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Transfert de gène in vivo dans la cochlée de souris néonatales via des vecteurs viraux adéno-associés
Communications orales du samedi 13 octobre impédancemétrie, PEA, examen vestibulaire), IRM et études génétiques pour l’identification de polymorphismes et variantes des gènes FPN1, TF, HFE et HAMP. Les mêmes études ont été entreprises sur un groupe de témoin de 400 sujets sains. Résultats.— On note que 157 patients ont été recrutés, 76 hommes et 81 femmes avec un âge moyen de 59,5 ans ; 156 patients ont présenté une SB unilatérale (81 droite, 75 gauche), un patient une SB bilatérale ; 25,7 % des patients présentaient au départ un audiogramme tonal de type A (selon Tran Ba Huy et al., 2005), 18,2 % de type B, 16,7 % de type C, 9,1 % de type D, 30,3 % de type E. Les patients avec audiogramme de type C ont présenté le pronostic le plus défavorable. Sur 137 patients, les études génétiques pour la recherche des polymorphismes ont été complétées : -8 CG du gène SLC40A1 (FPN-1), H63D et C282Y du gène HFE, -582AG du gène HAMP et variantes C1/C2 de la transferrine. Le groupe des patients avec polymorphisme en homozygotie -8 C/G du gène FPN1 a montré une association statistiquement significative avec l’apparition de l’hypoacousie brusque par rapport au groupe de témoin (p = 0,0006). Conclusion.— Les études génétiques réalisées ont mis en évidence une augmentation du risque de SB dans les patients homozygotes pour le polymorphisme -8 C/G du gène FPN1, en laissant supposer un rôle possible pour ce gène dans la physiopathologie de la maladie et en soulignant l’importance de l’IRE (Iron Regulatory Element) du gène dans la régulation de l’activité de la ferroportine. Le polymorphisme en question pourrait être considéré comme un valable marqueur pour l’identification de patients à risque de SB. http://dx.doi.org/10.1016/j.aforl.2012.07.046 045
Transfert de gène in vivo dans la cochlée de souris néonatales via des vecteurs viraux adéno-associés A. Meyer a,∗ , O. Danos b , J. Tordo b , O. Akil c , C. Petit d , S. Safieddine d a Hôpital Charles-Nicolle, Rouen, France b Inserm U845, hôpital Necker, Paris, France c University of California San Francisco, San Francisco, États-Unis d Inserm U587, Institut Pasteur, Paris, France ∗ Auteur correspondant. But de la présentation.— Actuellement, il n’existe aucun traitement curatif des surdités neurosensorielles. On estime que 70 à 80 % des surdités neurosensorielles humaines sont d’origine génétique. Une des approches thérapeutiques prometteuses des surdités génétiques est la thérapie génique en introduisant la copie du gène déficient. Dans une telle approche, l’étape de l’identification des vecteurs les plus appropriés est une phase primordiale. Ce travail a précisément pour but de déterminer les vecteurs viraux les plus efficaces pour transduire les différents types cellulaires cochléaires de souris et d’évaluer leur tropisme afin d’établir une preuve de concept dans un modèle animal. Matériels et méthodes.— La souris constitue un modèle idéal pour explorer la thérapie génique des surdités. En effet, le patrimoine génétique de la souris est identique à 90 % à celui de l’homme et les modèles murins reproduisent fidèlement des surdités humaines. Les vecteurs les plus prometteurs sont les adénovirus associés, car ils ont l’avantage d’être non pathogènes et peu immunogènes. Nous avons testé quatre sérotypes, AAV1, AAV2, AAV2/8, AAV8, comportant chacun un gène reporteur GFP (Green Fluorescent Protein), chez des souris néonatales âgées de 1 à 3 jours. Une injection unilatérale de deux microlitres contenant du vecteur, à un titre de 10ˆ 12, a été effectuée à travers la fenêtre ronde, à l’aide d’une micropipette en verre. L’expression et la distribution cellulaire de la GFP ont été étudiées par immunohistochimie et par imagerie confocale une semaine après l’injection du virus. Résultats.— Dans cette étude, 120 souris C57 BLA6 (30 par sérotype) ont été utilisées. Une variété de types cellulaires a été transduite après une injection à travers la fenêtre ronde. Parmi les différents
A19 sérotypes testés, le sérotype 2/8 s’est avéré le vecteur le plus efficace pour la transduction des cellules ciliées internes (45 %) mais moindre pour les cellules de support (40 %). Les sérotypes 1, 2, et 8 ont un tropisme pour les cellules ciliées internes de respectivement 31 %, 5 %, et 6 % et pour les cellules de support, de respectivement 50 %, 72 %, et 80 %. Le sérotype 8 transduit en plus les neurones (25 %). Conclusion.— Les adénovirus associés sont potentiellement des vecteurs de choix pour le transfert de gènes dans la cochlée, dans un but de traitement des surdités génétiques. Cette étape préliminaire a permis de déterminer le type de virus vecteur pour cibler les cellules cochléaires d’intérêt. Dans l’étape suivante, nous essayerons de restaurer l’audition par transfert d’un gène thérapeutique chez des souris modèles de surdité humaine. http://dx.doi.org/10.1016/j.aforl.2012.07.047 046
Transfert de gène sur un modèle d’organe de Corti ex vivo C. La Croix ∗ , E. Mornet , C. Clodic , T. Montier , G. Valette , R. Marianowski CHU de Brest, Brest, France ∗ Auteur correspondant.
