Recherches biochimiques sur l'oogene`se

DEVELOPMENTAL

24, 143-165 (1971)

BIOLOGY

Recherches I. Synthhse

biochimiques

et accumulation

du crapaud

sur I’oogenke

du RNA pendant

sud-africain

Xenopus

I’oogenGse

laevis

M. MAIRY’ ET H. DENIS Accept6 le 30 septembre 1970 INTRODUCTION

L’oocyte miir d’amphibien diffke d’une cellule somatique par sa taille considerable et par sa tres grande richesse en materiaux de reserve. Ceux-ci sont de nature fort diverse : proteique, lipidique, glucidique et miner-ale. L’oeuf renferme aussi une grande quantitk de RNA. Celui-ci est en majeure partie constitue par du RNA ribosomique 28 s et 18 s (Brown et Littna, 1964b). Ensemble, le RNA ribosomique 5 s, le RNA de transfert et le D-RNA ne forment que quelques pour cent du contenu ribonuckique tota de I’oeuf (Brown et Littna, 1966a, b ; Davidson et al., 1966). Ce dernier est done particulierement riche en RNA ribosomique et pauvre en RNA de transfert. Le problkme se pose de savoir si ce deskquilibre s’instaure d&s le debut de l’oogenkse ou si, au contraire, la production de certaines classes de RNA est plus intense a certains moments et plus reduite a d’autres. Pour rkpondre a cette question, nous avons etudii! la vitesse d’apparition des principales classes de RNA durant la croissance de l’oocyte. 11 est apparu que la synth’ese des dif&rents types de RNA n’est absolument pas coordonnke pendant l’oogenese. L’oocyte commence par fabriquer de grandes quantites de RNA de faible poids moleculaire (RNA 5 s et RNA de transfert), puis il accumule surtout du RNA 28 s et 18 s. MATERIEL

A Obtention

des diffh-entes

ET METHODES

classes d’oocytes

Chez le crapaud sud-africain Xenopus kzeuis, l’oogenkse est un processus continu. Les ovaires d’une femelle mlire renferment des oocytes de toutes tailles. On trouve de petits oocytes de couleur Claire, oti la vitellogenese n’a pas encore debut6 et des oocytes de couleur foncbe, oti le pigment et le vitellus sont en train de s’accumu’ Aspirante du Fonds Natimal de la Fbxherche Place Delcour, 17, B-4000 Likge, Belgique. Copyright

r’ 1971 by Academic

Press, Inc.

143

Scientifique.

Adresse des auteurs :

144

MAIRY

ET DENIS

ler. NOUS avons pu &parer les oocytes et les trier de mani’ere a obtenir quatre classes de tailles differentes. Les ovaires, dilaceres avec des pinces, sont places pendant quelques minutes dans du Ringer contenant de la pronase 1 mg/ml, puis dans du Ringer contenant de 1’EDTA 0,05 M. Les oocytes resistent t&s bien a ce traitement, mais le tissu conjonctif et les capillaires se detachent, ainsi qu’une partie des cellules folliculeuses. Les oocytes &pares sont alors passes sur 4 tamis dont les mailles ont l’ecartement suivant : 1 mm, 0,70 mm, Of50 mm et 0,25 mm. Les principaux caracteres des 4 classes d’oocytes ainsi obtenues sont present& dans le Tableau 1. Les oocytes de classe 4 ont le meme volume que les oeufs ; ils sont done p&s a subir l’ovulation. Les oocytes proviennent soit de femelles qui n’ont pas pondu depuis plus de deux mois, soit de femelles qui ont pondu 5 a 8 jours avant le prelkvement. On provoque la ponte en injectant dans les sacs lymphatiques de la femelle 1000 unites internationales de gonadotropine chorionique (Sigma). Les oocytes de diam’etre inferieur a 0,25 mm ne peuvent etre obtenus en quantites suffisantes a partir de femelles mdres. Pour nous procurer des oocytes de petite taille, nous avons prelevi! des ovaires de femelles immatures, que nous avons utilises tels quels, sans &parer les oocytes. Nous avons, en effet, constate que les femelles d’une grosseur determinee renferment dans leurs ovaires des oocytes de taille rclativement homogene. C’est ainsi que chez une femelle de 2 cm de long, 60% des oocytes en croissance active ont 55 a 80 p de diametre et les 40% restants ont un diametre compris entre 40 et 55 p et entre 80 et 120 Jo. Les oocytes de diametre inferieur 1 40 p, ainsi que l’ensemble des cellules folliculeuses, des cellules Bpitheliales et du tissu conjonctif de l’ovaire reprbsentent moins de 5 % du volume occupe par les oocytes de 40 h 120 ,J. I1 existe une relation lineaire relativement precise entre la taille de la femelle et le diametre moyen des oocytes que renferment ses ovaires. Pour obtenir des oocytes de volume croissant, nous avons done utilise des femelles de plus en plus grosses. Nous avons choisi des femelles de 3 tailles : 1,5 cm, 2,5 cm et 4 cm de long. Le diametre moyen et les diametres extremes des oocytes fournis par ces femelles sont donnes dans le Tableau 1. Bien entendu, les mesures indiquees sont assez approximatives et sujettes h des variations d’une femelle a l’autre. B Marquage

et extraction

du RNA

Les oocytes isoles et les ovaires des femelles immatures sont rinks a plusieurs reprises dans du Ringer-phosphate, pH 7,8 avant d’etre

145

RNA ET OOGENESE DE XenopusLaeuis

DEFINITION

TABLEAU 1 DES CLASSES D’OVAIRES ET D’OOCYTES UTILIS~S

DANS CE TRAVAIL

Imgueur de la fern& (bouche-

ChSW

cloaque)

Ovaires

Occytes

trmj

Diam&tres extr6mes des oocrt=

(P)

