Intégrité de l'ADN des spermatozoïdes comme élément diagnostique et pronostique de la fertilité masculine

Gynécologie Obstétrique & Fertilité 33 (2005) 89–101 http://france.elsevier.com/direct/GYOBFE/

Faits et arguments

Intégrité de l’ADN des spermatozoïdes comme élément diagnostique et pronostique de la fertilité masculine Sperm DNA integrity as diagnosis and prognosis element of male fertility M. Sergerie a,1, G. Bleau b, R. Teulé a, M. Daudin a, L. Bujan a,* a

CECOS Midi-Pyrénées, centre de stérilité masculine et équipe d’accueil « Fertilité Humaine » (EA 3694), hôpital Paule-de-Viguier, 330, avenue de Grande-Bretagne, TSA 70034, 31059 Toulouse cedex 09, France b Laboratoire de biologie de la reproduction, centre de recherche hôpital Saint-Luc, centre hospitalier de l’université de Montréal, CHUM, 264, boulevard René-Lévesque Est, Montréal, Québec, Canada, H2X 1P1 Reçu le 28 juin 2004 ; accepté le 8 novembre 2004 Disponible sur internet le 14 mars 2005

Résumé Les progrès récents en biologie de la reproduction ont amélioré la compréhension de la physiologie des spermatozoïdes et des mécanismes impliqués dans la fécondation. Ces nouvelles connaissances ont mené à des tests plus élaborés de la fertilité masculine fondés sur l’intégrité génomique des spermatozoïdes. Cette revue de la littérature présente certaines de ces techniques et apporte un élément de réflexion sur l’application et l’utilisation des tests de l’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes dans l’investigation de la fertilité masculine. L’analyse unicellulaire sur gel d’électrophorèse (COMET), l’analyse de la structure de la chromatine des spermatozoïdes (SCSA), le test in situ de cassures dans l’ADN (NT : Nick Translation) et le marquage des brins d’ADN avec la terminale désoxynucléotidyle transférase (TUNEL) sont actuellement les techniques les plus utilisées pour mesurer l’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes en clinique. Dans une certaine optique, les techniques TUNEL, SCSA, COMET et NT sont complémentaires. Le TUNEL et le COMET peuvent mesurer les cassures simpleet double-brin de l’ADN, le SCSA peut détecter les anomalies de compaction de la chromatine et la technique NT peut détecter les cassures simple-brin d’ADN. L’origine exacte de la fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes n’est pas encore établie. Cependant, plusieurs mécanismes ont été proposés : défaut dans le remodelage et la compaction de la chromatine notamment lors de la spermiogenèse ; production de substances oxygénées réactives par les spermatozoïdes immatures ; apoptose lors de la spermatogenèse. Il devient important de considérer les conséquences possibles de la fécondation d’un ovocyte par un spermatozoïde ayant un haut degré de fragmentation de son ADN. L’utilisation en routine de certains de ces tests doit cependant passer par une standardisation des protocoles inter-laboratoires et évidemment, par l’établissement de seuil discriminant in vivo et in vitro pour que ces tests présentent une bonne valeur prédictive dans la survenue d’une grossesse. © 2005 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Abstract Recent progress in reproductive biology has improved comprehension physiology of the spermatozoa and on the fertilization mechanisms. This new knowledge has carried out the elaboration of tests on male fertility based on sperm genomic integrity. This review presents some of these techniques and brings a reflexion element on the application and use of sperm DNA integrity in the investigation of male fertility. The single cell gel electrophoresis (COMET assay), Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA), In Situ Nick Translation (NT: Nick Translation) and Terminal Uridine Nick-End Labelling (TUNEL assay) are actually the most currently used techniques for the measure of sperm DNA integrity in research clinic. From a certain point of view, TUNEL assay, SCSA, COMET assay and NT assay are complementary. The TUNEL and COMET can measure single and double strand breaks of DNA, the SCSA can detect the abnormalities in the chromatin compaction and the NT assay can detect the single strand breaks of DNA. The exact origin of sperm DNA fragmentation is not established yet. However,

* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (L. Bujan). 1 M. Sergerie est boursier post-doctoral de l’organisme Sidaction de France (N° A015-2) et est accueilli grâce au programme de la Fondation Nationale Alfred Kastler de l’Académie des Sciences de France (N° 84000). 1297-9589/$ - see front matter © 2005 Elsevier SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.gyobfe.2005.02.012

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several mechanisms have been proposed: defect in the chromatin compaction during spermiogenesis; reactive oxygen species production by immature spermatozoa; apoptosis during spermatogenesis. It becomes important to consider the possible consequences of the oocyte fertilization by a spermatozoon having a high degree of DNA fragmentation. The use in routine of some of these tests must however pass by a standardization of the inter laboratory protocols and obviously, by the establishment of both in vivo and in vitro discriminating threshold values in order for these tests to present a good predictive value for pregnancy outcome. © 2005 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Fragmentation de l’ADN ; Chromatine ; Spermatozoïde ; TUNEL ; COMET ; SCSA ; NT ; Infertilité masculine ; ICSI ; FIV Keywords: DNA fragmentation; Chromatin; Spermatozoa; TUNEL assay; COMET assay; SCSA; NT; Male infertility; ICSI; IVF

