Specifité de position de la phospholipase posthéparine du rat

436

SHORT

COMMUNICATIONS

if the lipid is only present in very low concentrations. The yellow colour given by phosphatidylinositol appears after about 40 min. The conditions used for these reagents do not cause hydrolysis of fatty acid ester groups since phosphatidic acid and similar lipids which contain a-glycol residues protected by fatty acid esters do not react. However the deacylation products of glycerides and their phosphate esters which may be characterised by paper chromatography6 can also be detected with these reagents, giving the rapid purple colour typical of a r-substituted glycerol. Microbiological Chemistry Research Laboratory, Department of Organic Chemistry, University of Newcastle upon Tyne, Nezacastle upon Tyne, ~VEI

N.

SHAW

7RU (Great Britain)

I J. G. BUCHANAN, C. A. DEKKER AND A. C. LONG, J. Chem. Sac., (1950) 3162. 1 J. BADDILEY, J. G. BUCHANAN, R. E. HANDSCHUMACHER AND J. F. PRESCOTT, J. Chcm. (1956) 281% 3 F. E. HARDY AND J. G. BUCHANAN, J. Chem. Sm., (1963) 5881. 4 N. SHAW AND J. BADDILEY, Nature, 217 (1968) 142. 5 H. WAGNER, L. HORHAMMER AND P. WOLFF, Riochenz. Z., 334 (1961) 175. 0 R. RI. C. DAWSON, Biochem. J., 75 (1960) 45. Received Biochim.

BBA

July

Sm.,

Bth, 1968

Biophys.

Acta,

164 (1968)

435-436

53188

Specifitk

de position

Le plasma

de la phospholipase

de rat contient

plusieurs

posthbparine

phospholipases

du rat

hydrolysant

les phospho-

lipides des lipoproteines ou des emulsions phospholipidiques112. Ces phospholipases agissent sur la position C-2 des glydrophospholipides. L’une de ces phospholipases agit comme une acyltransferase et d&ache Cgalement l’acide d’heparine chez l’homme gras en C-2 qu’elle transfere sur le cholesterol 3. L’injection ou chez le rat provoque l’apparition dans le plasma d’une autre phospholipase. Dans le cas de la phospholipase humaine, VOGEL~ en a determine la spdcificite de position pour l’acide gras fix& au C-I. Ayant montre par ailleurP’ les differences de proprietes des phospholipases postheparine de rat et d’homme, nous avons CtudiC la specificit& de position de la phospholipase du plasma postheparine de rat. Nous avons utilise une lecithine de synthese tritiee (I-Claidyl-n-[9,10-3H,]stCaryl,L-cc-glyc&ylphosphorylcholine)* chromatographiquement pure, Cmulsionnee dans une solution d’albumine a 20 % contenant du (NH&SO, 0.2 M ajustee a pH 7.4 avec NaOH. Chaque fois, un tube contenant I ml d’emulsion de lecithine (700 mpmoles) + I ml de plasma normal ou de plasma postheparine de rat est incube a 37’ dans un incubateur de Dubnoff avec agitation pendant des temps variables. Des temoins sont prepares simultanement dans les mCmes conditions mais en absence de plasma. Apres l’incubation, l’activite enzymatique est arr&tCe et les lipides sont extraits par * Nous remercions t&s vivement Mme J. RAULIN de nous avoir fait don de cette lkithine. d&ails sur la priparation sont dkcrits dans la r6f. 8. Biochim.

Biophys.

Acta,

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Les

437

SHORT COMMUNICATIORS

addition

de methanol-chloroforme.

Les phospholipides

sont s&pares par chromato-

graphie sur couche mince de silicagel G (Merck) et revel& aux vapeurs

diode.

Comme

substances de reference, on a utilise une lecithine de foie de rat purifiee par chromatographie sur colonne d’acide silicique et une lysolecithine obtenue par action de la phospholipase de venin de serpent sur la lecithine de foie. Les deux phospholipides presentaient une seule tache en chromatographie sur couche mince. Les RF de la ldcithine et de la lysolecithine radioactives etaient identiques a ceux des standards de reference en trois phases solvantes : chloroforme-methanol-ammoniaque 7 M (60 : 35 :

5, v/v/v), chloroforme-methanol-eau (65 : 25 : 4, v/v/v) et chloroforme-methanolacide acetique-eau (65 : 25 : 8 : 4, v/v/v/v). Les plages de gel correspondant a la lecithine et a la lysolecithine sont recuperees quantitativement. Afin d’ameliorer l’efficacite de comptage des lipides marques au 3H et adsorb& sur le gel (environ 16 %), les acides gras sont r&up&& aprks saponification par NaOH, acidification et extraction par 1’CtherCthylique. L’extrait set est ensuite mis en solution dans le scintillateur (tolu$ne, POP, POPOP) et compte en spectromltre Mark II (Nuclear Chicago). La recuperation de radioactivite est de 100% et l’efficacite de compta.ge est de 47 %. Au tours de l’incubation

des [3H]1Ccithines en presence de plasma postheparine,

on observe (Fig. I)