Diametre ¥ des oocytes

M

1

1, 5

20-80

50

2 3 1 2

2, 5 4, 0 >8 >8

50-140 go-200 250-500 500-700

90 150 315 600

3 4

>8 >8

700-1.000 1.000-1.200

850 1.100

Volume relatif des oocytes

Cara&res des mcytes Vitellus

1 petit

-

1 ff

61 accrois27 sement

grand accrois4.900 sement 10.500 1 . ;t

Pigmerit

-

++ +++ +++

-

t + +

incubes pendant 4 heures a 22-24°C dans ce meme milieu addition& de 100 pCi/ml de “H-guanosine (3 a 9 Ci/mM) et de 50 pg/ml de streptomycine et de penicilline. Les ovaires et les oocytes sont alors rinks plusieurs fois dans du Ringer, puis congeles a -25% jusqu’au moment de l’extraction. Le marquage au “‘P se fait dans les memes conditions, mais le Ringer est tamponne au moyen de tris, au lieu de phosphate. Pour marquer le RNA embryonnaire, on expose les embryons pendant une heure a du ‘*C02, suivant la technique de Cohen (1954). Cinq impulsions sont donnees h un jour d’intervalle. Comme les precurseurs du RNA restent radioactifs au moins 12 heures apres chaque impulsion (Denis, 1966), le marquage est virtuellement continu. Le RNA est extrait par le pro&de au dodecylsulfate-phenol froid de Brown et Littna (1964a). La purification et toutes les analyses sont faites a 0°C. C Dosage du RNA duns les oocytes

11n’est pas possible de doser directement le RNA dans les oocytes par le test a l’orcinol (Mejbaum, 1939). En effet, des contaminants interferent avec la reaction, qui ne presente pas la couleur verte &pique. Au lieu de doser directement le RNA, nous l’avons purifii! a partir d’un nombre connu d’oocytes, en Bvitant toute perte lors des deproteinations et des precipitations a l’ethanol. La quantite de RNA extraite est determinee par mesure de la densite optique a 260 nm. D Analyse du RNA Colonnes de Sephadex. Le RNA, dissous dans 1 ml de tampon acetate 0,Ol M, pH 5, est place sur une colonne de Sephadex G-100 de

146

MAIRY

ET DENIS

90 cm X 2,5 cm. L’itlution est assuree par un flux constant (9 ml/ heure) de tampon acetate 0,Ol M, pH 5, contenant 5 pg/ml de sulfate de polyvinyle et 200 pg/ml de NaN, . Des fractions de 2,5 ml sont prelevees automatiquement a la sortie de la colonne. Dans les cas oh la quantite de RNA a analyser est inferieure a 1 mg, on emploie une colonne de 110 cm x 1,2 cm et l’on reduit le volume des fractions Q 1 ml. Pour chaque fraction, on determine la densite optique (D.O.) h 260 nm, ainsi que la radioactivite apres addition de 100 pg de RNA de levure (entraineur), precipitation h l’acide trichloracetique 5% et filtration sur Millipore. Le compteur a scintillation employe (Philips) corrige automatiquement l’affaiblissement lumineux (quenching) propre h chaque echantillon et fournit les mesures de radioactivite en d&integrations par minute. Gradients de saccharose. L’analyse du RNA en gradient de saccharose est faite suivant le procede de Brown et Littna (1964a). Apres la centrifugation, on preleve des fractions de 1 ml, dont on mesure la densite optique et la radioactivite, comme decrit ci-dessus. E Dkterminution

de la composition

en bases du RNA

Les Bchantillons de RNA sont d’abord hydrolyses au moyen de KOH 0,3 N pendant 15 heures h 37’C. Les nucleotides sont ensuite purifies sur charbon active et &pares par chromatographie sur papier suivant le pro&de de Lane (1963). On localise les taches formees par les nucleotides par examen du chromatogramme dans l’ultraviolet. On mesure alors soit la radioactivite des taches, soit la quantite de nucleotide present dans chacune d’elles apres Ablution au moyen d’ammoniaque 0,l M. RESULTATS

A ContrOles microscopiques

et autoradiographiques

Le vert de methyle-pyronine colore violemment en rouge les oocytes contenus dans les ovaires de femelles immatures. Cette observation ne fait que reproduire celles de Brachet (1944 ; 1960). Tous les oocytes de 30 p et plus presentent de nombreux nucleoles. Les cellules folliculeuses, epitheliales, conjonctives, ainsi que les hematies sont a peine teintees par la pyronine. La concentration du RNA est done beaucoup plus forte dans les oocytes que dans les autres cellules de l’ovaire. Comme les oocytes forment au moins 95% du volume de la glande, on peut conclure que la quasi-totalitg du RNA extrait des ovaires entiers provient des oocytes. En revanche,

RNA ET OOGENESE

DE Xenopus Laevis

147

les cellules de la lignee germinale ne sont pas les seules a synthb tiser du RNA. En effet, les autoradiographies de coupes d’ovaires exposes pendant 4 heures a la “H-guanosine font apparaitre une forte densite de grains au-dessus des vesicules germinatives et des cellules folliculeuses. Les cellules conjonctives et les hematies sent. t&s peu marquees. La radioactivite presente dans le RNA extrait d’ovaires entiers ne provient done pas exclusivement des oocytes. Dans les ovaires de classe 1, la contribution des cellules somatiques a la radioactivite incorporee dans le RNA parait au moins 6gale h celle des cellules germinales. Dans les ovaires de classes 2 et 3, la contribution des cellules somatiques est moindre, mais difficile a estimer car elle varie d’un oocyte et d’une femelle h l’autre. Parmi les oocytes de classe 1 isoles a partir de femelles mdres, beaucoup sont encore entoures d’une gaine complete de cellules folliculeuses. Cette gaine s’observe plus rarement autour des oocytes de taille superieure : la majorite des oocytes de classes 3 et 4 sont depourvus de cellules folliculeuses. L’examen autoradiographique d’oocytes isoles par un traitement a la pronase et h l’EDTA, puis incubb in vitro en presence de 3H-uridine montre que les cellules folliculeuses non eliminees par le traitement prikite incorporent une quantitg de radioactivite tout a fait negligeable par rapport aux oocytes eux-memes. B Analyse du RNA sur colonne de Sephadex G-100 La filtration sur colonne de Sephadex G-100 &pare le RNA d’ovaires et d’oocytes en 3 pits (Figs. 1 et 2). Le premier pit contient le RNA de poids moleculaire eleve, non retard6 par le Sephadex. Les pits 2 et 3 sont form& par des petites molecules de RNA. Un quatrieme pit sort de la colonne aux environs du tube 160 ; il correspond aux nucleotides qui n’ont pas Cte completement elimines par les precipitations a l’ethanol. Nous n’avons trouvi! aucune trace du RNA ‘acido-soluble’ signale par Davidson et al. (1964) dans les oocytes de x&rope. La repartition du RNA entre les 3 pits fournis par les colonnes de Sephadex varie fortement au tours de l’oogenese (Tableau 2). L’importance du pit 2 est maximale dans les ovaires de classe 3 ; elle est beaucoup moindre dans les oocytes et diminue a mesure que ceux-ci grossissent. Le pit 3 forme plus du tiers du RNA total present dans les ovaires, mais seulement 7% dans les oocytes de classe 1 et 2,2% dans les oocytes de classes 2 a 4 (Figs. 1 et 2 et Tableau 2). Dans le RNA extrait a partir de ribosomes d’oocytes, la