1. Intégrité de la chromatine/ADN des spermatozoïdes 1.1. Introduction La finalité du spermatozoïde est d’apporter une copie haploïde du génome mâle à proximité de la copie haploïde du génome femelle dans l’ovocyte en vue de leur fusion lors du phénomène de la fécondation. Pour que cette fonction se réalise, l’homme doit produire des spermatozoïdes en quantité et qualité adéquates. Les progrès récents en biologie de la reproduction ont amélioré la compréhension de la physiologie des spermatozoïdes et des mécanismes impliqués dans la fécondation. Ces nouvelles connaissances ont mené à des tests plus élaborés de la fertilité masculine fondés sur l’intégrité génomique des spermatozoïdes, ces tests permettant une meilleure évaluation de leur capacité à initier, et à mener à terme, une grossesse.

1.2. Spermatogenèse La spermatogenèse comprend l’ensemble des divisions et différenciations qui à partir de spermatogonies vont donner le gamète mâle (spermatozoïdes) [1]. C’est lors des toutes premières étapes de la spermiogenèse que la stabilité de l’ADN des spermatozoïdes est assurée par des mécanismes biochimiques (Dadoune [2] pour revue). Ce dernier stade de la spermatogenèse est caractérisé par un remodelage important de la chromatine nucléaire impliquant des changements morphologiques et de nombreuses modifications dans la nature des protéines nucléaires [3,4]. La perte de la structure nucléosomale lors des premières étapes de la spermiogenèse est associée au remplacement des histones par les protéines de transition (Fig. 1). On connaît davantage aujourd’hui le rôle spécifique des protéines de transition [5–7]. Selon plusieurs auteurs, ces protéines faciliteraient le remplacement des histones par les protamines et/ou

Fig. 1. Illustration du modèle hypothétique des formes topologiques de l’ADN (inspirée des travaux de Boissonneault, 2002) présentant les différentes étapes du remodelage de la chromatine lors de la spermiogenèse. Chez la spermatide en différenciation, les nucléosomes sont éliminés de l’ADN permettant de dérouler les super tours de la chromatine. Ce processus implique des cassures simple et/ou double-brin de l’ADN. Finalement, la liaison des protéines de transition puis des protamines favorise la réparation des cassures dans l’ADN en rendant plus stable la chromatine.

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seraient impliquées dans l’arrêt de l’activité transcriptionnelle des spermatides [8,9]. Récemment, Boissonneault et al. (2002) ont émis l’hypothèse que la protéine spermatide TP1 aurait la capacité de participer à la réparation de l’ADN consécutive à une insulte génotoxique et pourrait également jouer un rôle actif dans le maintien de l’intégrité du génome mâle lors de la spermiogenèse [5–7]. Chez l’homme, il persiste environ 10 à 20 % d’histones dans le noyau des spermatozoïdes matures, alors que plus de 70 % des protéines nucléaires basiques sont constituées de protamines [3,4,10]. Les différentes protamines humaines sont riches en arginine et cystéine (environ 10 à 15 %), mais diffèrent dans leurs compositions respectives en quantité d’histidine et tyrosine [3,4,10]. L’un des rôles physiologiques des résidus de cystéine serait de concentrer l’ADN, en condensant la chromatine de façon compacte grâce à la formation de ponts disulfures (-S—S-) entre les résidus de cystéine durant le transit des spermatozoïdes dans l’épididyme [3,4]. D’un point de vue finaliste, cette différenciation permet à la cellule, débarrassée d’une grande partie de son cytoplasme, d’acquérir une mobilité et de transporter un matériel génétique « protégé » afin d’assurer la fécondation du gamète femelle. Comme l’organisation structurale de la chromatine du spermatozoïde est déterminante pour sa fonction [11], de nouvelles techniques utilisant des fluorochromes capables d’interactions spécifiques et complexes avec la chromatine/ADN ont été développées pour identifier les défauts subtils dans l’intégrité du matériel génétique. Ces nouvelles méthodes visent à identifier les patients présentant des anomalies des spermatozoïdes et à définir un seuil au-dessus duquel existe un risque d’infertilité masculine in vivo et/ou in vitro en Assistance médicale à la procréation (AMP). Cette revue de la littérature présente certaines de ces techniques et apporte un élément de réflexion sur l’application et l’utilisation de celles-ci dans l’investigation de l’infertilité masculine ainsi qu’en AMP. 1.3. Analyse unicellulaire sur gel d’électrophorèse (Single Cell Gel Electrophoresis Assay – COMET) Initialement, la technique COMET a été développée pour détecter des dommages à l’ADN des cellules somatiques (étude de génotoxicité). Elle a été affinée pour mesurer les dommages à l’ADN d’un spermatozoïde, en observant la migration des fragments d’ADN sur microgel d’agarose lors de l’électrophorèse [12]. Les spermatozoïdes inclus dans une mince couche de gel d’agarose sur lame de microscope sont lysés, exposés à un courant électrique, puis colorés avec un fluorochrome spécifique à l’ADN. Les cassures dans l’ADN libèrent les super-tours de la chromatine et permettent la migration de l’ADN vers l’anode [12] ; la coloration révèle une distribution dans le gel rappelant l’aspect d’une comète (d’où l’appellation COMET assay) (Fig. 2). Un spermatozoïde avec un niveau élevé de fragmentation de l’ADN aura une forte intensité de fluorescence dans la queue de la comète avec un allongement de cette partie [13–17].