But de la présentation.— La thérapie génique est une méthode consistant à apporter un gène normal et fonctionnel (gène « médicament ») dans une cellule où le gène normalement présent est altéré. Tout d’abord le gène est cloné dans un plasmide puis celui-ci est transféré dans les cellules cibles au moyen d’un véhicule communément appelé « vecteur ». Après transfection, le transgène peut s’exprimer et la protéine codée doit permettre de rétablir la fonction altérée dans les cellules d’intérêts. Le gène d’intérêt est Atoh1 (Atonal homologue 1). Ce gène code pour un facteur de transcription basique et régule positivement la différenciation des cellules ciliées cochléaires durant l’embryogénèse des mammifères. Un vecteur non viral (lipophosphoramides) a été utilisé. Matériels et méthodes.— Nous avons développé un modèle in vitro de culture de cellules d’organe de Corti à partir de microdissection chez le rat. Il nous a permis de réaliser des transfections ex vivo en utilisant un lipide cationique, le KLN47. Afin d’augmenter la capacité de transfert de notre vecteur, nous avons testé diverses conditions, notamment différents rapport de charge (RC). Nous avons également travaillé avec deux types de plasmides. D’une part, un plasmide rapporteur contenant le gène codant pour la luciférase (il est dépourvu de motif CpG ce qui diminue le niveau de réaction inflammatoire et permet des réinjections in vivo). D’autre part, un plasmide dit « thérapeutique » contenant le gène Atoh1. Nous avons comparé les résultats de transfection avec le KLN47 à ceux engendrés par l’utilisation d’un vecteur commercial, à lipofectamine (LFM). Pour l’évaluation de la toxicité, nous avons utilisé comme contrôles des cellules seules ou des cellules avec l’ADN seul. Résultats.— Nous avons développé un modèle fiable et reproductible in vitro de culture de cellules d’organe de Corti. Sur plus de 300 cochlées disséquées nous avons obtenu une conformation morphologique stable des cellules au-delà de cinq jours après avoir adapté le milieu de culture et le support d’adhérence. Le KLN47, un lipophosphoramidate, a fait la preuve de son efficacité et de sa non-toxicité par rapport aux contrôles. Nous avons obtenu des taux de succès de transfection de 81 % pour une formulation à RC = 6 contre 44 % pour la LFM. Il représente un candidat intéressant pour les études à venir. Les résultats ont été comparés au modèle in vivo précédemment développé. Conclusion.— Atoh1, codant pour un facteur de transcription et régulateur clé du développement des cellules ciliées, peut être transféré dans l’organe de Corti ex vivo en utilisant les vecteurs
Transfert de gène in vivo dans la cochlée de souris néonatales via des vecteurs viraux adéno-associés A. Meyer a,∗ , O. Danos b , J. Tordo b , O. Akil c , C. Petit d , S. Safieddine d a Hôpital Charles-Nicolle, Rouen, France b Inserm U845, hôpital Necker, Paris, France c University of California San Francisco, San Francisco, États-Unis d Inserm U587, Institut Pasteur, Paris, France ∗ Auteur correspondant. But de la présentation.— Actuellement, il n’existe aucun traitement curatif des surdités neurosensorielles. On estime que 70 à 80 % des surdités neurosensorielles humaines sont d’origine génétique. Une des approches thérapeutiques prometteuses des surdités génétiques est la thérapie génique en introduisant la copie du gène déficient. Dans une telle approche, l’étape de l’identification des vecteurs les plus appropriés est une phase primordiale. Ce travail a précisément pour but de déterminer les vecteurs viraux les plus efficaces pour transduire les différents types cellulaires cochléaires de souris et d’évaluer leur tropisme afin d’établir une preuve de concept dans un modèle animal. Matériels et méthodes.— La souris constitue un modèle idéal pour explorer la thérapie génique des surdités. En effet, le patrimoine génétique de la souris est identique à 90 % à celui de l’homme et les modèles murins reproduisent fidèlement des surdités humaines. Les vecteurs les plus prometteurs sont les adénovirus associés, car ils ont l’avantage d’être non pathogènes et peu immunogènes. Nous avons testé quatre sérotypes, AAV1, AAV2, AAV2/8, AAV8, comportant chacun un gène reporteur GFP (Green Fluorescent Protein), chez des souris néonatales âgées de 1 à 3 jours. Une injection unilatérale de deux microlitres contenant du vecteur, à un titre de 10ˆ 12, a été effectuée à travers la fenêtre ronde, à l’aide d’une micropipette en verre. L’expression et la distribution cellulaire de la GFP ont été étudiées par immunohistochimie et par imagerie confocale une semaine après l’injection du virus. Résultats.— Dans cette étude, 120 souris C57 BLA6 (30 par sérotype) ont été utilisées. Une variété de types cellulaires a été transduite après une injection à travers la fenêtre ronde. Parmi les différents