MAIRY ET DENIS

148

TUBE

NO

TUBE

NO

25000

FIG. 1. Analyse sur colonne de Sephadex G-100 du RNA extrait d’ovaires de femelles immatures. En A, 200 pg de RNA marquk a la “H-guanosine pendant 4 heures ont 6ttB placb sur une colonne de 110 cm x 1,2 cm. Fractions de 1 ml. En B et C, 2 mg de RNA marqu6 de la m&me manikre ont Btk places sur une colonne de 90 cm x 2,5 cm. Fractions de 2,5 ml.

contribution du pit 2 a la densite optique totale est de 1,9% et celle du pit 3 est trop faible pour btre mesuree avec precision (Tableau 2). Le Tableau 3 montre l’accumulation des differentes classes de RNA dans les oocytes en periode de grand accroissement. Les chiffres figurant sur le Tableau 3 ont et6 obtenus en multipliant la teneur en RNA de chaque classe d’oocytes par les pourcentages present& sur le Tableau 2. On remarquera que les oocytes de stade 4 contiennent a peu pres autant de RNA que les oeufs non fecondb

RNA ET OOGENESE

149

DE Xenopus Laeuis

(4 rg ; Brown et Littna, 1964a) et que l’accumulation du RNA est loin d’etre parallkle B l’accroissement de volume. Le contenu en RNA du pit, est plus que dCcuplC entre le stade 1 et le stade 4 ; dans le mi+me temps, le contenu du pit 2 est h peine double et celui du pit 3 est tripk. Ceci montre clairement que, dans les oocytes de 375 h 1100 CLde diam’etre, c’est la production du RNA de poids mokculaire klevk qui est la plus forte. La synth’ese du RNA contenu dans le pit 3 est plus active que celle du RNA formant le pit 2. Ceci Concorde avec les rksultats des expkriences de marquage, oh l’on

5.0

40

50

60 TUBE

70 No

80

90

40

50

60 TUBE

70 NO

80

90

FIG. 2. Analyse SW colonne de Sephadex G-100 du RNA extrait d’oocytes de classes 1 B 4. Les oocytes proviennent de femelles qui ont pondu depuis environ une semaine. Deux mg de RNA marqub $ la “H-guanosine pendant 4 heures ont &tB placbs sur une colonne de 90 cm X 2,5 cm. Fractions de 2,5 ml.

150

MAIRY

ET DENIS

TABLEAU R&uM~

% de la densite optique totale

Classe

Pit 1

Oocytes

Ovaires

32, 28, 25, 82, 94, 95, 96, 98, 88,

1 2 3

Embryons

2

DES ANALYSES SUR COLONNE DE SEPHADEX

1 2 3 4 Ribosomes stade 35

9 5 0 7 3 2 0 1 4

Classe

DE RNA

Volume relatif des oocytes

1 2 3 4

1 4 12 25

28, 34, 39, 10, 3,

38, 37, 35, 7,

4 5 8 3 5

I 0 2 0

2, 2 2, 2 2, 2

2, 6 1, 8 1, 9 2, 3

-

9, 3

3

TABLEAU QUANTF~

Pit 3

Pit 2

PR&ENT

DANS LES OOCYTES

Quantit8 Pit 1

de RNA par oocyte (pg) Pit 2 0,046 0,068 0,096 0,080

0,372 1,820 3,530 4,210

Pit 3 0,032 0,042 0,082 0,098

voit que le pit 3 accumule beaucoup plus de radioactivitb que le pit 2 (Fig. 2). Les profils de radioactivite fournis par le RNA d’ovaires et d’oocytes suivent a peu pres parfaitement les profils de densite optique (Figs. 1 et 2). Dans quelques cas cependant, on observe un leger decalage entre les deux profils au niveau du pit 3 (Fig. 1, A, B, C et Fig. 2, A et C). La quantite de radioactivite prbente dans les pits 2 et 3 forme 1 peu pres 50% du total dans le RNA d’ovaires et 10 a 15% dans le RNA d’oocytes (Figs. 1 et 2). Le RNA d’embryons marques de facon continue au ‘“CO, fournit Bgalement 3 pits qui co’incident avec ceux que l’on obtient a partir d’ovaires (Fig. 3). C Identification Sephudex

des pits

obtenus

par

filtration

sur colonne

de

Le premier pit sortant des colonnes de Sephadex contient certainement du RNA ribosomique 28 s et 18 s (Fig. 4, A). Les pits 2 et 3

RNA ET OOGENESE

151

DE Xenopus Lueuis

!5000

!O 000

I

E. cn -. 15000 5 . I-. 10000 $ r 5000

40

50

60

70

I

TUBE No

FIG. 3. Analyse sur colonne de Sephadex G-100 (90 cm X 2,5 cm) d’un melange de RNA embryonnaire marque et de RNA non marque d’ovaires. Fractions de 2,5 ml. On a melange, avant d’en extraire le RNA, 10 ovaires de classe 2 et 80 Wards (stade 40) marques de facon continue au “COz.

