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Expression de la gelsoline dans les cancers colorectaux humains sporadiques et étude de ses propriétés invasives dans les cellules cancéreuses coliques humaines
XXIVe réunion du CECED
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C21
EXPRESSION DE LA GELSOLINE DANS LES CANCERS COLORECTAUX HUMAINS SPORADIQUES ET ÉTUDE DE SES PROPRIÉTÉS INVASIVES DANS LES CELLULES CANCÉREUSES COLIQUES HUMAINES
RÉGULATION ÉPIGÉNÉTIQUE DES GENES DE MUCINES 11P15 (MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC6) DANS DES LIGNÉES ÉPITHÉLIALES CANCÉREUSES ET DANS LES TISSUS DE MALADES
F Gay, Y Estornes, JY Scoazec, JC Saurin, J Abello INSERM U45, IFR 62, Université de Médecine Laënnec, 7 rue G. Paradin, 69008 Lyon.
A Vincent, JL Desseyn, P Pigny, I Van Seuningen Unité INSERM N°560, Place de Verdun, 59045 Lille Cedex.
Introduction : The human mucin genes MUC2, MUC5AC, MUC5B and MUC6 are clustered on the p15.5 arm of chromosome 11 in a GC-rich area known to be a hot spot of methylation in cancer. These four genes encode large secreted gel-forming mucins that participate in protection of underlying epithelia. Alteration in their expression in cancers will have consequences for epithelium homeostasis and maintenance of an efficient barrier to various aggressions.
Introduction : La motilité cellulaire joue un rôle essentiel dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques, en particulier dans l’invasion tumorale et la formation de métastases. Le remodelage dynamique du cytosquelette d’actine par les protéines de liaison à l’actine (actin binding proteins, ABPs) entraîne des modifications de la morphologie cellulaire et la formation de structures pro-invasives de type lamellipode et filopode, permettant l’acquisition d’une motilité cellulaire propre. La gelsoline, l’un des représentants principaux des ABPs, module la longueur des filaments d’actine par ses activités de coupure et de coiffe, ce qui lui confère in fine un rôle clé dans le remodelage du cytosquelette et suggère une implication forte dans la motilité cellulaire des cellules tumorales. Différents travaux ont montré une perte d’expression de la gelsoline dans les cancers du poumon, du sein et du rein.
Objectif : The organization as a cluster in a hot spot of methylation and the structure of their promoters led us to evaluate the influence of DNA methylation and histone acetylation on their expression in epithelial cancer cell lines and tissue patients. Material and methods : Influence of methylation and histone acetylation was evaluated by treating pre- and post-confluent cells with the demethylating agent 5-aza-2’deoxycytidine (5 μM, 72 h) or with the histone deacetylase inhibitor, trichostatin A (0.3 μM, 24 h), respectively. Level of mucin mRNA and protein expression were measured by RTPCR and immunochemistry, respectively. Mapping of the methylated cytosines in the promoters was performed by MSPCR and bisulfite-treated DNA sequencing both in cell lines and tissue patients.
Objectifs : Le but de cette étude a donc été de rechercher le niveau d’expression de la gelsoline tout au long de la séquence adénome-cancer et définir son implication dans le processus invasif (migration et invasion). Matériel et méthodes/Résultats : Par immunohistochimie indirecte nous avons mis en évidence une perte d’expression de la gelsoline dans une large série d’adénocarcinomes coliques humains. A partir de lésions néoplasiques précancéreuses à différents stades de progression tumorale, nous avons précisé le caractère précoce de cette perte d’expression, qui survient dans les adénomes lors de la transition entre la dysplasie de bas grade et la dysplasie de haut grade. La perte d’expression dans les adénocarcinomes coliques a été confirmée par Northern blot sur des tumeurs provenant de 10 malades. La disparition de la gelsoline a également été démontrée par immunocytochimie et Western blot dans une majorité de lignées cellulaires cancéreuses coliques humaines testées. L’étude du pouvoir invasif a été réalisée à l’aide d’un système validé de chambre de Boyden modifiée (Neuroprobe). La déplétion en gelsoline par interférence par l’ARN dans la lignée Isreco1 contenant la protéine endogène entraîne une diminution significative de la migration basale et stimulée par l’epidermal growth factor (EGF) de ces cellules ainsi que de l’invasion stimulée par l’EGF. En parallèle, la transfection stable d’un plasmide codant pour la gelsoline dans la lignée LoVo, dépourvue de la protéine endogène, diminue significativement la migration stimulée par l’EGF. Les études d’invasion sont actuellement en cours.
