Częstość mykoplazmatycznych zapaleń płuc u dzieci w Łodzi i makroregionie na podstawie obserwacji własnych

P R AC A O RYG I N A L N A

Częstość mykoplazmatycznych zapaleń płuc u dzieci w Łodzi i makroregionie na podstawie obserwacji własnych The frequency of the mycoplasmal pneumonia in children in Lodz and macroregion based on own observations Barbara Kamer1, Teresa Woźniakowska-Gęsicka2, Renata Pasowska1, Konrad Pyziak1, Przemysław Kiciński2 1 II Klinika Pediatrii i Alergologii Kierownik: doc dr. hab n. med. Barbara Kamer 2 III Klinika Pediatrii Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi Kierownik: prof. dr. hab n. med. Teresa Woźniakowska-Gęsicka Dyrektor: prof. dr hab. n. med. Przemysław Oszukowski

oraz Tadeusz Bujnowski3, Elżbieta Czkwianianc4, Aneta Czupryniak5, Władysław Grabowski6, Małgorzata Gzik-Musiał7, Ewa Haze8, Ewa Małecka-Panas4, Danuta Mazurkiewicz9, Justyna Pałczyńska-Moździerz10, Anna Pankowska11, Barbara Podgórska12, Elżbieta Rzepkowska13, Danuta Sobantka14, Bogdan Sołek15, Janusz Wojtuń16, Regina Ziółkowska-Grześkowiak17, Jolanta Życka-Podkowska18 3 Oddział Pediatryczny Szpitala Samorządowego w Rawie Mazowieckiej, 4Klinika Gastroenterologii ICZMP w Łodzi, 5Oddział Pediatryczno-Neonatologiczny Szpitala SPZOZ w Brzezinach, 6Oddział Pediatryczny Szpitala Miejskiego w Łowiczu, 7Oddział Pediatryczny Szpitala Powiatowego w Radomsku, 8Oddział Dziecięcy Samodzielnego Szpitala Wojewódzkiego w Piotrkowie Trybunalskim, 9Oddział Dziecięcy Szpitala Rejonowego im. Jana Pawła II w Bełchatowie, 10Oddział Dziecięcy Szpitala SPZOZ w Wieluniu, 11Oddział Chorób Płuc i Alergii Układu Oddechowego dla Dzieci Młodszych Centrum Leczenia Chorób Płuc i Rehabilitacji w Łodzi, 12Oddział Dziecięcy Szpitala SPZOZ w Zduńskiej Woli, 13Oddział Pediatryczno-Obserwacyjny Szpitala SPZOZ w Łasku, 14Oddział Dziecięcy Szpitala SPZOZ w Pabianicach, 15 Oddział Dziecięcy Szpitala SPZOZ w Poddębicach, 16Oddział Dziecięcy Szpitala SPZOZ w Łęczycy, 17Oddział Pediatryczny Szpitala SPZOZ w Kutnie, 18Oddział Pediatryczny Szpitala SPZOZ w Tomaszowie Mazowieckim