Iwo 1.0. icco 3coo 05 low

FIG. 4. Centrifugation en gradient de saccharose du RNA provenant des pits 1 (A), 2 (B) et 3 (C), &pares par la colonne de Sephadex G-100. Un mg de RNA extrait d’ovaires de classe 2 marques pendant 4 heures a la ‘H-guanosine a d’abord BtB analyse sur colonne de Sephadex. Chacun des 3 pits obtenus a Bte concentre par Bvaporation, puis place sur un gradient de saccharose 5-20 %o et centrifuge a 24.000 tours/ min. pendant 15 heures a 0°C.

MAIRY

152

ET DENIS

0.7 0.6

I

E’ 0,5

0 f-7. VI -.

sit 6 d

0.4

5 .oo; -.

% 0.3 300

0.2

r

200

0.1

t

40

$

50

60 TUBE

70 No

100

4

80

!JO

FIG. 5. Analyse sur colonne de Sephadex G-100 du RNA extrait d’ovaires marques a la ‘H-phenylalanine. Trente ovaires de classe 2 ont et6 exposes a la ‘H-phenylalanine (100 &i/ml) pendant 30 min. Le RNA a et6 extrait, purifie et analyse sur colonne de Sephadex (90 cm x 2,5 cm). La faible quantite de radioactivite presente au niveau du pit 1 n’est pas lice a du RNA: elle reste acido-insoluble aprbs traitement a la ribonuclease (100 rg/ml; 1 heure a 23OC). 11 s’agit saris doute de proteines qui ont incorpore la phenylalanine et qui ont sun&u a la purification par le phenol.

possedent un coefficient de sedimentation tres faible (Fig. 4, B et C). II s’agit de RNA ribosomique 5 s (pit 2) et de RNA de transfert (pit 3). En effet, le pit 2 est un element constitutif des ribosomes, ou il est present dans la proportion attendue (1,9%) dune molecule de RNA 5 s pour une molecule de RNA 28 s et une de RNA 18 s (Comb et Zehavi-Willner, 1967 ; Knight et Darnell, 1967). Quant au pit 3, il se charge de phenylalanine, alors que les pits 1 et 2 ne le font pas (Fig. 5). D Composition en bases des trois fractions sur colonne de Sephadex

obtenues par filtration

Le pit 1 fourni par le RNA d’ovaires entiers renferme 4g a 50% de G + C (Tableau 4). Cette composition en bases est intermediaire entre celle du RNA ribosomique (Tableau 4, avant-derniere ligne) et celle du D-RNA (42% de G + C). On peut done admettre que le pit 1 contient, en parties a peu pres egales, du rRNA et D-RNA.

RNA ET OOGENESE

153

DE Xenopus Laevis

Celui-ci n’est pas visible en gradient de saccharose sous la forme de pits bien definis (Fig. 4, A). La teneur en G + C du pit 1 augmente fortement quand on passe aux oocytes de femelles mtires. Sauf dans les oocytes de classe 1, ce pit possede un contenu en G + C egal ou superieur a celui du RNA ribosomique (Tableau 4). Le pit 2 fourni par les colonnes de Sephadex contient 54 a 55% de G + C (Tableau 4). On trouve h peu pres la meme composition en bases dans le pit correspondant obtenu a partir de cellules somatiques (Tableau 5, derniere ligne). La teneur en G + C du pit 2 est inferieure h celle que l’on connait pour le RNA 5 s d’autres especes (60% de G + C dans les cellules humaines : Forget et Weissman, 1967 ; Knight et Darnell, 1967 ; 58% de G + C chez le rat : Prestayko et al., 1970). Quant au pit 3 fourni par les colonnes de Sephadex, il contient 56 a 57% de G + C, valeur plus faible que celle qu’ont trouvee Brown et Littna (1964a) pour le tRNA de Xenopus Zuevis (60% de G + C). La composition en bases du RNA nouvellement synthbtise present dans les trois fractions separees par les colonnes de Sephadex est assez semblable a la composition globale de ces memes fractions (Tableau 5). Toutefois, le RNA de haut poids moleculaire synthetis& par les oocytes est moins riche en G + C que le RNA non marque correspondant (Tableaux 4 et 5). Le RNA marque du pit 3 presente la composition en bases caracteristique du RNA de transfert (60% de G + C), aussi bien dans les oocytes que dans les cellules somatiques. Suivant que les mesures sont faites en densite optique (Tableau 4) ou en radioactiviti! (Tableau 5), il existe une difference de 3 a 4% dans la composition en bases du RNA contenu dans le pit 3. Nous ne voyons pas clairement les raisons de cet &art. TABLEAU COMPOSITION

Fractions

ChLW Ovaires

OocytL?S

EN

BASES

DU

obtenues

4 RNA

par filtration

Pit 1 C

G

A

1 2 3 4 rRNA d’oocytes mlin Embryons stade $5

MARQUA

SW colonne

de Sephadex

Pit 2 UG+CC

G

5 2 3

NON

A

Pie3 UGtC

C

G

5

21 23 27 27 28 28 28

28 27 31 34 34 33 33

28 26 23 23 22 21 21

23 24 19 16 16 18 18

49 50 58 61 62 61 61

28

33

21

18

61

25 24

29 31

23 22

A

UG+C

7; 23 23

54 55

28 28

28 29

23 22

21 21

56 57

154

MAIRY

COMPOS~fON

EN

Fractions

ChaSe Ovaire

BASES

Oocytes’

C

G

Pie 1 A

DU

ET DENIS

TABLEAU 5 RNA MARQUE

obtenues

par filtration

UGfCC

Pie 2 A

G

1” 2 3 4 1” ;: Embryons stade 35

24 23 26 22 23 22 22 20 22 20 29

25 24 23 29 26 24 25 29 26 25 31

26 28 27 21 27 28 21 28 30 29 22

’ Oocytes pr&v& sur des fern&s b Oocytes prl.k&a SW des fern&s ’ Marquage continu par injection

PENDANT de Sephadex

UG+C

4

HEURES G-103

C

G

Pit 3 A

7,

% 1 2 3

AU =P SW colonne

25 25 24 22 24 26 26 23 22 26 18

49 41 49 51 49 46 41 49 48 45 60

U

G+C

70

26 26

23 29

22 21

23 24

55 55

29 30

31 31

22 22

18 17

60 61

26

26

24

22

54

29

32

23

16

61

n’ayant pas pondu depuis au mains ayant pondu depuis une semaine. de “P dam la fern&.