Phospholipase , ‘5r_ L____P~~‘n:!?Y

Temps(h)

Fig. I. Formation de lysolecithine radioactive & partir de lecithine tritiee en presence de plasma postheparine dans les conditions d&rites dans le texte. La formule de la Ecithine utilisee et le point d’action de la phospholipase sont representees schematiquement. 0-- - - - -0, [3H]1Ccithine avec plasma normal; O-O, [3H]1Ccithine avec plasma postheparine.

l’apparition d’une lysolecithine radioactive et on ne d&Ye pas de radioactivite dans les acides gras libres ni dans les differents lipides neutres s&pares sur couche mince d’acide silicique avec, comme phase mobile, ether de p&role (4o-45”)~ether Cthyliqueacide acetique

(go:30 : I, v/v/v).

Ce resultat

prouve que la phospholipase

hydrolyse

specifiquement la liaison ester en C-I. En presence de plasma normal de rat, il n’y a pas de formation de compose lyso radioactif ni liberation d’acides gras radioactifs dans ces conditions (Tableau I). Ces resultats ont Cte verifies trois fois avec des pools de plasma differents. Dans des experiences de plus longue duree (24 h), on voit apparaitre une radioactivite dans les acides gras libres et les esters de cholesterol aussi bien dans le plasma normal que dans le plasma postheparine, conformement a ce que l’on sait sur les Biochim. Biophys.

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438 TABLEAU

SHORT

COMMUNICATIONS

I

RADIOACTIVIT~~ DANS LES FRACTIONS LIPIDIQUCS A~RBS INCUBATION DE [3H]~~~~~~~~N~DANS LES CONDITIONS DtiCRITES DANS LE TESTE

Tmpts d’incubntiorl (k)

Plasma ~iovnlal

0 3 ti

6oooz0~ 6 000 ooo 5980000

LPcithize (de’siizt.lmilt)

Plasma posthe’pavine LJfsolPcithine (de’si,zt./mi:~)

Lkcithitze (dPsiiit./mi~z)

Lysole’czthiue (dc’si)it./miJz)

6 ooo ooo 5 400000 5 300000

520000 640 000

actions phospholipasique et acyltransferasique du plasmaz. Le taux d’hydrolyse de la I-elai’dyl-z-stearyl-lecithine est beaucoup plus bas que celui qu’on atteint dans les memes conditions avec des kithines de foie de rat. On sait par ailleurs que la phospholipase de venin de Crotalus hydrolyse les kithines de synthese a une vitesse qui depend a la fois de la saturation de l’acide gras en C-2 et en C-I (refs. 9, IO). 11 est possible que le comportement de la phospholipase postheparine vis-a-vis des deux types de lecithines soit du a leur difference de composition en acides gras. En conclusion, la phospholipase postheparine du rat comme celle de l’homme est du Type A,. Elle est done diffCrentc existant dans le plasma normal de rat.

de l’acyltransfitrase

Labovatoire de Chimie Biologique dzr C.H. U. Saint-Adoiue et Unite’ de Recherches de Physiofiathologie HQatobiliaire dc I’I.N.S.E.R.M., I 2 3 4 5 6 7 8

Paris (France)

M. PAYSANT ET J. POLONOVSKI, Cornpt. Rend.. 263 (1966) 1419.

et des phospholipases

K. INFANTE K. KOUMANOV J. POLONOVSKI

J. ETIENNE, A. GRURER ET J. POLONOVSKI, Bull. Sot. Chim. Biol.. 49 (1967) 1751. J. A. GLOMSET, Biochim. Biophvs. Acta, 65 (1962) 128. W. C. \'OGEL ET E. L. BIERMAN, J. Lipid Res., 8 (1967) 46. R. INFANTE,J.POLONOVSI(I,O.DONON ET K.KOUMANOV, Compt.Re~zd.,264(1967)2412. R. INFANTE, J. POLONOVSKI ET 0. DONON, Biochim.Biophys. Acta, 144 (1967) 490. K. KOUMANOV,R.INFANTE,J.POLONOVSKI ET O.DONON, Bull. Soc.Chim.Biol.,50 (1968). P. DAUVILLIER,G.H.DE HAAS,L.L.M.VAN DEENEN ET J. RAULIN, Co~zpt.Relzd.,z59(1964) 4865. 9 J. H. MOORE ET D. L. WILLIAMS, Biochim. Biophvs. Acta, 70 (1963) 348. IO J. H. MOORE ET D. L. WILLIAMS, Biochim.Bioph_vs. Acta, 84 (1964) 41.

Recu le 5 juillet,

1968

Biochinz. Biophys. .4cta, 164 (1968) 436-438