Expression d'hémoglobine humaine recombinante

Rev. Fr. Transfus. H6mobiol., 1992, 35, 407-415

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MEMOIRE ORIGINAL

Expression d'h6moglobine humaine recombinante p a r J. P a g n i e r , V. B a u d i n , C. P o y a r t

RESUME La crainte grandissante li~e aux risques infectieux a accdldrO les recherches visant gtla r~alisation d'un substitut d la transfusion sanguine. Les biotechnologies ont apportd la possibilitO d'une source d'hdmoglobine (Hb) autre que Ie sang humain pOrimd ou le sang de bceuf. De I'Hb humaine a OtO synthdtisde dans des microorganismes (E. coli, S. cerevisiae) et dans des porcs transgOniques. Les propridtds fonctionnelles de ces Hb recombinantes sont simiIaires ?t celles de l'Hb humaine native. L'ing~nierie des protdines permet d'introduire des mutations dans les sOquences codant pour les sous-unitOs de globine, dans le but de modifier les propridt~s et de les adapter au transport de l'oxygOne. Les problOmes essentiels concernent ~galement les procddds de purification, la production gt grande dchelle et la conservation du produit.

S UMMAR Y

Expression of recombinant human hemoglobin The well recognized prevalence of infectious agents in products derived from human whole blood and the increasing number of transfusion-transmitted diseases has made urgent the search for a safe alternative to conventional blood transfusion. Sources of hemoglobin (Hb) different from outdated human bank blood are under active scrutiny in several laboratories. Different approaches have been propoTzrds dt part "J. P a g m e r INSERM U 299, H6pital de Blc~tre, 94275 Le Kremhn-Bic&re

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sed to produce recombinant human Hb in bacteria (E.coli), yeast (S. cerevisiae) and transgenic mammals. These efforts have lead to the synthesis of recombinant human Hb with functional properties similar to those of native human Hb A. Site directed mutagenesis enables one to modify the structure of the recombinant globin chains with the view of lowering the oxygen affinity and increasing the stability of the tetramers. Progress is still necessary to ensure scaling-up and safe purification procedures, and to prolong shelf life of these solutions.

Chez les vert6br6s l'h6moglobine (Hb) assure le transport des gaz respiratoires, oxyg6ne et gaz carbonique. La transfusion sanguine, seul moyen efficace de compenser une perte importante de sang est devenne, au moins dans les pays 6conomiquement d6velopp6s, un acte routinier mais loin d'fitre anodin. Les risques, infectieux et immunologiques notamment, ont conduit, depuis d6jh plusieurs d6cennies, h rechercher un transporteur d'oxyg~ne de remplacement. Ces probl6mes ont malheureusement pris une arnpleur dramatique. Les virus du SIDA, des hdpatites B e t C, la crainte de voir apparakre de nouveanx vecteurs de maladies encore inconnues sont autant de facteurs qui rendent imp6rative et urgente la raise all point d'un substitut h la transfusion sanguine. Les recherches ont concern6 essentiellement des produits de synthbse chimique, les perfluorocarbones, et les solutions d'h6moglobine (Hb) (Dellacherie et coll., 1987; Winslow, 1992). Cette derni~re strat6gie n6cessite de modifier la moldcule d'Hb (humaine ou bovine) par voie chimiqne, afin de la rendre apte, en solution, au transport de l'oxyg6ne in vivo. Toutefois les risques infectieux persistent avec l'utilisation de sang humain p6rim6 dont la disponibilit6 est de plus en plus limit6e. L'utilisation d'Hb bovine rdsoudrait le probl6me d'approvisionnement. Un substitut sanguin/t base d'Hb bovine a r6cemment 6t6 test6 chez des enfants dr6panocytaires, sans provoquer de r6actions immunologiques (Feola et coll., 1992); cependant, l'absence de r6actions dues h des injections r6p6t6es reste h prouver. Une alternative est offerte avec les biotechnologies et la possibilit6 d'exprimer, dans divers organismes, des prot6ines h6tfirologues. De l'Hb recombinante identique &l'Hb humaine a 6t6 obtenue dans des microorganismes (Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae) et darts des animanx transg6niques (souris, porc). L'ing6nierie des protdines permet 6galement d'introduire une ou des mutations dans la s6quence en acides amin6s afin d'adapter les propri6t6s de la prot6ine anx besoins transfusionnels (Pagnier et Poyart, 1992). Au cours de cet expos6 nous allons d6crire les diff6rents systbmes d'expression d'h6moglobine humaine recombinante actuellement disponibles, en soulignant leurs avantages et inconv6nients respectifs. L'expos6 suivant abordera les applications h la rdalisation d'une h6moglobine modifi6e apte au transport d'oxyg6ne in vivo.