2 mois

2P 1.5

1.0

5

IO

I5

20

25

5

10

15

20

25

FIG. 6. Analyse en gradient de saccharose du RNA extrait d’ovaires marques i la ‘H-guanosine pendant 4 heures. Cinquante pg (A) et 500 pg (B et C) de RNA ont &tL! centrifuges pendant 16 heures 1 24.000 tours/min dans un gradient de saccharose 5-20s. En A, seule la radioactivitl! a BtB mesurke.

E Analyse du RNA en gradient de sac&arose Apres centrifugation en gradient de saccharose, le RNA d’ovaires marques pendant 4 heures h la guanosine tritiee se &pare en 3 pits de densite optique et de radioactivite (Fig. 6). Les pits b et d correspondent au RNA ribosomique 28 s et 18 s ; le pit e est formi! par le RNA de transfert et le RNA 5 s. Au niveau du pit 28 s, le profil de la radioactivite est legerement d&ale vers la region profonde du

RNA ET OOGENESE

155

DE Xenopus Laeuis

gradient par rapport au profil de la densitk optique (Fig. 6, B et C). Il n’y a lh rien d’btonnant car le RNA 28 s apparait d’abord sous la forme d’un prhurseur de poids molikulaire et de con&ante de sCdimentation un peu plus Blevks (30 s ; Loening et al., 1969). Dans les ovaires de classe 2, on note un petit pit de radioactiviti! (a) dans la rbgion 40 s (Fig. 6, B). -I( mo

2.0

A classe I IBOO0 1.5-

I x. 000 $
400 Iboo0 I.@ 4m

600 -’ 0.52000 200

5

IO I5 20 TUBE NO

C close

+ 25

3

400

:

1.5.

I

300 z. VI -. .9

5 200 2-. Z

1 -3 00 0.5-

loo ’ -I 00

, 5

IO 15 20 TUBE No

25

5

IO 15 20 TUBE No

25

FIG. 7. Analyse en gradient de saccharose du RNA extrait d’oocytes marques a la 3H-guanosine pendant 4 heures. Le RNA (500 rg) provient de femelles qui n’ont pas pondu depuis au moins deux mois.

156

MAIRY

5

IO TUBE

IS N”

20

ET DENIS

25 TUBE

No

D classe

4

2.0-

9 IsE

I

z 2

:. 000 i. $ -. z

-5

l,O-

% .J

500

O.Sb >.I P 5

IO

IS

TUBE

No

20

25

I

I

,

5

IO TUBE

IS No

20

25

FIG. 8. Analyse en gradient de saccharose du RNA extrait d’oocytes marqubs g la SH-guanosine pendant 4 heures. Le RNA (500 pg) provient de femelles qui ont pondu depuis environ une semaine.

L’activitb spkcifique et les profils de sbdimentation du RNA fourni par les oocytes diffhrent profondbment suivant que ceux-ci proviennent ou non de femelles qui ont pondu rkcemment (Figs. 7 et 8). Si les femelles n’ont pas pondu depuis au moins deux mois, le RNA que

RNA ET OOGENESE TABLEAU COMPOSWON

EN BASES DU RNA

Fractions

Classe Ovaires

6

MARQU~ AU “P

PENDANT 4 HEURES

obtenues par centrifugation saccharose

Oocytes

c

G

Pit a A c10

U

1” 2”

25 24 22

24 24 23

27 32 29

24 20 26

2

157

DE Xenopus Lueuis

G+C 49 48 45

en gradient

de

C

G

Pit c A 7;

U

23 21

23 21

29 30

25 28

G+C

46 42

’ Oocytes prblevkssur des femellesn’ayant pas pondu depuis au mains 2 mois. synthetisent leurs oocytes se marque de moins en moins bien h mesure que l’oogenese progresse (Fig. 7). Ce RNA contient une compoSante d’environ 40 s (a) dont l’importance, considerable au stade 1 (Fig. 7, A), diminue aux stades 2 et 3 (Fig. 7, B et C!), mais augmente de nouveau au stade 4 (Fig. 7, D). On observe aussi un pit de radioactiviti! d’environ 24 s (c) entre les pits 28 s (b) et 18 s (d). Le RNA fourni par les femelles qui ont pondu depuis une semaine presente une activite specifique minimale au stade 2 (Fig. 8, B) ; aux stades 3 et 4, l’activite du RNA augmente de nouveau (Fig. 8, C et D ; voir aussi la Fig. 2). L’importance du pit a (40 s) est fortement reduite (comparer la Fig. 8, A et B avec la Fig. 7, A et B). On notera aussi a tous les stades la presence de radioactivite au niveau des pits 28 s et 18 s (Fig. 8). F Composition en bases des pits obtenus par centrifugation dient de saccharose

en gra-

Le pit a (40 s) observe en gradient de saccharose est, a premiere vue, le precurseur commun du RNA 28 s et du RNA 18 s (Gall, 1966 ; Landesman et Gross, 1969). II devrait done avoir une teneur Clevee en G + C (61% ; Loening et al., 1969). En fait, il n’en est rien. Le RNA 40 s des oocytes renferme 45 a 48% de G + C (Tableau 6). On peut done le considerer comme un melange de D-RNA (70~85%) et de precurseurs du RNA ribosomique (l&30%). Quant au pit c, il est forme presque exclusivement par du D-RNA (Tableau 6). DISCUSSION