Results : MUC2 and MUC5B are highly submitted to epigenetic regulation in epithelial cancers cells and their level of methylation is directly correlated to the state of differentiation of the cells. The promoter of MUC2 is characterized by sitespecific methylation of a few CpG sites whereas MUC5B is silenced by extensive hypermethylation throughout its promoter. Compared to MUC2 and MUC5B, the promoter of MUC5AC is not very rich in CpG sites and was shown to be rarely regulated by methylation. We showed that the MUC6 promoter possesses a highly methylated distal region that does not interfere with its expression. Moreover, the proximal CpG island located upstream of the transcription start site was not submitted to methylation. Correlation between the methylation of mucin gene promoters and repression of their expression in bronchial tumors from patients with lung cancers confirmed our in vitro data. Conclusion : This first wide study about the influence of methylation and acetylation on the expression of the four mucin genes belonging to the 11p15 cluster points out an important role for epigenetics in regulating the 11p15 mucin genes in epithelial cancers. Evaluation of methylation status of mucin genes may thus become a promising tool as a diagnostic and/or prognostic marker in epithelial cancers.
Conclusion : Ce travail suggère que la perte d’expression de la gelsoline dans les tumeurs colorectales correspond à un rôle oncosuppresseur de la protéine. Nous avons également démontré in vitro l’importance de la gelsoline dans la motilité des cellules tumorales coliques et souligné le rôle complexe de cette protéine dans ce processus. Mots-clés : Cancer colorectal, gelsoline, expression, invasion, migration.
Mots-clés : Mucines, cancer, epigénétique, méthylation, acétylation. 710
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EXPRESSION DE LA GELSOLINE DANS LES CANCERS COLORECTAUX HUMAINS SPORADIQUES ET ÉTUDE DE SES PROPRIÉTÉS INVASIVES DANS LES CELLULES CANCÉREUSES COLIQUES HUMAINES
RÉGULATION ÉPIGÉNÉTIQUE DES GENES DE MUCINES 11P15 (MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC6) DANS DES LIGNÉES ÉPITHÉLIALES CANCÉREUSES ET DANS LES TISSUS DE MALADES
F Gay, Y Estornes, JY Scoazec, JC Saurin, J Abello INSERM U45, IFR 62, Université de Médecine Laënnec, 7 rue G. Paradin, 69008 Lyon.
A Vincent, JL Desseyn, P Pigny, I Van Seuningen Unité INSERM N°560, Place de Verdun, 59045 Lille Cedex.
Introduction : The human mucin genes MUC2, MUC5AC, MUC5B and MUC6 are clustered on the p15.5 arm of chromosome 11 in a GC-rich area known to be a hot spot of methylation in cancer. These four genes encode large secreted gel-forming mucins that participate in protection of underlying epithelia. Alteration in their expression in cancers will have consequences for epithelium homeostasis and maintenance of an efficient barrier to various aggressions.
Introduction : La motilité cellulaire joue un rôle essentiel dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques, en particulier dans l’invasion tumorale et la formation de métastases. Le remodelage dynamique du cytosquelette d’actine par les protéines de liaison à l’actine (actin binding proteins, ABPs) entraîne des modifications de la morphologie cellulaire et la formation de structures pro-invasives de type lamellipode et filopode, permettant l’acquisition d’une motilité cellulaire propre. La gelsoline, l’un des représentants principaux des ABPs, module la longueur des filaments d’actine par ses activités de coupure et de coiffe, ce qui lui confère in fine un rôle clé dans le remodelage du cytosquelette et suggère une implication forte dans la motilité cellulaire des cellules tumorales. Différents travaux ont montré une perte d’expression de la gelsoline dans les cancers du poumon, du sein et du rein.