HEMOGLOBINE RECOMBINANTE

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E X P R E S S I O N DES SOUS-UNITES DE GLOBINE SOUS FORME DE PROTEINE DE FUSION

L'Hb humaine est une prot6ine oligom6rique constitu6e par l'assemblage de deux dim6res a[3. Chacune des sous-tmit6s est li6e/t un groupement prosth6tique, l'h6me, site de fixation r6versible de l'oxyg6ne. I1 s'agit donc d'une protdine complexe, et les premibres approches ont consist6 /t produire s6par6ment les deux sous-unit6s prot6iques. Le premier systbme d'expression mis au point par Nagai et Thogersen (1984) permet de synth&iser la sous-tmit6 [3 de globine dans Escherichia coli sous la forme d'une prot6ine de fusion insoluble. Le vecteur d'expression pLcIIFX[3-globine contient, en amont du cDNA de ]3 globine : - une s6quence nucl6ofidique comportant le promoteur PL du phage )~, promoteur extr6mement efficace ; - la s6quence nucldofidique codant pour la pattie N-terminale de la prot6ine cII du phage )~, prot6ine hautement exprim6e sous le comr61e du promoteur PL ; - un oligonucl6otide codant pour le tdtrapeptide Ile-Glu-Gly-Arg, site reconnu et cliv6 sp6cifiquement par le facteur de coagulation X activ6 (FXa). Une teUe construction plasmidique assure une traduction tr6s efficace du g~ne hybride et l'61imination du r6sidu m6thionyl N-terminal, r6sidu qui n'est pas cliv6 par le syst6me enzymatique d'E. coil La s6quence de la sous-unit6 [3 recombinante est doric strictement identique /~ celle de la sous-unit6 naturelle, avec un r6sidu valyl N-terminal. L'int6grit6 des s6quences terminales des sous-unit6s est importante pour des 6tudes fonctionnelles, en raison de leur contribution/~ la r~gulation de l'affinit6 pour l'oxyg6ne par les effecteurs allost6riques. Pratiquement, apr6s extraction et purification de la prot6ine de fusion, les cha~nes ]3 de globine sont lib6r6es par clivage en pr6sence du facteur de coagulation Xa. Cette m6thode n6cessite la renaturation de la sous-unit6 [3 et la reconstitution du t6tram6re a2~2/~ partir de la globine [3 recombinante (E coli), de chaine a native et d'h~mine exog6ne. Mnsi a 6t6 produite la premi6re Hb humaine recombinante ,, semi-synth6tique ,,. Le t6tram6re d'Hb ~t2]32 (E. coli) pr6sente des propri~t6s fonctionneUes identiques /~ celles d'une IIb humaine native normale (Nagai et coll., 1985). L'expression des chaines ~ ~ l'aide d'un vecteur du m~me type, sous la forme d'une prot6ine de fusion clivable par le facteur Xa bien que plus difficile a 6galement 6t6 r6alis6e (Ishimori et coll., 1989 ; Jessen et coll., 1992) permettant d'obtenir la premi6re Hb enti~rement synth&ique, identique ~ l'Hb humaine normale native. Les proc6dures de purification de la prot6ine, puis de reconstitution du t6tram6re d'Hb sont lourdes. Ces m6thodes, difficilement transposables ~ l'6chelle industrielle, restent toutefois extr~mement utiles en recherche. En effet, la prot6ine de fusion repr6sente 15 /~ 20 % des prot6ines totales synth6tis6es par la bact6rie, rendement qui assure

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PAGNIER J. el coll.

l'obtention de quantit6s d ' H b suffisantes p o u r les 6tudes fonctionnelles et structurales. L'identit6 des param6tres fonctionnels des Hb recombinantes et natives autorise la comparaison directe des propri6t6s d ' H b recombinantes mutdes avec celles d ' u n e Hb normale native. Le syst6me d'expression initial de Nagai et Thogersen (1984,1987) a 6t6 modifid ult6rieurement afin d'y apporter des am&liorations (rendement, stabilit& du plasmide, syst&me d'induction) mais en conservant le principe d ' u n e prot6ine de fusion chv&e par le facteur Xa. Plusieurs variants de l'Hb, produits avec ces syst~mes ont 6t6 d&crits, dont plusieurs out 6t6 r6alis6s dans le but d'obtenir une Hb dont l'affinit6 diminu&e pour l'oxyg&ne serait adapt6e aux besoins transfusionnels (Nagal et coll., 1985 ; 1987 ; Olson et coll., 1988 ; Ishimori et coll., 1989 ; Baudin-Chich et coll., H u a n g et coll. ; Lin et co]]. ; Pagnier et coll., 1990 ; Imai et coll. ; Tame et coll., 1991 ; Bihoreau et coll. ; Jessen et coll., 1992).

