Effets de l'énucléation sur la transcription mitochondriale chez une amibe

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Experimental

EFFETS TRANSCRIPTION

Cell Research 81 (1973) 15-25

DE L’l?NUCLl?ATION MITOCHONDRIALE

SUR LA CHEZ

UNE

AMIBE

R. PERASSO Laboratoire

de Biologic

Cellulaire

4, Universitt!

de Paris

XI, 91405

Orsay,

France

SUMMARY This work compares the kinetics of incorporation of 3H-uracil into the mitochondria and cytosol of control amoeba and amoeba enucleated by microsurgery. Analysis of the autoradiographs gives the following results: 1. Mitochondria incorporate radioactive precursor in the absence of nucleus. 2. Incorporation is more rapid and reaches higher levels in the mitochondria of enucleate cells than in those of controls. 3. Concentration of radioactivity in the cytosol of enucleate cells is only slightly less than that observed in intact cells. These results show that mitochondrial transcription is elevated after enucleation; in other words, it seems to be restrained in the intact cell. It is therefore possible to envisage the hypothesis that mitochondrial transcription may be regulated by repressor substances originating in the nucleus.

Le p&sent travail compare les cinetiques d’incorporation de l’uracile-3H au niveau des mitochondries et du fond cytoplasmique dans des amibes normales et des amibes dnuclCCes par microchirurgie. L’Btude des autoradiographies montre les faits suivants : 1. Les mitochondries incorporent le pr&xrseur radioactif en absence du noyau. 2. Cette incorooration est nlus radde et ulus imuortante dans les cellules CnuclCtes sue dans les mitochondri& de cellules normaies. 3. La concentration de radioactivitC dans le cvtosol des cellules tnuclCtes n’est aue 1Cdrement inf&ieure & celle des cellules normales. Ces r6sultats montrent que la transcription mitochondriale est augmentee apr& suppression du noyau alors qu’elle semble freinCe dans un systeme cellulaire complet. L’hypothkse d’une rkgulation de la transcription mitochondriale par des represseurs d’origine nucldaire peut done Btre envisagke.

11 est maintenant bien Ctabli que la mitochondrie posstide un gtnome capable de transcription. La presence du noyau n’est pas nkcessaire& la rkplication de ce ginome puisque cette rkplication peut s’effectuer dans des mitochondries isolkes [6, 19, 22, 25, 35, 36, 401. I1 en est de m&me pour la transcription, qui a CtC observte dans des cellules tnucltCes [7, 8, 10, 26, 271 et dans des mitochondries isolkes [I 1, 24, 29, 34, 39, 41, 421. 2-731805

Si l’information gtkttique contenue dans la mitochondrie permet g celle-ci d’intervenir directement dans sa propre biogendse,elle demeure insuffisante pour en assurer l’autonomie : la mitochondrie depend, pour une large mesure, du pouvoir informatif du noyau. Cependant, le degrC d’indkpendance des synth&es mitochondriales reste g prkiser, et notamment, l’on peut se demander si l’ADN mitochondrial est capable de rkguler luiExptl

Cell Res 81 (1973)

MATBRIEL

ET TECHNIQUES

Les cellules utilides sont des amibes de I’espkce Thecamoeba sphaeronucleolus maintenues en culture sur gblose et nourries de bactkries et de petites amibes, suivant le pro&d& indiquk par Houssay & Prenant

[16]. Deux lots de quaranteamibessont prklevts.

Le premier lot sert de tkmoin. Les cellules du second lot sont CnucltCes. Cellules nuclktes et cellules Cnucl&es sont ensuite traitkes de la m&me man&e durant toute l’expkrience.