Wstęp. Zakażenia układu oddechowego u dzieci stanowią częsty problem kliniczny. Wśród czynników etiologicznych istotne znaczenie ma Mycoplasma pneumoniae. Cel pracy. Autorzy ocenili częstość zakażenia Mycoplasma pneumoniae jako czynnika przyczynowego zapaleń płuc u dzieci. Materiał i metody. Analizą objęto łącznie 23 779 dzieci w wieku od 1 miesiąca do 18 roku życia leczonych na wybranych oddziałach dziecięcych w Łodzi i makroregionu łódzkiego w okresie od 2003 do 2007 r. Wyniki. Wykazano występowanie zakażenia Mycoplasma pneumoniae u 1313 dzieci (5,5%). Zaobserwowano stopniowy wzrost częstości mykoplazmatycznych zapaleń płuc w poszczególnych latach obserwacji, z największym nasileniem w ostatnich dwóch latach. Stwierdzono również, że zakażenie Mycoplasma pneumoniae występowało w każdej grupie wiekowej, przy czym w najwyższym odsetku (43,7%) u dzieci powyżej siódmego roku życia, a w najniższym u dzieci 2–3-letnich (16,2%) i u niemowląt (17,9%). Wnioski. Stwierdzenie u 5,5% dzieci zakażenia Mycoplasma pneumoniae wskazuje na istotny udział tego czynnika w etiologii zapaleń płuc u dzieci. Wykazano, że Mycoplasma pneumoniae jest również przyczyną zapalenia płuc u niemowląt i małych dzieci. Wczesne rozpoznanie ma istotne znaczenie, ponieważ umożliwia wdrożenie prawidłowego leczenia. Słowa kluczowe: częstość, Mycoplasma pneumoniae, dzieci, Łódź, makroregion łódzki Introduction. Infections of the respiratory tract in children are one of the important clinical problems. Among causal factors, increasing and significant role is played by Mycoplasma pneumoniae. Aim of the study. The authors evaluated the frequency of Mycoplasma pneumoniae infections as the causal factor of pneumonia in children. Materials and methods. The group of 23779 children, aged 1 month to 18 years, treated in selected pediatric wards in Lodz and macroregion of Lodz since 2003 to 2007 were analyzed. Mycoplasmal infection was confirmed in 1313 children (5,5%). Results. The authors showed gradual increase of mycoplasmal pneumonias during particular years of observation, especially during last two years. Mycoplasmal pnaeumonias occured in each age group. The highest frequency was confirmed in children aged 7 years and above (43,7%). The frequency in children aged 2 to 3 years was 16,2% and in infants 17,9%. Conclusions. Diagnosis of mycoplasmal infection in 5,5% of children suggests that this causal factor plays important role in etiology of pneumonias in children. Authors showed that Mycoplasma pneumoniae should be considered as the cause of pneumonia also in infants and small children. Early diagnosis has crucial meaning, because of possibility of quick and correct treatment initiation Key words: Mycoplasma pneumoniae , frequency, children, Lodz, macroregion of Lodz

472

Pediatr Pol 2008; 83 (5): 472–476 © 2008 by Polskie Towarzystwo Pediatryczne

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów

P R AC A O RYG I N A L N A Barbara Kamer i inni t Częstość mykoplazmatycznych zapaleń płuc u dzieci w Łodzi i makroregionie...

473

Zakażenia układu oddechowego mogą być wywołane przez różne czynniki, a wśród nich również przez nietypowe, do których najczęściej należą Legionella sp., Mycoplasma pneumoniae oraz Chlamydia pneumoniae i trachomatis [1–4]. Częstość tych zakażeń wzrasta i stanowią one ponad 30% pozaszpitalnych zapaleń płuc i około 40–60% z nich wymaga leczenia szpitalnego [5]. Mycoplasma pneumoniae jako czynnik wywołujący pierwotne, atypowe zapalenia płuc została po raz pierwszy wyizolowana przez EATONA w 1944 r., a w 1963 r. uznana za bakterię i zakwalifikowana do rodzaju Mycoplasma [1, 6]. Nie posiada ściany komórkowej, co powoduje, że jest oporna na leczenie antybiotykami b-laktamowymi [4, 7, 8]. Zakażenie szerzy się drogą kropelkową lub przez kontakt bezpośredni, dlatego głównie chorują dzieci przebywające w dużych skupiskach [6, 9, 10]. Chorować mogą dzieci w każdym wieku, ale najczęściej zakażenie występuje między 5 a 15 rokiem życia. Okres wylęgania wynosi 2–3 tygodnie. Zachorowalność charakteryzuje się występowaniem fal epidemicznych co kilka lat, z nasileniem w okresie późnego lata i wczesnej jesieni [2, 4, 9, 11]. Częstość występowania zapaleń płuc o etiologii Mycoplasma pneumoniae (m.z.p.) oceniona jest na 3% do nawet kilkudziesięciu procent [5, 9, 12, 13]. Natomiast wśród chorych hospitalizowanych w szpitalu na 2,9% do ponad 34% [2, 3, 14–17]. Rozpoznanie jest trudne, ponieważ przebieg kliniczny nie jest swoisty [2, 3, 18]. Podobnie zmiany radiologiczne, zwłaszcza u małych dzieci, nie są charakterystyczne [2, 4, 19]. Zakażenie Mycoplasma pneu-

moniae można jedynie potwierdzić wynikami badań serologicznych. Wśród nich test immunoenzymatyczny ELISA jest najczulszą metodą i pozwala określić poziom swoistych przeciwciał w poszczególnych klasach immunoglobulin: IgM, IgG i IgA [8, 20]. Celem pracy była ocena częstości zakażenia Mycoplasma pneumoniae jako przyczyny zapalenia płuc u dzieci.