E X P R E S S I O N D ' H E M O G L O B I N E SOLUBLE DANS ESCHERICHIA COLI

En 1990, Hoffman et coll. ont mis au point un syst6me de coexpression des sous-unit6s a e t [3 dans E. coli en utilisant des s6quences codantes synth6tiques assembl6es en un seul op6ron. Les deux sous-unit6s sont exprim~es sous le contr61e du p r o m o t e u r Ptac. Les a et [3 globines se replient et s'associent/~ l'h6me endogbne p o u r f o r m e r le t6tram~re a2~2. L ' H b s'accumule sous forme soluble dans la bact&rie et repr6sente 5-10 % des prot6ines totales. I1 semble que la biosynth6se endog&ne d ' h 6 m e ne soit pas suffisante puisque les auteurs ont 6galement mis en 6vidence la pr6sence d ' u n e fraction h6moglobinique d6ficiente en heine. Avec le m&me type de plasmide et sous te contr61e du m6me p r o m o t e u r , reals en absence de la sous-unit6 partenalre, la [~-globine est synth6tis6e mais reste insoluble et ne fixe pas d ' h e m e . Darts les m6mes conditions, l'a-globine n'est d6tect6e qu'g l'6tat de traces. L'Hb recombinante produite dans E. coli fixe l'oxyg&ne de fagon r6versible et coop6rative, mais ne pr6sente pas toutes les propri6t6s fonctionnelles d ' u n e Hb h u m a i n e normale. La diff6rence majeure r6side dans la r6ponse aux effecteurs allost6riques, ions H + (effet Bohr), ions C1et phosphates organiques. Les anomalies rdsultent de la persistance du r6sidu m6thionyl en position N-terminale des sous-unit6s : seulement environ 10 % des chalnes a ont p e r d u le rdsidu m6thionyl terminal, la mdthionyl aminopeptidase des procaryotes ~tant trbs peu efficace dans ces conditions. Looker et coll. (1992) ont modifi6 la construction plasmidique p e r m e t t a n t la coexpression des sous-unit6s a et [3 de globine dans E. c o l i : les sous-unit6s a sont produites sous forme dimdrique, a-a, h6es par l'interm6diaire d ' u n r6sidu glycyl entre l'arginine terminale d ' u n e sousunit6 et la valine initiale d ' u n e deuxi6me sous-unit6. Sous cette forme, les

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sous-unit6s a conservent la capacit6 de s'assembler c o r r e c t e m e n t aux sous-unit6s partenaires 13 e t / t l'h6me p o u r f o r m e r une Hb soluble. La structure t6tram6rique est stabifis6e par une liaison covalente (lien pepfidique) entre les dimbres a~ (fig 1). Les r6sidus N-terminaux fibres des sous-unit6s (deux chahaes 13, une cha~ne di-a) sont des m6thionines. Seuls les r6sidus COOH-terminaux des cha~nes 13, et le r6sidu COOHterminal du dimbre a sont identiques/~ ceux du t6tram6re d ' H b humaine native. Si p o u r des 6tudes de relation structure-fonction l'int6grit6 de la s6quence terminale des sous-unit6s a et 13est importante, le problbme est diff6rent pour la mise au point d ' u n substitut sanguin. I1 s'agit d'obtenir u n produit apte ~ fixer l'oxygbne et/a le d61ivrer aux tissus. La capacit6 de r6agir n o r m a l e m e n t aux effecteurs allost6riques n'est pas primordiale p o u r u n produit utilisable en m6decine d'urgence. Par contre, la stabilit6 sous forme t6tram6rique est essentielle p o u r 6viter une 61imination r6nale trop rapide. La demi-vie de l'Hb recombinante ,, stabilis6e ,, sous forme t6tram6rique est augment6e par rapport ~ celle d ' u n e Hb non modifi6e. Plus r6cemment, H e r n a n et coll. (1992) ont compar6 l'efficacit6 d'expression des sous-unit6s d ' H b dans diff6rentes conditions : constructions plasmidiques diverses c o m p o r t a n t soit les cDNA a et 13naturels, soit des s6quences codantes synth6tiques, avec des p r o m o t e u r s diff6rents. Le choix de codons pr6f6rentiellement utilis6s par E. coli appara~t fondamental pour la coexpression des chaines a et [3 et l'accumulation de quantit6 convenable d ' H b soluble. Avec une construction polycistronique et sous le contr61e du p r o m o t e u r lac, l'Hb a2[~2 est produite de fa~on constitutive jusqu'/~ 10 % des prot6ines totales de la bact6rie. Dans les