A19 sérotypes testés, le sérotype 2/8 s’est avéré le vecteur le plus efficace pour la transduction des cellules ciliées internes (45 %) mais moindre pour les cellules de support (40 %). Les sérotypes 1, 2, et 8 ont un tropisme pour les cellules ciliées internes de respectivement 31 %, 5 %, et 6 % et pour les cellules de support, de respectivement 50 %, 72 %, et 80 %. Le sérotype 8 transduit en plus les neurones (25 %). Conclusion.— Les adénovirus associés sont potentiellement des vecteurs de choix pour le transfert de gènes dans la cochlée, dans un but de traitement des surdités génétiques. Cette étape préliminaire a permis de déterminer le type de virus vecteur pour cibler les cellules cochléaires d’intérêt. Dans l’étape suivante, nous essayerons de restaurer l’audition par transfert d’un gène thérapeutique chez des souris modèles de surdité humaine. http://dx.doi.org/10.1016/j.aforl.2012.07.047 046
Transfert de gène sur un modèle d’organe de Corti ex vivo C. La Croix ∗ , E. Mornet , C. Clodic , T. Montier , G. Valette , R. Marianowski CHU de Brest, Brest, France ∗ Auteur correspondant.
But de la présentation.— La thérapie génique est une méthode consistant à apporter un gène normal et fonctionnel (gène « médicament ») dans une cellule où le gène normalement présent est altéré. Tout d’abord le gène est cloné dans un plasmide puis celui-ci est transféré dans les cellules cibles au moyen d’un véhicule communément appelé « vecteur ». Après transfection, le transgène peut s’exprimer et la protéine codée doit permettre de rétablir la fonction altérée dans les cellules d’intérêts. Le gène d’intérêt est Atoh1 (Atonal homologue 1). Ce gène code pour un facteur de transcription basique et régule positivement la différenciation des cellules ciliées cochléaires durant l’embryogénèse des mammifères. Un vecteur non viral (lipophosphoramides) a été utilisé. Matériels et méthodes.— Nous avons développé un modèle in vitro de culture de cellules d’organe de Corti à partir de microdissection chez le rat. Il nous a permis de réaliser des transfections ex vivo en utilisant un lipide cationique, le KLN47. Afin d’augmenter la capacité de transfert de notre vecteur, nous avons testé diverses conditions, notamment différents rapport de charge (RC). Nous avons également travaillé avec deux types de plasmides. D’une part, un plasmide rapporteur contenant le gène codant pour la luciférase (il est dépourvu de motif CpG ce qui diminue le niveau de réaction inflammatoire et permet des réinjections in vivo). D’autre part, un plasmide dit « thérapeutique » contenant le gène Atoh1. Nous avons comparé les résultats de transfection avec le KLN47 à ceux engendrés par l’utilisation d’un vecteur commercial, à lipofectamine (LFM). Pour l’évaluation de la toxicité, nous avons utilisé comme contrôles des cellules seules ou des cellules avec l’ADN seul. Résultats.— Nous avons développé un modèle fiable et reproductible in vitro de culture de cellules d’organe de Corti. Sur plus de 300 cochlées disséquées nous avons obtenu une conformation morphologique stable des cellules au-delà de cinq jours après avoir adapté le milieu de culture et le support d’adhérence. Le KLN47, un lipophosphoramidate, a fait la preuve de son efficacité et de sa non-toxicité par rapport aux contrôles. Nous avons obtenu des taux de succès de transfection de 81 % pour une formulation à RC = 6 contre 44 % pour la LFM. Il représente un candidat intéressant pour les études à venir. Les résultats ont été comparés au modèle in vivo précédemment développé. Conclusion.— Atoh1, codant pour un facteur de transcription et régulateur clé du développement des cellules ciliées, peut être transféré dans l’organe de Corti ex vivo en utilisant les vecteurs