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Fig. 2. Illustrations des résultats obtenus lors de l’analyse de spermatozoïdes sur gel d’électrophorèse (COMET) pour apprécier le degré de fragmentation de l’ADN. Les images correspondent à des spermatozoïdes (A) témoin, exposés à une irradiation de (B) 5 Grays et (C) 15 Grays et marqués au SYRB vert lors de la technique COMET en milieu alcalin (pH = 13) (Daudin et Bujan, travaux non publiés).

Une étude utilisant la technique COMET en milieu alcalin (pH = 13) a démontré que 20 % de la fluorescence associée à l’ADN provenait de la queue de la comète de spermatozoïdes non traités, ce qui est sensiblement plus élevé que le niveau de base de 5 % de cassures rapporté dans les cellules somatiques [16]. La présence des fragments simple-brin d’ADN en milieu alcalin serait possiblement associée à une diminution de la spécificité de la technique COMET à mesurer les fragments d’ADN double-brin associés à des dommages à l’ADN et à l’infertilité. Utilisant la technique COMET à pH = 12,3, Irvine et al. [17] ont observé que les hommes infertiles présentaient un niveau plus élevé de dommages à l’ADN que les témoins fertiles. Ils ont aussi démontré que la technique COMET, avec une décondensation préalable de la chromatine, rendait la méthode plus sensible pour détecter des dommages à l’ADN que la technique d’analyse in situ des cassures dans l’ADN (in situ Nick Translation Assay – NT). De plus, Hughes et al.

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ont constaté que lors d’une induction de dommages à l’ADN, consécutifs à l’exposition aux rayons X ou au H2O2, la susceptibilité aux dommages décroissait selon le diagnostic dans l’ordre suivant : sujets asthénozoospermiques > sujets infertiles normozoospermiques > sujets fertiles normozoospermiques [16]. La technique COMET en milieu moins alcalin semble plus sensible pour détecter les cassures double-brin d’ADN et pour identifier les dommages à l’ADN associés à l’infertilité [17]. Les conditions à pH = 9 ne dénaturent pas l’ADN, et mesurent donc seulement les cassures doubles de l’ADN, et non les cassures simple-brin associées aux sites labiles de l’ADN en milieu alcalin [15]. Singh et Stephen [14] émettent l’hypothèse que la digestion par la RNase A à pH = 9 permettrait à l’ADN de se dissocier de ses macromolécules (protéines nucléaires) et ainsi de migrer plus librement dans le gel d’agarose. Dans ces conditions, la longueur de la traînée de coloration augmenterait en fonction du degré de fragmentation de l’ADN plutôt que l’intensité de fluorescence du noyau [14]. La présence d’ARN peut avoir comme conséquence de freiner la migration d’ADN, un biais qui risque de masquer le lien de cause à effet entre la présence d’ADN endommagé et la longueur de la queue de la comète [16]. Même si cette technique semble très sensible pour détecter les cassures dans l’ADN, cliniquement, aucun seuil n’a été établi lors de l’analyse du sperme. L’absence de standardisation méthodologique fait qu’elle ne peut encore être réalisée en routine. 1.4. Analyse de la structure de la chromatine des spermatozoïdes (Sperm Chromatin Structure Assay – SCSA) Le SCSA, technique développée par Evenson et al. [18], tente d’établir une relation entre la structure de la chromatine et sa fonction. Cette approche définit une chromatine anormale comme celle qui a une plus grande susceptibilité à se dénaturer in situ en milieu acide. Ainsi, la résistance de la chromatine des spermatozoïdes à se dénaturer en milieu acide est mesurée en exposant les spermatozoïdes à un pH de 1,2, suivi d’une coloration à l’acridine orange avant l’analyse en