EnucIPation. Les &nucleations sont effect&es en chambre B huile, selon la technique de Comandon & de Fonbrune [9] avec le materiel dCcrit par ce dernier [13] (fig. 1). Nous avons employk l’huile de silicone S.I.200 (SociBtB Industrielle des Silicones) qui offre des caracttristiques physiques plus commodes

pour la micromanipulationque l’huile de uaraffine [15]. L’CnuclBation kst facilitee par la struciure particulibre de l’enveloppe nuckaire dont les deux membranes sont doubl& interieurement d’une << lamelle dense )k tr&s kpaisse, identique k celle d&rite par Gall [14] chez Amoeba proteus et Stelly et toll. 1331dans les neurones de la sangsue. Cette lamelle dense confkre ?t l’enveloppe nuckaire une grande rksistance mkcanique qui permet au micro-instrument d’expulser le noyau en totalit sans l’endommager. Marquage. Les cellules sont plackes dans de l’eau bidisrillke stkrile contenant de I’uracileJ’H-5 d’act. spCc. 25 Ci/mM, & raison de 250 &i/ml. Le milieu d’incubation est agitt conrinuellemenr. Les cellules y skjournenr 2, 4, 6 er 8 h. A l’issue de chacune de ces ptriodes, 6 k 10 cellules sont pr&vkes, rinckes plusieurs fois dans l’eau bidisrillke puis fix&es. Fig. I. Enuclkation d’une amibe par microchirurgie. (a) La cellule est maintenue sous la lamelle d’une chambre & huile par un microcrochet de contention; (b) la microaiguille pknktre dans la cellule et arrive au contact du noyau; (c) le noyau est piquC et pousst hors de la cellule par la microaiguille.

m&me sa transcription ou s’il est sous la dkpendance totale ou partielle de genes rkgulateurs nuclkaires. Dans le but d’aborder 1’Ctudede ces interrelations noyau-mitochondries, now avons chercht B savoir si le noyau a une influence sur la transcription mitochondriale. Pour cela, nous avons mesurCles cinttiques d’incorporation d’un prkurseur radioactif dans les ARN mitochondriaux de cellules CnuclCtes et les avons comparkes g celles de cellules nuck%es. Exptl CeN Res 81 (1973)

Fixation et inclusion. Les cellules sont fix&s durant 30 mn & 4°C par de la glutaraldkhyde k 2 % dans un tampon phosphate 0,05 M g pH 7,3, lakes 1 h dans le r&me tampon, puis postfi&es 1. h par le tCtroxide d’osmium & 2 % tampon& dans les mEmes conditions. Aprks un bref lavage, chaque cellule est enrobke dans un perit cube de gklose g 1 % d’environ 1 mm d’ar&e. To& les cubes de gklose ainsi obtenus sont d­dratks par I’acCtone et inclus dans le mklange Cponaraldite [37]. Les coupes sent pratiqukes avec un ultramicrotome Reichert Om U,, equip6 de couteaux de verre. Autoradiographie. Nous avons applique la technique de Larra & Droz [20] en employant l’tmulsion Ilford L4, et un temps d’exposition de 6 semaines. Mgthode de comptage de la radioactivitk. Deux compartiments cellulaires ont ttC consid&& : le compartiment mitochondrial, constituk uniquement des mitochondries, et le fond cytoplasmique ou cytosol, qui comprend le cytoplasme moins les mitochondries, les vacuoles et les bactkries symbiontes. Nous avons &aluC la radioactivitk de ces deux compartiments en comptant les grains d’argent situ& sur les surfaces correspondantes. Les comptages ont et6 effect&s sur des coupes entikres de cellules g raison de quake coupes situ&s B des niveaux diffkrents pour chaque

Transcription

mitochondriale

apt& &ucl&ation

17

Fig. 2. Noyau d’une amibe ayant subi un marquage durant 8 h. Ce noyau possbde une enveloppe tapisske inttrieurement d’une kpaisse (( lamelle dense )) (voiufkche). Seule la rtgion pCriphCrique du nuclkole (N) prksente un marquage. m, mitochondrie; U, vacuole. x 14 500.

Exptl

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18 R. Perasso sent exprimks en nombre de grainsd’argentpar 100,umZde compartimentcellulaireconsid&.

