syst6mes de transport et des m6tabolismes interm6diaires suivis par |es diff6rents acides amin6s. La lib6ration 6quimolaire rapide des acides amin6s libres apr~s administration intraveineuse de dipeptides sugg+re au contraire 188_