cytométrie de flux. La coloration différentielle des spermatozoïdes avec l’ADN natif versus l’ADN dénaturé est due aux propriétés métachromatiques de l’acridine orange : lorsqu’elle s’intercale dans l’ADN natif et bicaténaire (double-brin), l’émission de la fluorescence se produit à 530 nm (vert) ; lorsqu’elle se lie à de l’ADN monocaténaire (simple-brin), l’émission de la fluorescence se dévoile à 600 nm (rouge). Le degré de dénaturation de l’ADN in situ (ou paramètre at) peut être déterminé en mesurant le rapport de la fluorescence rouge au total de la fluorescence nucléaire (rouge + vert) ; ce ratio peut varier de 0,1 (non dénaturé) à 0,9 (très dénaturé) (Fig. 3) [18]. Les mesures d’un échantillon de sperme normal génèrent une faible distribution at ; au contraire, un échantillon de sperme avec des spermatozoïdes qui ont une chromatine anormale (plus grande susceptibilité à se dénaturer in situ) donne une plus large distribution de at. Récemment, Evenson et al. [19] ont modifié l’appellation du paramètre at pour celui de l’index de fragmentation de l’ADN (DFI). La technique SCSA, faiblement corrélée avec les paramètres conventionnels du sperme, semble apporter un critère diagnostique additionnel dans l’évaluation de la fertilité mâle [20–28]. Pour Evenson et al. [26,29–31] une valeur supérieure à 27–30 % des spermatozoïdes montrant une chromatine anormale représente un seuil peu compatible avec une grossesse (Tableau 1) ; chez les hommes fertiles, entre 0 et 15 % de spermatozoïdes seraient endommagés [26]. Saleh et al. [32] ont démontré chez des sujets fertiles et donneurs de sperme que le niveau le plus élevé de fragmentation de l’ADN était de 24 % et ont utilisé cette valeur seuil pour classer les sujets infertiles en deux groupes de dommages : élevé (> 24 %), et faible (≤ 24 %). Dans cette étude, les dommages à l’ADN des spermatozoïdes supérieurs à 24 % ont été observés chez 43 % des sujets infertiles avec des paramètres spermatiques normaux comparativement à 62 % chez des hommes infertiles avec des paramètres du spermogramme anormaux ; cependant, cette différence n’était pas significative. Spano et al. [33] ont, de la même façon, rapporté une diminution de la fécondité lorsque plus de 20 % des spermatozoïdes sont positifs par la technique SCSA ; lorsque les valeurs

Fig. 3. Représentation graphique de la détection de l’ADN monocaténaire et bicaténaire par la technique SCSA en cytométrie de flux (A). La coloration différentielle de l’ADN monocaténaire des spermatozoïdes (B) vs l’ADN bicaténaire (C) est due aux propriétés métachromatiques de l’acridine orange. Le degré de dénaturation de l’ADN in situ (ou paramètre at ) peut être déterminé en mesurant le rapport de la fluorescence monocaténaire au total de la fluorescence nucléaire (monocaténaire + bicaténaire) ; ce ratio peut varier de 0,1 (non dénaturé) à 0,9 (très dénaturé). Le degré de dénaturation de la chromatine des spermatozoïdes pour cet échantillon (sujet fertile) est 0,15 (Teulé et al., travaux non publiés).

Tableau 1 Seuils de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes proposés selon les populations et techniques étudiées Populations

AMP

Fertiles/Infertiles Fertiles/Infertiles Infertiles Infertiles Infertiles Infertiles Volontaires FCSa Fertiles/Infertiles Volontaires Volontaires Fertiles/Infertiles Fertiles/Infertiles Fertiles/Infertiles Fertiles/Infertiles Fertiles/Infertiles Fertiles/Infertiles Fertiles/Infertiles Fertiles/Infertiles Fertiles/Volontaires Infertiles Infertiles Infertiles Infertiles Infertiles Infertiles Infertiles Infertiles Infertiles Infertiles Infertiles Infertiles Infertiles

FIV FIV/ICSI FIV/ICSI IIU ICSI FIV FIV FIV/ICSI FIV/ICSI FIV/ICSI FIV/ICSI FIV FIV/ICSI

Effectifs

Techniques

Résultats

Réf.

73 52 34 43 60 140 97 21 40 215 277 517 108 76 31 101 114 35 47 449

TUNELb TUNELc TUNELb TUNELb TUNELb TUNELb TUNELb TUNELc TUNEL/SCSAc SCSAb SCSAb SCSAb SCSAb SCSAb SCSAb SCSAb SCSAb SCSAb SCSAb SCSAb