Pacjenci i metody Retrospektywną analizą objęto dokumentację medyczną dzieci z zapaleniami płuc, hospitalizowanych w latach 2003–2007 w wybranych szpitalach Łodzi i makroregionu łódzkiego. Częstość zakażeń Mycoplasma pneumoniae oceniono u 10 749 dzieci leczonych w trzech klinikach Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki oraz na Oddziale Chorób Płuc i Alergii Układu Oddechowego w Łagiewnikach (tab. 1), a także u 13 030 dzieci leczonych w czternastu szpitalach makroregionu łódzkiego (tab. 2). Łącznie analizą objęto 23 779 dzieci. Wiek badanych wahał się od 1 miesiąca do 18 roku życia. U każdego dziecka etiologię mykoplazmatyczną zapalenia płuc potwierdzono dodatnim wynikiem badania serologicznego.

Wyniki badań Wyniki analizy wykazały, że wśród 10 749 dzieci hospitalizowanych w Łodzi z powodu zapalenia płuc, u 484 rozpoznano zakażenie Mycoplasma pneumoniae (4,5% leczonych). Zaobserwowano również, że odse-

Szpitale Hospitals

Liczba dzieci z wiek dzieci (lata) age of children (years)

Chorób Płuc i Alergii Układu Oddechowego w Łagiewnikach Hospital of Lung Diseases and Respiratory Tract Allergy in Lagiewniki

III Klinika Pediatrii ICZMP 3rd Department of Paediatrics of Polish Mother’s Memorial Hospital Research Institute

Klinika Gastroenterologii ICZMP Department of Gastroenterology of Polish Mother’s Memorial Hospital Research Institute

Number of children with

zapaleniem płuc

m.z.p

pneumonia

mycoplasmal pneumonia

n

n

%

0–3

4764

65

2,4

0–18

1255

166

13,2

4–18

1202

166

13,8

0–3

3528

87

2,5

10749

484

4,5

II Klinika Pediatrii i Alergologii ICZMP 3rd Department of Paediatrics and Allergology of Polish Mother’s Memorial Hospital Research Institute

Ogółem Total

Tabela 1. Analiza częstości zakażeń Mycoplasma pneumoniae wśród dzieci z zapaleniem płuc hospitalizowanych w wybranych szpitalach w Łodzi Tabela 1. Analysis of mycoplasmal infections frequency in children with pneumonias, treated in selected hospitals in Lodz

P E D I AT R I A P O L S K A tom 83, nr 5, wrzesień–październik 2008

474

Oddziały pediatryczne szpitali rejonowych w:

Liczba dzieci z: Number of children with

wiek dzieci (lata)

Paediatric Wards of Hospitals in:

age of children (years)

zapaleniem płuc

m.z.p.

pneumonia

mycoplasmal pneumonia

n

n

%

Rawie Mazowieckiej

0-18

988

8

0,8

Brzezinach

0-18

281

16

5,9

Łowiczu

0-18

800

66

8,3

Radomsku

0-18

906

46

5,1

Piotrkowie Trybunalskim

0-18

1280

166

13,0

Bełchatowie

0-18

516

30

5,8

Wieluniu

0-18

733

58

7,9

Zduńskiej Woli

0-18

3244

279

8,0

Łasku

0-18

489

25

5,1

Pabianicach

0-18

1765

69

3,9

Poddębicach

0-18

613

12

2,0

Łęczycy

0-18

400

33

8,2

Kutnie

0-16

514

7

1,4

Tomaszowie Mazowieckim

0-18

501

14

2,8

13030

829

6,4

Ogółem Total

Tabela 2. Analiza częstości zakażeń Mycoplasma pneumoniae wśród dzieci z zapaleniem płuc hospitalizowanych w wybranych szpitalach makroregionu łódzkiego Tabela 2. Analysis of mycoplasmal infections frequency in children with pneumonias, treated in selected hospitals in macroregion of Lodz