Dans ce travail, nous avons montre ferences entre le contenu ribonucleique

qu’il existe de grandes difdes oocytes en vitellogenbe

158

MAIRY

ET DENIS

et celui des ovaires de femelles immatures. Cette observation concorde avec celle de Thomas (1969). A vrai dire, les differences d’une classe d’ovaires et d’oocytes a l’autre sont assez minimes, et bien moindres que les differences entre ovaires et oocytes (Fig. 1 et 2 et Tableau 2). A premiere vue, on pourrait attribuer ces differences au fait que les ovaires de femelles immatures contiennent de nombreuses cellules somatiques. Toutefois, comme nous le montrons ci-dessous, le RNA somatique ne peut pas contaminer de facon decelable les extraits ovariens. Les differences entre le contenu ribonucleique des ovaires et celui des oocytes s’expliquent d’une maniere beaucoup plus simple : les plus petits oocytes (375 p) isoles a partir de femelles mures sont, en moyenne, 16 fois plus gros que les oocytes presents dans les ovaires de classe 3 (Tableau 1). Cet &art est beaucoup plus considerable que ceux que l’on observe d’une classe d’ovaires ou d’oocytes a l’autre. C’est pendant la periode oh le diametre des oocytes passe de 150 a 375 p que leur contenu ribonucleique se modifie le plus vite (Tableau 2). A Synthkse et accumulation

du RNA

dans les ovaires de femelles

immatures

1. Origine du RNA de faible poids molbculaire prksent dans les extraits ovariens. La majeure partie du RNA present dans les ovaires de femelles immatures est formee de petites molecules, fortement retardees par le Sephadex (Figs. 1 et 5). Nous n’avons aucune preuve absolue que ces petites molecules proviennent des oocytes euxmemes ou qu’elles ne sont pas des produits de degradation. Plusieurs causes d’erreur doivent 6tre envisagees. (a) Le RNA formant les pits 2 et 3 fournis par les colonnes de Sephadex (Figs. 1 et 5) pourrait provenir des cellules somatiques. Nous pouvons ecarter cette possibilite car les cellules somatiques occupent tout au plus 1/208me du volume de la glande et la concentration du RNA y est bien moindre que dans les oocytes, ainsi qu’on peut s’en rendre compte par une coloration h la pyronine. Au maximum 5% du RNA extrait des ovaires de classe 1 pourrait provenir des cellules somatiques. La contamination par le RNA somatique est plus faible encore dans les ovaires de classes 2 et 3. (b) Les petites molecules presentes dans les extraits d’ovaires sont peut-etre formees par du DNA ovarien degrade. Cette eventualiti! ne peut pas etre retenue. En effet, un ovaire de classe 2 fournit h l’extraction au moins 100 pg de RNA et seulement 1 a 5 fig de DNA (Wegnez et Denis, experiences inedites). Ce dernier ne peut

RNA ET OOGENESE

DE Xenopus Laeuis

159

done pas contaminer de faGon decelable le RNA des oocytes, tout au moins en densite optique. (c) Le RNA de faible poids molbculaire pourrait 6tre du D-RNA degrade par les nucleases de l’ovaire. L’experience d&rite sur la Fig. 3 permet d’eliminer cette possibilite. Des ovaires non marques de femelles immatures ont QtCmelanges avant l’extraction avec des embryons marques au 14C. Le RNA embryonnaire extrait dans ces conditions est forme en majeure partie (89%) par de grosses molecules, non retardees par le Sephadex (Fig. 3). Le RNA embryonnaire n’a done pas eti! degrade par les nucleases des ovaires. Le RNA ovarien ne doit pas l’avoir ete davantage. Bien que d’autres causes d’erreur ne doivent pas Btre exclues a priori, nous pensons pouvoir conclure que les oocytes de 50 a 150 k de diamittre contiennent une tres grande quantite de RNA de faible poids moleculaire. En revanche, rien de definitif ne peut etre conclu en ce qui concerne le marquage des diverses classes de RNA ovarien. En effet, une partie importante du RNA synthetise dans les ovaires provient des cellules somatiques. II est fort probable, mais non prouve, que le RNA contaminant est surtout forme par de grosses molecules (D-RNA et RNA 28 s + 18 s). La plus grande partie du RNA marque d’origine somatique devrait done se retrouver dans le pit 1 fourni par les colonnes de Sephadex (Fig. 1). 2. Nature du RNA de faible poids molkculuire p&sent dans les extraits ouariens. II ne fait guere de doute que le deuxieme pit sor-

tant des colonnes de Sephadex renferme du RNA 5 s. Ce pit forme 1,9’% du RNA present dans les ribosomes (Tableau 2), proportion qui correspond a une molecule de RNA 5 s pour une de RNA 28 s et une de RNA 18 s. Le RNA du pit 2, chromatographie sur colonne d’albumine methylBe, est 41ue sous la forme d’une fraction apparemment homogene a une concentration en NaCl de 0,5 M (Mairy et Denis, experiences inedites). Ce comportement est bien celui du RNA 5 s (Comb et al., 1965). Par ailleurs, les embryons contiennent du RNA dont le profil d’elution (Fig. 3) et la composition en bases (Tableau 5) correspondent a ceux du pit 2 fourni par les ovaires. Le RNA embryonnaire donne un pit 2 un peu plus important que le RNA ribosomique (Tableau 2), mais cela ne doit pas Btonner car il existe dans les cellules animales un ‘pool’ de RNA 5 s nucleaire (Knight et Darnell, 1967). Tout ceci ne prouve cependant pas que le RNA 5 s est le seul type de molecule qui entre dans la composition du pit 2 fourni par les colonnes de Sephadex. La meme incertitude existe en ce qui concerne le pit 3. Celui-ci