~ 13,0 % pour les fertiles et ~ 40,6 % pour les infertiles ~ 2,5 % pour les fertiles et ~ 11 % pour les infertiles ~ 20 % pour les infertiles ~ 15 % pour les infertiles ~ 15 % pour les infertiles ~ 11 % pour les infertiles ~ 15 % pour la population étudiée ~ 38,4 % pour les FCS* ~ 10,2 %/~ 25,4 % (TUNEL) et ~ 13,3 %/~ 27,6 % (SCSA) ~ 40 % pour être compatible avec une grossesse ~ 15 % pour la population étudiée ~ 30 % pour être compatible avec une grossesse ~ 15 % pour les fertiles et ~ 28 % pour les infertiles ~ 8,9 % pour les fertiles et ~ 21,0 % pour les infertiles ~ 8,9 % pour les fertiles et ~ 20,3 % pour les infertiles ~ 10,8 % pour les fertiles et ~ 21,4 % pour les infertiles ~ 10,8 % pour les fertiles et ~ 22,0 % pour les infertiles ~ 19 % pour les fertiles et ~ 24 % pour les infertiles ~ 15 % pour les fertiles et ~ 25 % pour les infertiles ~ 10 % pour les fertiles et ~ 14 % pour les volontaires

[62] [48] [50] [49] [47] [68] [100] [90] [57] [33] [25] [26] [32] [23] [28] [20] [21] [22] [27] [24]

167 104 262 154 131 298 24 89 24 249 34 140 66

TUNELc TUNELc TUNELc TUNELc TUNELc TUNELb TUNELc SCSAb SCSAb SCSAb SCSAb NTc NTc

< 36,5 % pour être compatible avec une grossesse ≤ 20 % pour être compatible avec une grossesse < 36,5 % FIV et ≤ 24,3 % ICSI pour une grossesse < 12 % pour être compatible avec une grossesse < 25 % pour obtenir une fécondation < 4 % pour obtenir une fécondation
[53] [60] [52] [51] [59] [46] [54] [30] [29] [31] [34] [42] [38]

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Études In vivo Sergerie et al. Gandini et al. Oosterhuis et al. Muratori et al. Shen et al. Muratori et al. Sergerie et al. Carrell et al. Zini et al. Spano et al. Spano et al. Evenson et al. Saleh et al. Zini et al. Zini et al. Zini et al. Fischer et al. Moustafa et al. Saleh et al. Giwercman et al. In vitro Henkel et al. Benchaib et al. Henkel et al. Duran et al. Lopes et al. Sun et al. Younglai et al. Larson-Cook et al. Larson et al. Virro et al. Gandini et al. Tomlinson et al. Sakkas et al. a

Fausse-couches spontanées à répétition. Analyse en cytométrie. c Analyse en microscopie à fluorescence.

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dépassent 40 %, le taux de fécondité est extrêmement faible. La variation des seuils de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes in vivo proposés par les différentes équipes serait possiblement associée à des différences de populations étudiées et à des variances dans l’application de la technique SCSA. Le groupe d’Evenson a également appliqué la technique SCSA chez des couples utilisant l’AMP : aucun patient en fécondation in vitro (FIV) ou intra-cytoplasmic sperm injection (ICSI) n’a provoqué une grossesse lorsque plus de 27 % (≥ 30 % pour Virro et al. [31]) des spermatozoïdes montraient une susceptibilité à se dénaturer [29,30]. Cependant, de nouveaux résultats ont bouleversé ces données. Gandini et al. [34] ont étudié de façon prospective plusieurs paramètres en FIV et ICSI chez des hommes dont le degré de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes (mesuré par SCSA) était relativement élevé. Ils ont observé, entre autres, cinq grossesses à terme qui ont été initiées par des hommes dont le pourcentage de fragmentation était supérieur à 27 % (variant de 13,5 à 66,3 %). Par ailleurs, une lecture attentive de l’article d’Evenson et al. [26] montre que 10 % des patients, présentant un DFI > 30 % chez les couples (n = 40), obtenaient une grossesse entre quatre et 12 mois. En outre, si l’on compare les études de Virro et al. versus Gandini et al., on retrouve des populations essentiellement identiques (statut de fertilité, âge, etc.) avec des indications de FIV/ICSI comparables. Ces faits semblent remettre en cause le seuil discriminant de 30 % avec la technique SCSA et justifient la poursuite des études sur la valeur discriminante du test. Bien que la technique SCSA puisse être facilement applicable dans un laboratoire de recherche clinique, selon les données de la littérature, elle semble être moins spécifique en ce qui concerne le type de dommages à l’ADN des spermatozoïdes que les autres tests décrits dans cette section. Fondamentalement, la technique SCSA ne détecte que les altérations en protamination de la chromatine et la faible proportion des ponts disulfures dans et entre les protamines [35]. 1.5. Test in situ de cassures dans l’ADN (In situ Nick Translation Assay – NT) Le test in situ de cassures dans l’ADN mesure l’incorporation du complexe biotine–dUTP aux cassures simple-brin de l’ADN en utilisant l’activité de l’enzyme ADN polymérase I. Le signal peut-être amplifié par l’utilisation d’un fluorochrome conjugué à de l’avidine et facilement identifiable en microscopie à fluorescence [36–42]. Un niveau de < 10 % de cassures dans l’ADN a été utilisé comme seuil pour prédire la capacité de la chromatine des spermatozoïdes à se décondenser après une technique d’ICSI (Tableau 1) [38]. Par ailleurs, toujours selon Sakkas et al., il apparaît que la morphologie des spermatozoïdes n’a aucune relation avec l’intégrité de l’ADN et ne soit d’aucune utilité pour sélectionner les spermatozoïdes dotés d’une bonne intégrité de l’ADN en vue d’une utilisation en ICSI [38]. Les travaux de Twigg et al. [39–41] ont tenté d’améliorer la technique NT. Dans une étape préalable, les spermatozoï-