cellule. Les rhltats

RESULTATS Observations ultrastructurales L’amibe prCsente deux zones distinctes : l’ectoplasme, riche en ribosomes libres, et l’endoplasme, oti sont situ& les inclusions cytoplasmiques et le noyau. Ce noyau poss&de un gros nuclCole sphtrique et une d’une enveloppe tapissCe inttrieurement (( lamelle dense N Cpaisse(fig. 2). Les mitochondries, nombreuses, ont une longueur de 1 g 2 pm environ et prksentent les caracteres des mitochondries des protistes en g&&al, leur trait morphologique le plus tvident &ant de posstder des c&es tubulaires. Les dictyosomes et les vacuoles sont abondants. Par contre, l’ergastoplasme est rare. Des microorganismes symbiontes de type bactCrien sont presents dans l’endoplasme (fig. 3 et 4). La presence de tels microorganismes a CtC observCe par diffCrents auteurs chez Amoeba proteus [18, 28, 431. L’endoplasme est en outre parcouru par un rCseau de fibrilles (fig. 5a, b). L’CnuclCation n’a pas de &percussion immtdiate sur l’ultrastructure de la cellule. Durant les 8 premitres heures suivant l’ablation du noyau, on ne note aucune modification morphologique des organites cytoplasmiques. Cette observation est en bon accord avec les travaux de Flickinger [ 121 et de Houssay [15]. Marquage des cellules nucl&es (a) Marquage mitochondrial. AprGs 2 h d’incorporation les mitochondries sont peu marqutes et on n’observe que quelques grains d’argent B leur niveau (fig. 3b). Le marquage augmente de faGon constante en fonction du temps d’incorporation jusqu’8 6 h (figs 4b, 6). La concentration de radioactivitk mitoExptl

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chondriale moyenne est alors de 37 grains d’argent par 100pm2. Au temps 8 h, la radioactivitC mitochondriale est identique, ce qui se traduit par un plateau sur la courbe. (b) Marquage du cytosol. Le fond cytoplasmique prtsente un marquage faible qui augmente en fonction du temps d’incorporation (figs 36, 4b, 5b). La concentration de radioactiviti, qui est de 2 grains d’argent par 100 pm2 au temps 2 h, atteint 11 grains d’argent par 100pm2 au temps 8 h. Marquage des cellulesPnucMPes (a) Marquage mitochondrial. Dans le cas des cellules tnuclttes, on constate une incorporation rapide et importante du prtcurseur dans les mitochondries (fig. 6). D&s 2 h de marquage, les mitochondries prksentent une radioactiviti Clevte (28 grains d’argent par 100 ,um2) (fig. 3a). Cette radioactivitt croit rapidement jusqu’g 4 h (fig. 4a), temps pour lequel la concentration de radioactivitk est de 75 grains d’argent par 100 pm2. A partir de ce temps le marquage mitochondrial se stabilise (fig. 5a). (b) Marquage du cytosol. Le marquage du fond cytoplasmique est faible (3 grains d’argent par 100 pm2 au temps 2 h). 11augmente en fonction du temps d’incorporation jusqu’g 4 h, puis se stabilise. La concentration de radioactivitt maximum observCe est de 7 grains par 100pm2. Comparaison entre cellules nucl&es et cellules Pnucltfe’es Si on compare les courbes obtenues & partir des cellules normales avec celles obtenues B partir des cellules CnuclCCes(fig. 6), on peut faire les remarques suivantes : (a) Dans les cellules CnuclCCes la concentration de radioactivite dans les mitochondries croit beaucoup plus rapidement que dans les cellules nuclCCes : elle est deux fois plus importante pour un temps d’incorporation

Transcription

~7itochondriale

aprPs &nwSation

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Fig. 3. Autoradiographies de cellules Bnucl&es (a) et nucl&es (b) ayant subi un marquage de 2 h. m, mitochondrie; ZI,vacuole; fltches : microorganismes symbiontes. x 18 000. Exptl Cell Res 8I (1973)

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R. Perasso

Fig. 4. Autoradiographies de cellules BnucWes (a) et de cellules nuclCCes (6) ayant subi un marquage de 4 h. Le marquage mitochondrial est abondant dans les cellules CnuclCCes.On note la pr6sence d’un microorganisme symbionte marquC dans le cytoplasme (fkche). M, mitochondrie; u, vacuole. x 18 000. Exptl

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Transcription

mitochondriale

aprts tkuclkation

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Fig. 5. Autoradiographies de cellules CnuclC6es (a) et nucl&+es (h) ayant subi un marquage de 8 h. Les mitochondries de la cellule dnucl&e sont presque toutes radioactives. m, mitochondrie: V, vacuole; N, noyau; flkches : fibrilles. x 18 000. Exptl