% dzieci % of children

% dzieci % of children

12

12

8

8

4

4

0

2003

2004

2005

2006

2007

rok obserwacji year of observation Ryc. 1. Odsetek dzieci z m.z.p. hospitalizowanych w wybranych szpitalach w Łodzi w poszczególnych latach obserwacji Fig. 1. The percentage of children with mycoplasmal pneumonias treated in selected hospitals in Lodz, during particular years of observation

0 2003

2004

2005

2006

2007

rok obserwacji year of observation Ryc. 2. Odsetek dzieci z m.z.p. w szpitalach makroregionu łódzkiego w poszczególnych latach obserwacji Fig. 2. The percentage of children with mycoplasmal pneumonias treated in selected hospitals in macroregion of Lodz, during particular years of observation

P R AC A O RYG I N A L N A Barbara Kamer i inni t Częstość mykoplazmatycznych zapaleń płuc u dzieci w Łodzi i makroregionie...

475

tek dzieci z m.z.p. był zróżnicowany, tj. niższy u dzieci młodszych, a wyraźnie wyższy u dzieci od 4 do 18 roku życia (tab. 1). Analiza częstości występowania m.z.p. w poszczególnych latach obserwacji wykazała wzrost częstości zachorowań w ostatnich dwóch latach (ryc. 1). Ocena częstości m.z.p. u dzieci leczonych z powodu zapalenia płuc na czternastu oddziałach pediatrycznych makroregionu łódzkiego wykazała, że wśród 13 030 badanych 829 dzieci, tj. 6,4%, miało m.p.z., a odsetek ten wahał się od 2 do 13% w różnych szpitalach. Po-

% dzieci % of children 60% 50% 40% 30%

Omówienie

20% 10% 0%

<1

2-3

4-6

>7

wiek (lata) age (years) Łódź (Lodz) (n = 484) 115 100 Makroregion (Macroregion) (n = 829) 120 113 Ogółem (Total) (n = 1313) 235 213

122

147

169

427

291

574

Ryc. 3. Częstość występowania m.z.p. u dzieci z uwzględnieniem ich wieku Fig. 3. The frequency of mycoplasmal pneumonias in children, according to age.

Kutno 1,4% Łęczyca 8,2%

Łowicz 8,3% Zgierz

Poddębice 2,0%

Skierniewice

Łódź 4,5% Sieradz

Wieluń 7,9%

Brzeziny 5,9%

Zduńska Pabianice Wola 3,9% 8,0% Łask 5,1% Bełchatów 5,8%

Wieruszów

dobnie jak w Łodzi, stwierdzono systematyczny wzrost częstości m.z.p. w ostatnich dwóch latach obserwacji (ryc. 2). Ponadto u wszystkich badanych oceniono występowanie m.z.p. w poszczególnych grupach wiekowych, tj. w pierwszym roku życia, u dzieci 2–3-letnich, 4–6-letnich oraz w wieku 7 lat i starszych. Wykazano, że m.z.p. występowało w każdej grupie wiekowej, jednak w najwyższym odsetku u badanych w wieku szkolnym, a w najniższym u dzieci 2–3letnich oraz niemowląt (ryc. 3). U wszystkich 23 779 dzieci z Łodzi i makroregionu łódzkiego w okresie pięciu lat obserwacji m.z.p. rozpoznano u 1313 dzieci (5,5%). Częstość mykoplazmatycznego zapalenia płuc w poszczególnych powiatach makroregionu łódzkiego przedstawiono na ryc. 4.

Rawa Mazowiecka 0,8% Tomaszów Mazowiecki 2,8%

Piotrków Trybunakski 13,0%

Opoczno

Pajęczno Radomsko 5,1%

Ryc. 4. Częstość występowania m.z.p. u dzieci w poszczególnych powiatach makroregionu łódzkiego Fig. 4. The frequency of mycoplasmal pneumonias in children in particular districts of macroregion of Lodz