I

1--4

NH2

TM

4

[ COOH NI-I2

1 Met

+ h~me endog~ne

COOH

1 Met

-~

FIG 1 - Repr6sentatlon sch~matique des sous-tmit6s ct et [3 de globme synthdtls6es dans E coh (d'apr~s Looker et coll., 1992). Les sous-tmit6s polypeptidiques sont coexpnm6es sous le contr61e d ' u n m~me p r o m o t e u r (TAC) La cha~ne a est prodtute sous forme dim6nque (di<0 l'extr~mit6 COOHterminale (Arg) d ' u n e premiere sous-umt6 est li~e fi la vahne tamale NH2 d ' u n e deuxi6me sous-unit6 p a r l'mterm6dlaire d ' u n r~sidu glycyl (haison peptidlque). Les sous-unit6s dl-ct et [3 s'assemblent en utilisant l'h~me endog6ne p o u r former u n t6tram~re az[32fonctlonnel, dont la structure tOtram+nque est stabilis6e p a r une haison covalente entre les deux dam6res ct[3

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P A G N I E R J. et coll.

conditions utilis6es par ces auteurs, la synthhse d'hbme endog6ne n'apparait pas comme limitante. Hernan et coll. ont 4galement produit la sous-unit6 [3-globine isol6e sans avoir h recourir h une prot6ine de fusion. L'utilisation du promoteur du bact6riophage T7 permet une expression constitutive de globine (10 % des prot4ines totales de l'h6te) quelle que soit la nature de la s4quence codante, synth6tique ou cDNA. Aucun des systhmes testds n'a permis d'obtenir l'~z-globine isol4e. En pr6sence d'h~me les sous-unit6s [~ peuvent s'associer en t4tram6res ~4 solubles. Or la sous-unit6 13synthdtis6e sous le contr61e du promoteur T7 s'accumule darts la bact6rie sous la forme de corps d'inclusion. Les auteurs supposent que la synthhse endogbne d'hhme est trop lente par rapport h celle de la prot6ine. Seule la coexpression des deux sous-unit6s assure les conditions ad6quates pour un repliement correct. Les &apes de purification de chacune des prot6ines de fusion, de repliement et de reconstitution du tdtram6re sont 6vitfes avec ces syst6mes d'expression. Une Hb recombinante modifi4e pourra 6tre directement soumise aux proc4d6s de purification. Mais l'inconv6nient majeur des h6tes bact6riens est li4 h la pr6sence d'endotoxines qui devront ~tre parfaitement 61imin6es au cours des &apes de purification. Le ta b leau I r6capitule les c aract6ristiques des systSmes d'expression efficaces dans des microorganismes.

Tableau I Expresszon de g l o b m e et hdmoglobine d a n s des mzcroorgamsmes. Prot&ne

Syst6me d' .~xpresslon Promoteur Sequence codante

H6te

Mode d expression (I ou C)*

Rendement % prot6mes totales

R6f~rences

clIFX13-Gb

)~PL

cDNA 13

E cob

temp6rature

10-15

(msolnble)

;~Pr

cONA 13

E coh

temp6rature

15-20

T7

cDNA 13

E. colt

IPTG

15-20

clIFX13~ ~saGb (insoluble)

k PL T7

cDNA ~ cDNA ~

E colt E. colt

temp6rature IPTG

10 10-15

Tame et coil, 1991 Jenssen et coil sous presse

13-Gb (insoluble)

T7

cDNA 13ou synth6tlque 13

E colt

IPTG

10

Hernan et coil 1992

lib (soluble)

tac lac tac

synth6tlque ~13 synthetNue u13 synth~tlque aafl cDNA a S cDNA 13

E coh E colt E coh

IPTG C IPTG

5-10 5-10 5-10

galactose

3-5

Hoffman et coll., 1990 Heman et coll, 1992 Looker et coll., 1992 Wagenbaeh et coll, 1991

pGGAP

cerer tstae

Nagm&Thogersen 1984, 1987 Blhoreau et coH, 1991 Jenssen et coil, sous presse

~I synth~se mduct~ble • duns Ie tableau le mode d mductaon est m&qu6 C : synthbse constltutwe