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R. Perasso Bruit de fond

Plusieurs comptages du bruit de fond ont CtC effect& sur diffkrentes prkparations. En aucun cas le bruit de fond ne dCpasse 0,2 grains d’argent par 100 ,um2. 11 est done trGs faible et n’entraine pas de correction des chiffres ci-dessus. DISCUSSION

Fig. 6. Abscisses : temps d’incorporation ordonnties : concentration de radioactivitk

(heures); exprimke en nombre de grains d’argent par 100 pm2 de compartiment cellulaire consid&& W--W, Mitochondries de cellules nucl&es; O-D, cytosol de cellules nucl&es; O-O, mitochondries de cellules BnuclCkes; O-O, cytosol de cellules CnuclBCes. Les temps d’incorporation s’tchelonnent toutes les deux heures jusqu’& 8 h. Chaque point correspond A une concentration de radioactivitk moyenne obtenue g partir de comptages effect& sur les autoradiographies de 6 B 10 cellules, A raison de 4 coupes entikres par cellule. Les intervalles de confiance correspondant aux points des courbes cytosol sont faibles et ne sont pas indiquks.

de 2 h et trois fois plus pour 4 h. Ceci se traduit par une pente beaucoup plus forte de la courbe relative aux mitochondries des cellules tnucl6Ces. (b) Dans les deux cas, les courbes de concentration de radioactivitt mitochondriale atteignent un plateau. Ce plateau est atteint dts 4 h dans le cas des cellules CnuclCCes et seulement g 6 h dans le cas des cellules nucltkes. (c) Ces plateaux correspondent g des concentrations de radioactiviti diffkrentes, deux fois plus importantes dans le cas des cellules tnuclCCes que dans celui des cellules nuclttes. (d) Les courbes obtenues pour le cytosol ne prtsentent pas de difftrence significative durant les quatre premiQes heures de marquage. Au de&, le marquage du cytosol continue d’augmenter dans les cellules nucl&es, alors qu’il se stabilise dans les cellules tnuclCCes. Exptl

Cell

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En associant la microchirurgie, qui permet d’kliminer le noyau d’une cellule de faGon incontestable, et l’autoradiographie B haute rksolution, qui permet de localiser tr&s finement la source radioactive dans la cellule, nous montrons que, chez l’amibe, le gCnome de la mitochondrie reste capable de transcription en absence du noyau. L’Ctude comparative des cinttiques de marquage des ARN dans les cellules nuclkes et dans les cellules CnucltCes montre, au surplus, deux faits importants. Le premier est que le marquage mitochondrial est plus intense et s’effectue plus rapidement dans les cellules tnuclCCes que dans les cellules nuclCCes. Le second est que la concentration de radioactivitk du cytosol des cellules CnuclCkes est peu difftrente de celle des cellules nuckes. Le marquage mitochondrial

Plusieurs hypothtses peuvent &tre avanckes pour expliquer l’accroissement du marquage des mitochondries apr& tnuclCation. (a) L’une d’elles est que cette augmentation de marquage correspond k une plus grande radioactivitt spkcifique des ARN synthttists. On sait que, s’agissant de macromokules soumises

g renouvellement,

la radioactivitd

sptcifique que ces macromolCcules sont capables d’incorporer atteint un maximum qui correspond B la radioactivitk spkifique du prkurseur present dans le pool interne. Le plateau qui s’ktablit libre entre l’anabolisme

