Quantification génomique : applications aux infections par les sixième et septième herpèsvirus humains (HHV-6, HHV-7)

Dossier scientifique Quantification moléculaire en biologie clinique

QUANTIFICATION GENOMIQUE : APPLICATIONS AUX INFECTIONS PAR LES SIXIEME ET SEPTIÈME HERPESVIRUSHUMAINS (HHV-6, HHV-7) Agnés Gautheret-Dejean

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David Boutolleau a n C

Résumé Le développement des méthodes de quantification des génomes viraux par amplification génique en temps réel a profondément modifié notre vision des infections virales. À l'instar du virus de I'immunodéficience humaine ou du cytomégalovirus, ces méthodes ouvrent de nouveaux horizons pour la compréhension des infections à HHV-6 et HHV-7, et de leur pathogénicité. Ainsi, un seuil de 1 000 copies de génomes de HHV-6 par million de cellules mononucléées du sang périphérique a été corrélé à la survenue de différents symptômes chez des sujets greffés de cellules souches hématopoïétiques. Des études clinicobiologiques sont en cours pour définir le cadre d'utilisation de ces nouveaux outils.

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HHV-6 HHV-7 charge virale pathog6nicit6.

Summary The development of real-time PCR technologies for the quantitation of viral genomes has rnodified our vision of viral infections. This is the case for HHV-6 and HHV-7 for which these methods allow new fields of research to understand viral infection and pathogenicities. Thus, a threshold of 1000 copies of HHV-6 genome per million of peripheral blood mononuclear cells has recently been associated with several symptoms in stem cells transplant recipients. Further studies are underway to precise the use of these new tools.

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greffés de cellules souches hématopdi6tiques (CSH). Par ailleurs, des cas d'hépatite aiguë ou fulminante, en particulier chez le jeune enfant, ont été associés à une infection par le HHV-6. Dans un but diagnostique, les méthodes virologiques directes sont privil6giées avec, en premier lieu, l'utilisation de la détection des génomes viraux et, plus récemment, le développement de méthodes quantitatives. À ce jour, la mesure des charges virales HHV-6 et HHV-7 reste exceptionnelle et vient en complément de la détection génomique. Cependant, les nombreux avantages des méthodes d'amplification génique en temps réel (rapidité, facilité et sécurité vis-à-vis des contaminations) vont permettre une utilisation élargie de ce nouvel outil diagnostique.

2. Situations diniques

et pr6l&vementsB realiser Le tableau 1regroupe différentes situations cliniques, où la mesure de la charge virale des HHV-6 et HHV-7 sera utile au diagnostic et au suivi thérapeutique. Le sujet immunodépriméconstitue clairement la population cible, avec de façon majoritaire les greffés de CSH.

Les méthodesde mesure de la charge virale des HHV-6 et HHV-7 font essentiellementappel à des techniques de polymerase chain reaction

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HHV-6 HHV-7 viral load pathogenicity.

1. Introduction

rn -

écouverts respectivement en 1986 et 1990, ces deux bêtaherpésvirusfont l'objet de débats concernant leur pouvoir pathogéne. En effet, leur forte séroprévalence dans la population générale adulte, proche de 90 oh, rend délicate la démonstration d'un lien entre infection virale et pathologie. Néanmoins, le rôle causai du HHV-6 dans la survenue d'encéphalite, de retard à la sortie d'aplasie et d'insuffisance médullaire transitoire, a été mis en évidence chez des sujets

D

a Laboratoirede

virologie Groupe hospitalier Pitib-Salpêtriére 83, bd de I'H6pital 75651 Paris cedex 13 Laboratoire de microbiologie Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiques 4, av. de I'obse~atoire 75006 Paris Laboratoire de microbiologie - Unit6 de virologie Centre hospitalier universitaire de Bic&tre 78, rue du Général-Leclerc 94875 Le Kremlin-Bic&trecedex Correspondance [email protected]

article reçu le 7 février, accepte le 3 mars 2003. O Elsevier, Paris. Revue Françaisedes Laboratoires, mars 2003, Ne351

~tiuation dinique - --

Encéphalite

Prélèvemen à réaliser

Population

dble

1 Greffé de CSH

iquide céphalorachidien

Sujet HIV-séropositif

1 Sang périphérique,

Troubles Greffé de CSH, I'hématopoT8se Greffé hépatique Sujet HIV-séropositif

moelle osseuse an

( de

41

!I Hépatite aiguë

1

Jeune enfant et adulte immunocomp4tents Greffe rbnal, hépatique

biopsie hépatiquea

Sang périphérique, peau sainellésée a

s hhatopdiétiques. la fraction mononucl&,

mesure sur la fraction acellulaire et

Aprés centrifugation,mesure sur le surnageant acellulaire et sur le culot cdlulaire.

1 1

Dossier scientifique -.