160

MAIFtY ET DENIS

contient certainement du RNA de transfer-t car il se charge de phenylalanine (Fig. 5) et il possede, apres marquage au “P, la composition en bases typique du tRNA (Tableau 5). Toutefois, la composition globale du RNA contenu dans le pit 3 differe sensiblement de celle du tRNA (Tableau 4). 11 se peut done que le pit 3 ne renferme pas uniquement du RNA de transfert. 3. Nature du RNA de poids mokxlaire klevb prbsent dans les extraits ovariens. Le RNA de poids moleculaire elevi! present dans les extraits ovariens ne forme qu’un quart h un tiers de la densite optique totale (Tableau 2). 11 contient non seulement du RNA 28 s et 18 s (Fig. 4, A), mais aussi une grande quantite de D-RNA. Celuici ne manifeste pas sa presence dans les gradients de saccharose (Figs. 4, A et 6, B, C). On ne peut le detecter qu’en mesurant la composition en bases du pit non retard6 par les colonnes de Sephadex (Tableau 4). Cette composition ressemble davantage a celle du D-RNA (42% de G + C) qu’a celle du rRNA (61% de G + C). II se produit done dans les petits oocytes une forte accumulation de D-RNA, qui forme environ la moitie du RNA de haut poids moleculaire, soit 10 a 15% du total. Apr’es 4 heures de marquage, une par-tie importante de la radioactivite incorporee dans les ovaires se retrouve dans le RNA 28 s et 18 s (Fig. 6). L’assemblage des ribosomes se fait done de man&e tres active dans les ovaires. Reste a savoir si cet assemblage a reellement lieu dans les oocytes et non dans les autres cellules de la gonade. On ne peut douter qu’il se produit, en partie tout au moins, dans les oocytes. En effet, les oocytes de 30 CLet plus possedent de nombreux nucleoles, qui incorporent les nucleosides marques, comme on peut le voir sur les autoradiographies. Ceci est l’indice d’une synthese active de RNA 28 s et 18 s (Brown et Gurdon, 1964). B Synthbse 1100 p

et accumulation

du RNA

dans les oocytes de 375 p &

La composition du RNA present dans les oocytes de 375 h 1100 w differe profondement de celle que l’on a observee dans les oocytes de 50 a 150 cl. Les gros oocytes contiennent peu de RNA de faible poids moleculaire et la proportion de celui-ci diminue h mesure que l’oogenese progresse (Figs. 2 et 7 et Tableau 2). Le RNA formant les pits 2 et 3 fournis par les colonnes de Sephadex (Fig. 2) possede apparemment les memes proprietes que le RNA correspondant d’origine ovarienne (Fig. 1). 11s’agit done, selon toute vraisemblance, de RNA 5 s et de tRNA.

RNA ET OOGENESE DE Xenopus Laeuis

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Le RNA de poids moleculaire eleve est forme presque exclusivement par du RNA 28 s et 18 s, car il posdde une teneur en G + C voisine de 60% (Tableau 4). Toutefois, les oocytes ne produisent pas uniquement du RNA ribosomique. En effet, la composition en bases du RNA marque est intermediaire entre celle du D-RNA et celle du rRNA (Tableau 5). Les gros oocytes synthetisent done au moins autant de D-RNA que de rRNA, mais contrairement a ce qui se passe dans les ovaires de femelles immatures, le D-RNA s’accumule moins vite que le rRNA. Si, en effet, tout le D-RNA et tout le rRNA synthetises s’accumulaient a la meme vitesse, la composition en bases du RNA global devrait etre la meme que celle du RNA nouvellement synthetise (45-51s de G + C), ce qui n’est pas le cas. Le D-RNA est done moins stable que le rRNA. Le D-RNA synthetise par les oocytes correspond sans doute au RNA que l’on voit, apres autoradiographie, apparaitre sur les boucles laterales des chromosomes plumeux (Gall et Callan, 1962). Ce meme RNA est visible dans les gradients de saccharose sous la forme de deux pits d’importance variable (a et c ; Figs. 7 et 8). Des differences importantes apparaissent dans les caracteres du RNA synthetise par les oocytes suivant que ceux-ci proviennent ou non de femelles qui ont pondu recemment. Ces differences sont de deux ordres. 1. Vitesse de marquuge du RNA. Quand les femelles n’ont pas pondu depuis plusieurs mois, l’activite specifique du RNA synthetisi! par leurs oocytes est fonction inverse du volume de ceux-ci (Fig. 7). Si les oocytes proviennent de femelles qui ont pondu recemment, la vitesse de marquage du RNA ne depend pas de la taille des oocytes : elle est t&s faible au stade 2 et plus blevee aux stades 3 et 4 (Figs. 2 et 8). A premiere vue, il semble que le declenchement recent de la ponte ait pour effet de reduire la synthese du RNA dans les oocytes de classe 2 et de l’activer dans les oocytes de taille superieure. Il faut cependant se garder de tirer des conclusions trop categoriques car la vitesse de marquage du RNA varie dune femelle a l’autre. Elle est, au surplus, fonction de la permeabilite des oocytes vis-a-vis de la guanosine, qui peut elle aussi changer avec l’etat physiologique de la femelle. 2. Rbduction du pit 40 s. Le pit 40 s (a) visible dans les gradients de saccharose est fort important lorsque les oocytes proviennent de femelles qui n’ont pas pondu depuis longtemps (Fig. 7). II l’est beaucoup moins dans les oocytes fournis par les femelles qui ont pondu recemment (Fig. 8). 11est difficile d’interpreter cette observation en

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l’absence de toute information concernant le role et la signification du pit 40 s. Tout ce que l’on peut dire est que le declenchement de la ponte influence les oocytes restant dans l’ovaire en y modifiant la transcription du RNA. Cette modification n’est pas suffisante pour alterer de maniere importante la composition du RNA nouvellement forme (Tableau 5). CONCLUSION