Zakażenie Mycoplasma pneumoniae należy do częstych przyczyn zapaleń płuc [2, 13, 15, 17]. Wśród analizowanych przez nas dzieci rozpoznano je u 5,5% badanych. Odsetek ten jest porównywalny z wynikami badań innych autorów [2, 15–17, 21]. Wielu badaczy wykazuje, że mykoplazmatyczne zapalenie płuc najczęściej występuje u dzieci w wieku szkolnym [3, 21–23]. Również nasze obserwacje wykazały najwyższy odsetek m.z.p. u dzieci powyżej siódmego roku życia. Należy jednak podkreślić, że w ostatnich latach wielu autorów zwraca uwagę, że m.z.p. występuje również u niemowląt i małych dzieci [2, 16, 17, 21, 24, 25]. Uwzględnianie tego czynnika etiologicznego w różnicowaniu zapaleń płuc u najmłodszych dzieci jest szczególnie ważne, ponieważ umożliwia wczesne zastosowanie prawidłowego leczenia. Jest to istotne, ponieważ Mycoplasma pneumoniae adsorbuje się na powierzchni nabłonka oddechowego, uszkadza metabolizm komórki i poraża aktywność ruchową rzęsek [9, 23, 26]. Może więc być czynnikiem usposabiającym do nawracających infekcji układu oddechowego. Ponadto u dzieci chorych na astmę oskrzelową, z powodu niszczenia nabłonka oddechowego, a tym samym nasilania nadreaktywności oskrzeli, niekorzystnie wpływa na przebieg choroby [27]. Badania KRAFTA i wsp. [28] przeprowadzone u dorosłych chorych na astmę wykazały, że zakażenie Mycoplasma pneumoniae może spowodować wydzielanie IgE i IgA, co wyzwala reakcję nadwrażliwości [28, 29]. W piśmiennictwie podkreśla się występowanie fal epidemicznych [1, 2, 4, 23]. W naszych obserwacjach również stwierdziliśmy zwiększony odsetek dzieci z m.z.p. w ostatnich dwóch latach, co wskazuje na możliwość występowania fal epidemicznych co 3–4 lata.

P E D I AT R I A P O L S K A tom 83, nr 5, wrzesień–październik 2008

476

Wnioski 1. Stwierdzenie u 5,5% analizowanych dzieci zakażenie Mycoplasma pneumoniae wskazuje na istotny udział tego czynnika w etiologii zapaleń płuc u dzieci. 2. Wykazano, że Mycoplasma pneumoniae jest przyczyną zapalenia płuc również u niemowląt i małych dzieci. 3. Wczesne rozpoznanie ma istotne znaczenie, ponieważ umożliwia wdrożenie prawidłowego leczenia.

16. Wąsowska-Królikowska K, Godzisz J, Dynowski J. Mykoplazmatyczne zapalenie płuc u niemowląt i dzieci do lat trzech w świetle obserwacji własnych. Przegl Pediatr 1996; 26(4): 429– 434. 17. Michelow IC, Olsen K, Lozano J, Rollins NK, Duffy LB, Ziegler T, i wsp. Epidemiology and clinical characteristics of community-acquired pneumonia in hospitalized children. Pediatrics 2004; 113(4): 701–707. 18. Esposito S, Blasi F, Bellini F. Mycoplasma pneumoniae and Chlamydia pneumoniae infections in children with pneumonia. Eur Respir J 2001; 17(2): 241–245.

PIŚMIENNICTWO

19. Biegański T, Kamer B, Majecka E, Lange A. Analiza zmian radiologicznych w mykoplazmatycznym zapaleniu płuc u nie-

1.

Siemion-Szcześniak I, Kuś J. Zapalenia płuc wywołane przez drobnoustroje atypowe: Legionella, Mycoplasma. i Chlamydia. Nowa Klin 2003; 10(3–4): 374–377.

2.

Kamer B, Biegański T, Lange A, Krzeszewska-Hawrot E. Analiza przebiegu klinicznego mykoplazmowego zapalenia płuc u niemowląt i młodszych dzieci. Pediatr Pol 1998; 73(5): 377–381.

3.

Cimolai N. Mykoplazmowe zapalenie płuc. Pediatr Dypl 1999; American Thoracic Society: Guidelines for the management of Care Med 2001; 163: 1730–1754.

rozpoznawanie i leczenie. Nowa Pediatr 1997; 1(1): 15–17. 24. Principi N, Esposito S. Mycoplasma pneumoniae and Chlamydia pneumoniae cause lower respiratory tract disease in paediatric patients. Curr Opin Infect Dis 2002; 15(3): 295–300. 25. Iwańczak F, Stawarski A, Iwańczak B, Wawro J. Obraz kliniczny zapaleń płuc wywołanych przez Mycoplasma pneumoniae u

na A, Małczyńska T, Borkowska A. Mykoplazmatyczne zapale-

dzieci. Pediatr Pol 2000; 75(5): 367–371.