des sont traités au dithiothréitol (DTT) pour décondenser la chromatine. Le DTT réduit les ponts disulfures intra- et intermoléculaires de la chromatine, relâchant ainsi sa structure fortement condensée et permettant à l’enzyme et aux nucléotides d’accéder plus facilement aux cassures de l’ADN, améliorant donc la sensibilité de la méthode. Cette amélioration de sensibilité permettrait de mieux différencier les échantillons de sujets fertiles et infertiles [17]. Cependant, une telle procédure n’a pas trouvé sa place avec le développement de la technique de marquage des brins d’ADN à la terminale désoxynucléotidyle transférase (TUNEL), une variante du test in situ de détection de cassures dans l’ADN. Peu d’études ont proposé un seuil discriminant (standardisé) en rapport avec le statut de fertilité pour la technique d’analyse NT, limitant son utilisation clinique. 1.6. Marquage des brins d’ADN avec la terminale désoxynucléotidyle transférase (Terminal Uridine Nick-End labeling – TUNEL) Lors de la fragmentation de l’ADN, des groupements terminaux 3′-OH sont générés et deviennent donc facilement identifiables [43]. Une des techniques utilise l’activité spécifique de la terminale désoxynucléotidyle transférase (TdT) pour incorporer un complexe biotine–désoxyuridine (pour Terminal Uridine Nick-End labeling – TUNEL) à la portion 3′-OH terminale d’un brin d’ADN [44,45]. Un signal est obtenu par l’addition de streptavidine couplée à la fluorescéine. La très grande constante d’affinité et la spécificité de l’association biotine–avidine diminuent les liaisons non spécifiques comme celles observées lors de l’utilisation d’anticorps [46]. Les spermatozoïdes avec une chromatine normale ne présentent qu’une très faible fluorescence à l’inverse des spermatozoïdes avec de la fragmentation de l’ADN (Fig. 4). La détection de la fragmentation de l’ADN peut être obtenue avec seulement un à deux millions de spermatozoïdes en cytométrie de flux [46]. Plusieurs équipes [47–54] ont rapporté leurs expériences avec la technique TUNEL (Tableau 1). L’une des faiblesses de la technique TUNEL réside dans l’accessibilité de l’enzyme TdT pour son substrat. En effet, la chromatine des spermatozoïdes « normaux » étant fortement condensée (six fois plus que dans les cellules somatiques) et située dans un environnement peu hydraté, la pénétration de la TdT peut s’en trouver compromise par un degré élevé de compaction nucléaire. Cependant, comme le degré de dénaturation en milieu acide (témoin d’un faible état de protamination) semble associé au degré de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes [45,55–57], il est fort probable que même si l’enzyme TdT ne pénètre que difficilement dans un noyau très compact, il y aurait de toute façon peu de fragments 3′OH disponibles (faible fragmentation) dans ce cas. Sur le plan pratique, la technique TUNEL (tout comme la technique SCSA) utilise la cytométrie en flux pour produire des résultats fiables et reproductibles, avec peu de variations inter-essais. L’utilisation de la microscopie à fluorescence peut

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Fig. 4. Détection de la fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes obtenu par la technique TUNEL en cytométrie en flux chez un sujet infertile. Le degré de fragmentation de l’ADN peut être obtenu par l’acquisition du signal des paramètres de la taille et granularité (région R2) des spermatozoïdes (1A-3A), ou par la fluorescence émise par les noyaux (marqués à l’iodure de propidium) des spermatozoïdes (1B-3B). Les spermatozoïdes du témoin positif sont exposés préalablement à la DNase I et présentent 91,43 % de marquage positif (1C). Le témoin négatif est préparé de façon à ne pas exposer les spermatozoïdes à l’enzyme terminale déoxynucléotidyle transférase (TdT) ; 0,91 % des spermatozoïdes présentent une fluorescence (2C). Selon la technique TUNEL, l’échantillon du sujet infertile (3C) présente 20,29 % ([21,20 %]–[0,91 %]) de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes (Teulé et al., travaux non publiés).