Malgre les restrictions que nous avons mentionnees dans la discussion concernant la purete des fractions fournies par les colonnes de Sephadex, nous considerons le RNA de faible poids moleculaire present dans les extraits d’ovaires et d’oocytes comme forme en majeure partie par du RNA 5 s et par du RNA de transfert. 11 s’ensuit que la synthese des principales classes de RNA n’est pas du tout coordonnee durant l’oogenese. Cette conclusion contredit celle de Brown et Littna (1966b). Pendant la premiere partie de l’oogenese (petit accroissement), les oocytes accumulent surtout du RNA 5 s, du RNA de transfer% et du D-RNA. Ces trois types de RNA forment p&s de 90% de la densite optique totale dans les oocytes de 150 p. Pendant la seconde partie de l’oogenese (grand accroissement), les oocytes synthetisent surtout de RNA 28 s et 18 s. Ils continuent a synthetiser du D-RNA, mais celui-ci s’accumule beaucoup moins vite que le rRNA. La production du RNA 5 s et du RNA de transfert est fortement reduite durant la periode de grand accroissement. La teneur des oocytes en RNA 28 s + 18 s, en RNA 5 s et en RNA de transfert varie d’un stade a l’autre (Tableau 2), ce qui montre l’absence de couplage entre ces differentes syntheses. L’intense production de RNA de faible poids moleculaire durant la premiere partie de l’oogenese suggere que ce RNA est mis en reserve pour un usage ulterieur. Le RNA 5 s synthetise en exces dans les petits oocytes serait integre dans les ribosomes assembles pendant la periode de grand accroissement. S’il en est bien ainsi, les ribosomes qui apparaissent dans les gros oocytes doivent reunir du RNA 28 s et 18 s nouvellement synthetise et du RNA 5 s synthetisk des mois et peut-Btre meme des annees auparavant. Nous ne voyons pas clairement les raisons pour lesquelles l’oocyte &pare dans le temps la production des grosses molecules et celle des petites molecules de RNA qui composent les ribosomes, alors que cette production est manifestement coordonnee dans les cellules somatiques, oii un Btat stationnaire doit Btre maintenu (Quincey et Wilson, 1969). Quant au RNA de transfert accumuli! au debut de l’oogenese, on a

RNA ET OOGENESE DE Xenopus Laeuis

163

de bonnes raisons de croire qu’il est mis lui aussi en reserve pour couvrir les besoins de l’oeuf mm, qui se montent a 40 mpg selon Brown et Littna (1966b) et a plus du double suivant nos propres estimations (Tableau 3). Cette quantite est plus de mille fois superieure a celle que l’on trouve dans une cellule somatique. Une telle accumulation necessite des mecanismes speciaux. L’enorme production de RNA de transfert que nous observons au debut de l’oogenkse est sans doute un de ces mecanismes. RESUME

On a etudie la synthese du RNA durant l’oogenese du crapaud sud-africain Xenopus Levis. Le RNA, provenant de 7 classes differentes d’oocytes obtenues a partir de femelles immatures et de femelles mdres, a ete analyst! par filtration sur colonne de Sephadex G-100 et par centrifugation en gradient de saccharose. Les oocytes en periode de previtellogenese (diametre moyen : 50 a 150 cc)contiennent de trb grandes quantites de D-RNA et de RNA de faible poids moleculaire. Celui-ci comprend deux classes de molecules presentant les proprietes du RNA 5 s et du RNA de transfert. Dans les oocytes de 150 p de diamlttre, le D-RNA forme environ 10% de la densite optique totale ; le RNA 5 s en forme 40% et le RNA de transfert, 35%. Les oocytes en periode de grand accroissement (diametre moyen : 375 21 1100 II) synthetisent surtout du D-RNA et du RNA ribosomique 28 s et 18 s. Ce dernier s’accumule tres rapidement : il constitue plus de 90% du RNA present dans l’oeuf mtir. Le D-RNA synthetise par les gros oocytes s’observe en gradient de saccharose sous la forme de deux pits bien marques (40 s et 24 s), La production des differentes classes de RNA n’est pas du tout coordonnee durant l’oogenese. Le RNA 5 s et le RNA de transfert sont produits en exces dans les petits oocytes. Ces deux types de RNA ne sont pas utilises tout de suite, mais probablement mis en reserve pour un usage ulterieur. Dans les oocytes en periode de grand accroissement (diametre moyen : 375 a 1100 cc),le mode de synthese du RNA differe suivant que la femelle a pondu une semaine ou plus de deux mois avant le prelevement des oocytes. Les differences affectent la vitesse de marquage du RNA, ainsi que le profil de sedimentation du RNA nouvellement synthetise. Abrkviations employkes. D-RNA, RNA semblable au DNA par sa composition en bases ; tRNA, RNA de transfer% ; rRNA, RNA ribo-

164

MAIRY

ET DENIS

somique ; G, guanine ; C, cytosine ; A, adenine ; U, uracile ; EDTA, ethylene-diamine-tetraacetate. SUMMARY

RNA synthesis was studied during oogenesis of the South-African clawed toad Xenopus lueuis. Seven classes of oocytes were isolated from immature and from mature females. The RNA extracted from these oocytes was analyzed by filtration on Sephadex G-100 and by centrifugation in sucrose gradients. The previtellogenic oocytes (average diameter : 50 to 150 cc)were found to contain very large amounts of D-RNA and of low molecular weight RNA. The latter comprises two classes of molecules whose properties are those of 5 s RNA and of transfer RNA. In the oocytes of 150 p, D-RNA, 5 s RNA and transfer RNA formed lo%, 40% and 35%, respectively, of the total optical density. The vitellogenic oocytes (average diameter : 375-1100 CL)synthesized mostly D-RNA and 28 s + 18 s RNA. The latter classes of RNA accumulated very rapidly in large oocytes since they made up more than 90% of the RNA present in mature eggs. D-RNA synthesized by the large oocytes sedimented in sucrose gradients as two distinct peaks (40 s and 24 s). The synthesis of the different RNA classes is therefore not at all coordinate during oogenesis. Transfer RNA and 5 s RNA are produced in excess in small oocytes. These classes of RNA are probably not utilized immediately, but stored for further use. RNA synthesis was found to be very different in large oocytes (average diameter: 375-1100 CL)taken from females which have laid eggs since 1 week and in oocytes from females which have not laid eggs since more than 2 months. Differences were noticed in the labeling rate of RNA, and in the sedimentation profile of newly synthesized RNA. Nous remercions vivement Madame Ficq (Universite de Bruxelles) pour son aide lors de la preparation des autoradiographies, et Mademoiselle L. Buyel pour son assistance technique. REFERENCES BRACHET, J. (1944). “Embryologie chimique.” Desoer, Liege. BRACHET, J. (1960). “The Biochemistry of Development.” Pergamon Press, New York. BROWN, D. D., et GURDON, J. (1964). Absence of ribosomal RNA synthesis in the anu-

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of Xeno-

RNA ET OOGENESE

DE Xenopus Laeois

165

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