Biernat-Sudolska M. Mykoplazmy chorobotwórcze dla człowieka. Mikrobiol Med 1996; 2(7): 30–36. Jędrys-Kłucjasz U, Kurzawa R. Atypowe zapalenia płuc u dzieci. Klin Pediatr 1998; 6(5): 10–12.

9.

Chest Dis 2001; 56(6): 527–534. 23. Rajtar-Leontiew Z. Mykoplazmowe zapalenie płuc u dzieci –

Korzon M, Kamińska B, Gołębiewski J, Bukowska W, Czaudernie płuc u dzieci. Pol Tyg Lek 1991; 46: 206–208.

8.

trics. Semin Respir Infect 2002; 17(1): 10–14. acquired pneumonia: role of atypical organisms. Monaldi Arch

adults with community-acquired pneumonia. Am J Respir Crit.

7.

1993; 17: 79–82. 21. Nelson CT. Mycoplasma and Chlamydia pneumonia in pedia-

Ocena obrazu klinicznego atypowych zapaleń płuc wywołanych

3(5): 23–30.

6.

fections. A critical review of current procedures. Clin Infect Dis

22. Cosentini R, Tarsia P, Blasi F, Roma E, Allegra L. Community-

Lek 2001; 54(1–2): 26–36.

5.

20. Jacobs E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae in-

Iwańczak F, Stawarski A, Iwańczak B, Choroszy I, Wawro J. przez Mycoplasma pneumoniae i Chlamydia sp. u dzieci. Wiad

4.

mowląt i małych dzieci. Pol Przegl Radiol 1996; 61(1): 25–28.

Abramowicz M, Kruszewski J. Mikoplazmozy. Alergia 2003; 31–34.

10. Kopytko I. Mykoplazmatyczne zapalenie płuc u dzieci. Klin Pediatr 1996; 4: 27–31.

26. Droszcz W. Zakażenia układu oddechowego a astma. Alergia 2005; 2(24): 43–44. 27. Emeryk A, Bartkowiak-Emeryk M. Zakażenie Mycoplasma pneumoniae i Chlamydia pneumoniae w astmie oskrzelowej u dzieci. Acta Pneumonol Allergol Pediatr 2002; 5(1): 37–40. 28. Kraft M, Cassell GH, Henson JE, Watson H, Williamson J, Marmion BP, i wsp. Detection of Mycoplasma pneumoniae in the airways of adults with chronic asthma. Am J Respir Crit Care Med 1998; 158: 998–1001.

11. Allegra L, Blasi F. Problems and perspectives in the treatment of

29. Lewandowicz-Uszyńska A, Jurowska-Liput J, Kozioł D, Jargu-

respiratory infections caused by atypical pathogens. Pulm Phar-

lińska-Forysiak E. Zakażenia mykoplazmatyczne – problem cią-

macol Ther 2001; 14: 21–27.

gle aktualny. Pol Merkuriusz Lek 2002; 12(70): 318–321.

12. Cassell GH, Cole BC. Mycoplasmas as agents of human disease. J Engl J Med 1981; 304: 80–89. 13. Bremont F, Micheau P. Etiology of chronic cough in children: analysis of 100 cases. Arch Pediatr 2001; 8(3): 645–649. 14. Ruiz M, Ewig S, Marcos MA, Martinez JA. Etiology of commu-

Adres do korespondencji:

Barbara Kamer II Klinika Pediatrii i Alergologii Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki

nity-acquired pneumonia: Impact of age, commorbidity and se-

ul. Rzgowska 281/289

verity. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160(2): 397–405.

93-338 Łódź

15. Principi N, Esposito S, Blasi F, Allegra L. Role of Mycoplasma

tel/fax: (0-42) 2711386

pnemoniae and Chlamydia pneumoniae in children with com-

e-mail: [email protected]

munity-acquired lower respiratory tract infections. Clin Infect

Pracę nadesłano 20.03.2008 r.

Dis 2001; 32: 1281–1289.