Quantification moléculaire en biologie clinique

Tableau II/ Systèmes de polymerase chain reaetion (PCR)

-1 Tedinologlede PCR

Vims

Compétitive

I

HHV-7 HHV-6, HHV-7 MHV-6, HHV-7

Temps réel

-

1

*

Tableau 111/Charge virale HHV-6 et HHV-7 chez des sujets sains et des patients déterminée p a r polymerase chain reaction (PCR) en temps réel.

hd*

Auteurs -- -

- -

Clak D.A. 121 Kidd I.M. 161 Secchiero P. [12] Fujiwara N. [4]

Sang périphérique PBMC

Locatelli G. 171 Gautheret-Dejean k [5] Nagate A. [lO] Femandez C. [31 Razonable R.R. [Il] Nitsche A. [9] RazonaMe R.R [Il] Zen D.M.IIIal

- Leucocytes

-

Greffés de CSH

H W HHV-6 HHV-7 HHV-6

- Plasma

Sains Greffesde CSH

HHV-6 OR HHV-6 0 1,25 x 10'

(PCR) soit compétitive entre la cible * sauvage met un témoin interne compétiteur, soit en temps réel, avec une préférence pour ces demiéres pour leur facilité et leur sécurité d'emploi (tableau Il).

Sd~e

Sains

HHV-7 463 29683 FI31 HHV-6 0 630957 il31

LCR

G&s

4. Résultats obtenus et interprétation

LBA

Sains

I

Les données de quantification des HHV-6et HHV-7 dans le cadre d'études clinicobiologiques sont encore restreintes. Néanmoins, le tableau 111 regroupe les principaux résultats obtenus à l'aide de méthodes de PCR en temps réel. Chez le sujet sain, les HHV-6 et HHV-7 se comportent différemment. En effet, si le HHV-6 est rarement détecté dans les différentes fractions leucocytaireset ce, avec une charge trbs faible, le HHV-7 est présent chez plus de 80 010 des sujets, avec des charges variables pouvant &treélevées par rapport au cytomégalovirus humain (HCMV) ou au virus Epstein-Barr (EBV). Dans la salive, les deux virus sont trés prévalents, avec des charges parfois élevées. Chez les sujets greffés de CSH, on constate une réactivation du HHV-6, avec des charges virales pouvant atteindre 1 O7 copies par million de cellules. Une étude récente réalisée dans notre laboratoire indique un lien statistique entre une charge HHV-6 supérieure A 1 000 copies/l Oe PBMC beripheral blood mononuclear cells) et la survenue de manifestations clinicobiologiques liées à ce virus (troubles de I'h6matopoï8se, fibre, rash cutané, pneumopathie). A l'opposé, la charge virale du HHV-7dans les PBMC chez des greffés de CSH est proche de celle déterminée chez les sujets sains. Le HHV-6, qui présente un tropisme pour le systéme nerveux central, est B l'origine d'encéphalites chez des patients infectés par le virus de I'immunodéfi-

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Sains

O [9l 0[11] 66,8 11 11 0 1,58 x 1O7 191

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-

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de CSH

[QI

-

-

HHV-6 3650 4,16x 1 O6 f51 HHV-6 O- 678 BI

LCR : liquide c6phalorachidien, LBA : liquide de lavage broncho-alvéolaire. La charge virale est exprim6e en nombre de copies de gBnome par million de cellules (PBMC, leucocytes ou LBA) ou par ml de liquide biologique (plasma, salive ou LCR). Charge virale < 10 copies Bquivalentg6nome pour 10 pl d'ADN test6 (environ 1 pg).

a

cience humaine (VIH) ou greffés de CSH. Nous avons pu montrer chez ces derniers que le suivi de la charge virale dans le liquide céphalorachidien (LCR) permettait de suivre I'efficacitédu traitement antiviral.

5. Condusion

E

n conclusion, la mesure de la charge virale HHV-6 et HHV-7 chez des patients est utile pour établir un lien causal avec une pathologie et suivre de façon longitudinale I'efficacité d'un traitement antiviral. Afin de pouvoir comparer les résultats obtenus par différentes équipes et trouver des consensus de prise en charge thérapeutique, l'harmonisation de l'expression des résultats et le développement de standards internationaux, à l'instar du VIH ou du virus de l'hépatite C (VHC), est nécessaire et devrait constituer une prochaine étape.

adults by cornpetitive quantitative PCR, J. Med. Viml. 61 (2) (2000) 206-213. 151Gautheret-DejeanA, Man'chanh C., Thiin-Ah-KoonF., Fillet AM., Mangeney N., Vidaud M., Dhedin N., VernantJ.P., Agut H., Development of a reai-timepolymerssechain reaction assay for the diagnosis of human herpesvims-6 infection and applicationto bone mmwtransplantpatients,J. Wml. Methods 100 (1-2) (2002) 27-35. 161 Kidd LM., W DA, Aakhaled M., G M s PD., Emery MC., Measurementof t!utnan h q ç s v i 7~load ~ in p i p h a i blood and saliva of healthy subjects by quantitative pdymetasediain reoiction,J. Infect D i 174 (2) (1996) 396-401. 171 LocatelliG., Santom F., Veglii E, Gobbi A, Lusso P,. Malnaii M.S., Real-time quantitative PCR for human herpesvims6 DNA, J. Clin. Micmbid. 38 (1 1) (2000) 40424048. [81 NagateA, OhyashikiJ.H., Kasuga I.,MinemuraK, Abe K, Yamamoto K, Ohyashiki K., Detection and quantiiication of human herpeavims 6 genomes using bronchoalvedar lavage fluid in immunocompmmised patientswith interstitialpneumonia, Int. J. Mol. Med. 8 (4) (2001) 379383.

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