alors marque l’kquiet le catabolisme

Transcription des macromolecules envisagees. Une augmentation de la taille du pool interne du precurseur se traduit par une augmentation de la vitesse de marquage, et non par une elevation du niveau maximum. Dans le cadre de nos experiences, il est evident que le pool interne de precurseur radioactif varie lorsqu’on en&e le noyau. Dans une cellule normale, le noyau prelke une certaine quantite de nucleotides du pool present dans le cytoplasme pour effectuer ses syntheses d’ARN. Apt-es l’enucleation, ce pool se trouve &tre a la seule disposition des mitochondries, et on peut mCme penser qu’il est encore augment5 par un apport suppltmentaire de prtcurseur dQ a une plus grande permtabilitt de la membrane plasmique traumatisee. Les mitochondries voient done un pool augment& On observe en effet une pente plus forte et un plateau plus prtcoce de la courbe (( mitochondrie )) des cellules CnuclCCes. Mais on observe aussi que ce plateau est a un niveau plus tlevt (deux fois plus de grains d’argent par unite de surface). Dans l’hypothese envisagee, nous serions obliges d’admettre que la radioactivitt specifique du prtcurseur du pool interne varie du simple au double avec l’tnucleation. Ceci pourrait s’expliquer de deux facons : (1) Epuisement du prkurseur radioactif dans le milieu d’incubation des cellules normales. Nous avons Cvitt cet inconvenient en utilisant un volume de milieu grand en regard du volume des cellules (1 ml pour 10 a 20 cellules). De plus, on constate que le marquage cytoplasmique des cellules normales est tres faible compare a celui des mitochondries, m&me au bout de 8 h d’incorporation. Ceci est dQ au fait que l’amibe possede une activite mttabolique restreinte : elle effectue peu de mouvements, et ses divisions, qui se deroulent toutes les 24 a 36 h sur milieu gelost, se trouvent stopptes dans les conditions dans lesquelles nous

mitochondriale

apt-t% e%nucle’ation 23

faisons le marquage (milieu aqueux sans nourriture). Le noyau n’utilise done qu’assez peu de molecules radioactives, et ne fait diminuer le pool d’uracile-3H que dans une faible proportion. Nous devons done Ccarter cette premiere explication. (2) Dilution isotopique diminuee par l’tnucltation. La cellule possede, avant le marquage, un pool de prtcurseur froid. Au debut du marquage, le precurseur radioactif pen&rant dans le cytoplasme, se trouve dilut par le pool initial froid, et sa radioactivite specifique se trouve abaissee. Dans le cas des cellules tnucletes, les syntheses d’uracile sont assez vite stoppees, et le pool initial n’ttant plus reconstitue, la dilution isotopique est moins importante que dans les cellules nucltees. I1 semble cependant que ceci ne puisse expliquer en totalitt la difference des niveaux maximum de marquage mitochondrial. Les doses d’uracile dans le milieu externe sont importantes, et on sait que la taille du pool interne est conditionnee en partie par la concentration du precurseur dans le milieu. I1 est vraisemblable que le pool initial d’uracile dans la cellule est faible devant l’apport massif d’uracile ajoute dans le milieu et que, par consequent, dans un cas comme dans l’autre, la dilution isotopique n’est pas importante. Ces conclusions nous am&rent a formuler une deuxieme hypothese. (b) Cette autre hypothese est qu’une augmentation des syntheses d’ARN mitochondriaux fait suite a Yenucleation. On peut imaginer le mecanisme suivant d’interaction noyau-mitochondries. Bien que possedant toute la machinerie necessaire pour effectuer des syntheses proteiques, la mitochondrie est incapable de la gouverner en totalitt, ne possedant pas un systeme complet de regulation. L’harmonie fonctionnelle existant entre la mitochondrie et le reste de la cellule est maintenue par le noyau qui gouverne les syntheses mitochondriales en rtgulant la Exptl

Cell

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R. Perasso

transcription par une repression permanente, plus ou moins importante. Le noyau CliminC de la cellule, la mitochondrie se trouve alors lib&e de cette contrainte nucltaire et synthetise de I’ARN de faGon non contralee, jusqu’a Cpuisement du pool de nucleotides present dans la cellule. De telles interferences entre noyau et organites cytoplasmiques ont CtC mises en Cvidence sur des Acttabulaires. En effet, une nette augmentation des syntheses d’ARN chloroplastiques a CtC constatee darts des cellules CnuclCCes, quand ces cellules ont sejourne durant 10 jours a l’obscuritt avant l’tnucltation [31, 321. Dans ce cas, il semble que des signaux d’origine nucleaire soient synthetises durant la ptriode obscure et accumules dans le cytoplasme. Les signaux deviennent actifs aprb l’enucleation lors de la ptriode d’illumination. 11 est fort probable que des interactions nucleo-mitochondriales existent chez toutes les cellules eucaryotiques. Un modele d’une telle interaction est propose par Lloyd et ~011. [21] pour expliquer l’augmentation du nombre de mitochondries et l’arret de la croissance chez Tetrahymenapyriformistraitk au chloramphtnicol. Dans cette hypothese, un initiateur code par le noyau et traduit dans le cytosol, serait a l’origine de la replication de I’ADN mitochondrial. La synthese de cet initiateur serait, elle-m&me, temptree par un represseur d’origine mitochondriale. Un autre modele est avanct par Barath & Kiintzel [3] pour essayer d’expliquer le fonctionnement de l’appareil genttique mitochondrial et ses interrelations avec l’appareil genttique nucleaire chez Neurospora crassa. Ces auteuri pensent que beaucoup des prottines intervenant dans le fonctionnement de l’appareil gtnetique mitochondrial, sinon toutes, sont cod&es par le noyau et traduites par les ribosomes cytoplasmiques. Un represseur d’origine mitochondriale controlerait le foncExptl