être une alternative à la cytométrie en flux notamment en cas d’oligozoospermie très sévère. Cependant, cette approche augmente considérablement le temps d’analyse et diminue la fiabilité (observation visuelle qualitative) dans l’interprétation des résultats. Cette diminution de fiabilité est essentiellement fondée sur un problème technique : sur lame, et pour l’œil de l’observateur, à partir de quel niveau de cassures un spermatozoïde devient-il marqué ? L’utilisation de la cytométrie en flux prévient ce type de faiblesse. Après avoir soumis des spermatozoïdes à une technique de migration ascendante (swim-up), Sun et al. [46] ont démontré que la majorité des échantillons de sperme utilisés en FIV avaient moins de 4 % de spermatozoïdes avec ADN endommagé, et 27 % des échantillons avaient un degré de fragmentation de l’ADN qui variait entre 5 et 40 %. Aussi, les résultats de la technique TUNEL étaient faiblement corrélés aux paramètres du spermogramme ainsi qu’au taux de fécondation obtenu en FIV/ICSI [46], résultats confirmés par d’autres travaux de la même équipe [58,59].

Il a été rapporté qu’une atteinte importante de l’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes pouvait influencer négativement la capacité fécondante in vitro de ces derniers. Lopes et al. [59] ont observé que le sperme d’hommes présentant une fragmentation de l’ADN supérieure à 25 % abaissait le taux de fécondation, lors d’ICSI en dessous de 20 %. En FIV/ICSI, Benchaib et al. ont observé une baisse significative des probabilités de grossesse lorsque le niveau de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes était supérieur à 20 %, mesuré par la technique TUNEL [60]. Récemment, Seli et al. (2004) ont rapporté qu’il existait une faible corrélation (r = –0,4) entre le développement du blastocyte et le pourcentage de spermatozoïdes à ADN fragmenté, suggérant que les anomalies de l’intégrité nucléaire des spermatozoïdes pourraient être responsables en partie de la piètre qualité des embryons et de leur développement [61]. Cependant et de façon surprenante, ils ont enregistré un taux de grossesse clinique de 43 et 50 % lorsque le seuil de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes était supérieur ou égal à 20 % et inférieur à 20 %, respec-

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tivement. Cette tendance n’était pas statistiquement significative (p = 0,45). De toute évidence, la mesure de l’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes demeure un paramètre difficile à interpréter. Une valeur discriminante du degré de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes doit être proposée pour cibler un seuil diagnostic au-dessus duquel la survenue d’une grossesse est peu probable. Actuellement, quelques études utilisant la technique TUNEL ont proposé des valeurs limites in vitro et in vivo (Tableau 1). Cependant, l’hétérogénéité des résultats obtenus dans la littérature pour ces valeurs discriminantes entre une population d’hommes fertiles et infertiles rend son application clinique plus difficile. Utilisant le modèle statistique des courbes de R.O.C., nous avons réalisé récemment une étude pour déterminer un seuil discriminant in vivo du test de la fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes chez une population d’hommes infertiles et d’hommes fertiles donneurs de sperme [62]. Dans cette étude, le seuil de 20 % de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes est associé à une spécificité et à une valeur prédictive positive de 91,15 et 96,97 %, respectivement. Nos résultats suggèrent que la fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes, mesurée par la technique TUNEL, est un très bon indicateur de la fertilité masculine (élément diagnostique). Il conviendra de confirmer ce seuil lors d’études prospectives sur de plus grands effectifs. En résumé, la littérature disponible confirme les différentes observations suivantes sur les qualités de la technique TUNEL : le degré de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes apparaît généralement comme faiblement corrélé aux paramètres du spermogramme ; la technique TUNEL semble être une méthode relativement sensible, spécifique, reproductible et facilement applicable dans un laboratoire de recherche clinique et/ou fondamentale [62]. Ces caractéristiques en font une technique idéale pour la détection des dommages aux spermatozoïdes dans une étude longitudinale (analyse de risque, toxicologie, etc.).

2. Discussion Les sections précédentes reprennent chacun des différents tests qui s’intéressent à l’intégrité du matériel génétique des spermatozoïdes. Cependant, un petit nombre de ces tests a réussi à s’intégrer en routine dans les laboratoires cliniques ou de recherche en raison de l’absence de standardisation des protocoles et des limites d’interprétation de leur valeur prédictive de la survenue d’une grossesse [35]. La valeur prédictive, retenue pour les résultats d’un test donné, peut se référer au statut clinique de fertilité ou d’infertilité ou à l’issue de la grossesse (Tableau 1). Pour plusieurs tests, des corrélations ont été obtenues entre l’infertilité, une mauvaise qualité du sperme et un nombre élevé de spermatozoïdes avec ADN endommagé. À l’opposé, dans la mesure où chez certains patients une bonne qualité du sperme n’exclut pas la présence de dommages à l’ADN [31], il est important de disposer d’un test capable de détecter ces altérations. Un bon test