HEMOGLOBINE RECOMBINANTE

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EXPRESSION D'HEMOGLOBINE SOLUBLE D A N S S A C C H A R O M Y C E S CEREVISIAE

Une solution au problbme 6voqu6 pr6chdemment pourrait &re fournie par l'utilisation d ' u n organisme h6te telle q u ' u n e levure, qui ne contient pas d'endotoxine. Les sous-tmit6s ~ et 13 ont 6t6 coexprirn6es dans Saccharomyces cerevisiae (Wagenbach et coll., 1991). C o m m e dans E. coli, les sous-unit6s se replient et incorporent l'h6me endog6ne p o u r f o r m e r de l'Hb soluble qui s'accurnule dans le microorganisme. Ces syst6mes d'expression pr6sentent un autre avantage : organismes eucaryotes, les levures posshdent un syst6me enzymatique efficace de clivage des mdthionines N-terminales. La structure et les propri6t6s fonctionnelles de l'Hb recombinante sont identiques g celles d ' u n e Hb humaine native. Les rendements d'expression dans les levures sont faibles, au mieux p o u r l'Hb 3 h 5 % des prot6ines totales, ce qui limite leur utilisation dans le cadre d ' u n projet de d6veloppement industriel, au moins actuellernent.

LES A N I M A U X T R A N S G E N I Q U E S

Une autre voie existe, celle des animaux transg6niques. Des souris et des porcs transg6niques produisent de l'h6moglobine humaine (Behringer et coll., 1989 ; Swanson et coll., 992). Une construction contenant une copie du ghne [3 et deux copies du ghne a 1 de globine humaine, ainsi que l'616ment de contr61e, Locus Comrol Region ,> du g6ne de 13-globine humaine, a 6t6 utilis6e p o u r obtenir des porcs transg6niques. Les taux d'expression d ' H b h u m a i n e sont de l'ordre de 5-15 % de l'Hb totale, et les animaux ne pr6sentent pas d'anomalies. L'affinit6 p o u r l'oxyghne de l'Hb purifi6e est identique h celle d ' u n e Hb humaine normale. Cet abord est prometteur, et assurerait la production de quantit6s importantes d ' H b : le porc est un animal prolifique ; un adulte peut p r o c u r e r environ 10 litres de sang. Le probl6me n'est pas r6solu pour autant. S'il est admis que le porc pourrait se d6velopper n o r m a l e m e n t avec une Hb contenant 50-60 % d ' H b humaine, en serait-fl de m 6 m e si cette Hb pr6sente une diminution de l'affinit6 p o u r l'oxyghne ? Enfin, et non des moindres, des probl6mes 6thiques se poseront et ne seront sans doute pas les plus faciles h r6gler.

CONCLUSION

A la diff4rence d'autres prot6ines recombinantes utilis6es h des fins th6rapeutiques, l'Hb doit &re produite en quantit6s telles que les probl6mes de d6veloppement sont particuli6rement importants: un flacon de sang contient 200 ml de globules rouges, soit 60 g d'Hb. Avec

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u n taux d'expression d ' H b humaine de 50-60 %, u n porc adulte permettrait d'obtenir l'6quivalent de 10 /~ 20 unit6s de sang. Or les besoins annuels mondiaux sont estim6s h plusieurs millions d'unit6s... On pouvait life en septembre 1987 darts Sciences News : ,,But perhaps the biggest problem with such hemoglobin-based blood substitutes is that hemoglobin must be derived from blood itself. Biotechnologists are still a long way from being able to clone such a complicated protein ,, (Weiss, 1987). Or, deux ans aprhs, dos 1989, l'6quipe de Nagai d6crivait la premihre Hb humaine artificielle constitu6e par l'assemblage in vitro des sous-unit4s a et [~synth6tiques, et H o f f m a n n et coll., en 1990, obtenait de l'Hb recombinante a2[32 dans une bact6rie. Les biotechnologistes eux-m~mes auraient-ils pari6 sur une telle rapidit6 ? REMERCIEMENTS. -- Darts notre unit6 ont particip6 /~ ces travaux : M.T. BIHOREAU, B. BOHN, V. DODON, A. DUMOULIN, L. KIGER, J. KISTER, N. LACAZE, M. MARDEN. Nous remercions S. EDELSTEIN pour sa collaboration et ses critiques toujours constructives. Nous avons b6n6fici6 du soutien financier de l'Air Liquide Co, la Direction des Recherches, Etudes et Techniques (contrat n°89/245), l'Institnt M6rieux, et I'INSERM.

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HEMOGLOBINE RECOMBINANTE

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