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tionnement des genes nucleaires codant pour ces proteines. Bien que ces deux modtles proposes ne soient pas compatibles avec nos resultats exptrimentaux, on peut cependant supposer qu’un mecanisme d’interaction noyau-mitochondries existe. Dans ce cas, le noyau gouvernerait les syntheses mitochondriales par l’intermediaire d’un represseur bloquant la transcription dans cet organite. Le marquage du cytosol

Le second point a expliquer est la quasi similitude des courbes de radioactivite du cytosol des cellules CnuclCCes et des cellules nucleees. Le marquage, bien que faible, est significatif, sa valeur ttant nettement superieure au bruit de fond. Dans les cellules nucleees, ce marquage provient des ARN synthetists dans le noyau et ayant migre dans le cytoplasme. Quand le noyau est elimine de la cellule, le marquage du cytosol ne peut plus s’expliquer de la m&me faqon. Cette presence de radioactivite n’est pas due a une retention de molecules de precurseur car ces dernibes sont tlimintes avec efficacitt lors des lavages dans le tampon quand le materiel est constitut de cellules isolees et non d’un tissu compact [23]. L’hypothese d’une transcription au niveau d’un ADN cytoplasmique autre que mitochondrial peut &tre envisagee. L’existence dun tel ADN a ttC montree par certains auteurs [4, 5, 30, 381. Un role de transporteur d’information entre le noyau et le cytoplasme lui est parfois attribue [4]. Cependant, Williamson [38] considbe que cet ADN cytoplasmique est simplement un produit de degradation de I’ADN nucleaire sans aucun role informatif. Dans ce cas, l’hypothese dune transcription au niveau d’un tel ADN doit ttre repoussee. De plus, il est evident que si une telle transcription existait dans le cytoplasme des cellules Cnucleees, elle existerait Cgalement dans les cellules nucleees.

Transcription

Dans ce cas, si on retranche dans les cellules normales la part de radioactivitt due a ce phenomene, la quantitt de radioactivite issue d’ARN d’origine nucleaire est trop infime pour que l’on puisse retenir cette hypothese. Pour la meme raison, cette radioactivite ne peut rtsulter d’une transcription au niveau d’un ADN viral, comme le suggerent Ito et ~011. [17] ni d’une migration d’ARN synthttises par des microorganismes symbiontes. L’etat actuel de nos travaux ne nous permet pas d’expliquer clairement l’origine de ce marquage du cytosol des cellules tnucleees. Une hypothese, semblable a celle suggtree par Attardi & Attardi [I, 21 consiste a envisager une migration, vers le cytosol, de certains ARN transcrits dans la mitochondrie. Ceci serait en accord avec la seconde des possibilites exposees ci-dessus, d’une transcription mitochondriale exaltee aprb l’enucleation. La presence d’ARN d’origine mitochondriale dans le cytosol serait, dans ce cas, particulierement importante, les mitochondries transcrivant au maximum de leurs possibilites. Nous tenons a remercier Madame Elisabeth Boissonneau pour sa precieuse aide technique. Ce travail a beneficie de l’aide materielle du CNRS (ERA 174), de la DRME (contrat 71/499) et du CEA (participation a l’achat de molecules marquees).

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Recu le 19 octobre, 1972

Exptl

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