Objectif : The organization as a cluster in a hot spot of methylation and the structure of their promoters led us to evaluate the influence of DNA methylation and histone acetylation on their expression in epithelial cancer cell lines and tissue patients. Material and methods : Influence of methylation and histone acetylation was evaluated by treating pre- and post-confluent cells with the demethylating agent 5-aza-2’deoxycytidine (5 μM, 72 h) or with the histone deacetylase inhibitor, trichostatin A (0.3 μM, 24 h), respectively. Level of mucin mRNA and protein expression were measured by RTPCR and immunochemistry, respectively. Mapping of the methylated cytosines in the promoters was performed by MSPCR and bisulfite-treated DNA sequencing both in cell lines and tissue patients.
Objectifs : Le but de cette étude a donc été de rechercher le niveau d’expression de la gelsoline tout au long de la séquence adénome-cancer et définir son implication dans le processus invasif (migration et invasion). Matériel et méthodes/Résultats : Par immunohistochimie indirecte nous avons mis en évidence une perte d’expression de la gelsoline dans une large série d’adénocarcinomes coliques humains. A partir de lésions néoplasiques précancéreuses à différents stades de progression tumorale, nous avons précisé le caractère précoce de cette perte d’expression, qui survient dans les adénomes lors de la transition entre la dysplasie de bas grade et la dysplasie de haut grade. La perte d’expression dans les adénocarcinomes coliques a été confirmée par Northern blot sur des tumeurs provenant de 10 malades. La disparition de la gelsoline a également été démontrée par immunocytochimie et Western blot dans une majorité de lignées cellulaires cancéreuses coliques humaines testées. L’étude du pouvoir invasif a été réalisée à l’aide d’un système validé de chambre de Boyden modifiée (Neuroprobe). La déplétion en gelsoline par interférence par l’ARN dans la lignée Isreco1 contenant la protéine endogène entraîne une diminution significative de la migration basale et stimulée par l’epidermal growth factor (EGF) de ces cellules ainsi que de l’invasion stimulée par l’EGF. En parallèle, la transfection stable d’un plasmide codant pour la gelsoline dans la lignée LoVo, dépourvue de la protéine endogène, diminue significativement la migration stimulée par l’EGF. Les études d’invasion sont actuellement en cours.
Results : MUC2 and MUC5B are highly submitted to epigenetic regulation in epithelial cancers cells and their level of methylation is directly correlated to the state of differentiation of the cells. The promoter of MUC2 is characterized by sitespecific methylation of a few CpG sites whereas MUC5B is silenced by extensive hypermethylation throughout its promoter. Compared to MUC2 and MUC5B, the promoter of MUC5AC is not very rich in CpG sites and was shown to be rarely regulated by methylation. We showed that the MUC6 promoter possesses a highly methylated distal region that does not interfere with its expression. Moreover, the proximal CpG island located upstream of the transcription start site was not submitted to methylation. Correlation between the methylation of mucin gene promoters and repression of their expression in bronchial tumors from patients with lung cancers confirmed our in vitro data. Conclusion : This first wide study about the influence of methylation and acetylation on the expression of the four mucin genes belonging to the 11p15 cluster points out an important role for epigenetics in regulating the 11p15 mucin genes in epithelial cancers. Evaluation of methylation status of mucin genes may thus become a promising tool as a diagnostic and/or prognostic marker in epithelial cancers.
Conclusion : Ce travail suggère que la perte d’expression de la gelsoline dans les tumeurs colorectales correspond à un rôle oncosuppresseur de la protéine. Nous avons également démontré in vitro l’importance de la gelsoline dans la motilité des cellules tumorales coliques et souligné le rôle complexe de cette protéine dans ce processus. Mots-clés : Cancer colorectal, gelsoline, expression, invasion, migration.
Mots-clés : Mucines, cancer, epigénétique, méthylation, acétylation. 710