doit également permettre d’évaluer, dans des études épidémiologiques et/ou toxicologiques, l’intégrité du matériel génétique lorsque les gonades mâles ont été exposées à des agents chimiques, physiques ou pharmacologiques [63]. Des recherches complémentaires s’avèrent nécessaires afin de déterminer la valeur prédictive des tests dans les cas d’exposition à plusieurs catégories de substances, et en relation avec les anomalies qui pourraient être constatées chez les descendants. Dans une certaine optique, les techniques TUNEL, SCSA, COMET et NT sont complémentaires [35]. Le TUNEL et le COMET (à pH = 9) peuvent mesurer les cassures simple- et double-brin de l’ADN, le SCSA peut détecter les anomalies de compaction de la chromatine et la technique NT peut détecter les cassures simple-brin d’ADN [19]. Cependant, il est possible que des spermatozoïdes présentent un faible degré de dénaturation de la chromatine, mesuré par le SCSA, tout en montrant un degré élevé de fragmentation de l’ADN, mesuré par la technique TUNEL. De telles différences expliquent en partie des corrélations variant de r = 0,562 [64] à 0,859 [55] entre les différents tests [45,55,57,64,65] et renforcent l’opinion que chacun mesure un aspect particulier du processus de compaction de la chromatine. De plus, la grande hétérogénéité des éjaculats, particulièrement chez l’humain, incite fortement à utiliser plus d’un test [35]. 2.1. Quelle est l’origine des dommages à l’ADN ? L’origine exacte de la fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes n’est pas encore établie. Cependant, plusieurs mécanismes ont été proposés : défaut dans le remodelage et la compaction de la chromatine ; production de SOR (substances oxygénées réactives) par les spermatozoïdes immatures et apoptose lors de la spermatogenèse. Des altérations dans les processus de la spermiogenèse peuvent favoriser des défauts dans le remodelage et la compaction de la chromatine. McPherson et Longo [66] ont proposé que la présence de cassures dans l’ADN des spermatozoïdes éjaculés serait l’indication d’une maturation incomplète de ces cellules en différenciation lors de la spermiogenèse. Ces cassures ou dommages dans l’ADN générés par la topoisomérase II (Topo II) seraient nécessaires pour libérer les supertours dans la chromatine lors du réarrangement du matériel génétique. Un dysfonctionnement de la Topo II pourrait conduire à la présence d’un taux anormal de fragments d’ADN non réparés [66]. Par ailleurs, les cassures dans l’ADN pourraient être le reflet direct des dommages à l’ADN via un stress oxydatif causé par les SOR [67,68]. La production des SOR par les spermatozoïdes est un processus physiologique normal et nécessaire pour la survenue de la capacitation et la réaction de l’acrosome [69]. Cependant, leur présence en grande quantité dans le liquide séminal semble être néfaste pour l’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes. Ils agiraient sur les composantes de l’ADN produisant un spectre très large de dommage : délétions, bases azotées libres, cassures, etc. [70]. Les dommages liés à l’oxydation des bases constitutives de

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l’ADN des spermatozoïdes ont été étudiés par la mesure du 7-hydro-8-oxo-2’déoxyguanosine (8-oxodG) [71–74]. Selon Oger et al. (2003) la numération et le degré de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes, mesurés par le SCSA, sont faiblement corrélés à la mesure du 8-oxodG, r = –0,35 et r = –0,34, respectivement [74]. De toute évidence, devant la faible relation du 8-oxodG avec ces deux paramètres du sperme, le stress oxydatif généré par les SOR n’explique qu’en partie la fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes. Par ailleurs, selon Loft et al. (2003), ce bio-marqueur présente « peu » de variations intra-individuelles (19,6 %) et semble influencer le potentiel de fertilité [73]. Cependant, cette mesure présente quelques faiblesses (oxydation pendant l’analyse, variation dans le nombre de spermatozoïdes analysés, etc.) qui demandent prudence lors de l’interprétation des résultats [75]. Le fait que des cassures dans l’ADN puissent être créées chez des spermatozoïdes éjaculés via un stress oxydatif [68] indiquerait que les spermatozoïdes positifs à la technique TUNEL ne sont pas nécessairement le résultat d’une apoptose « avortée » [71,76]. Contrairement aux cellules somatiques, les spermatozoïdes, de par leur nature, n’exhibent pas les changements morphologiques caractéristiques de l’apoptose. Il a été suggéré que la fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes, mise en évidence par la technique TUNEL, serait le reflet de l’activité apoptotique des cellules germinales ou même, possiblement, des spermatozoïdes matures [67,77]. Cependant, les travaux récents de Lachaud et al. (2004) suggèrent fortement que les spermatozoïdes éjaculés n’ont pas la capacité d’initier la voie apoptotique vers la fragmentation de l’ADN [78]. Après avoir soumis des éjaculats de sperme de donneurs à différentes techniques de séparation des spermatozoïdes, les auteurs n’ont pas observé d’augmentation de la présence des marqueurs de l’apoptose (extériorisation de la phosphatidylserine et TUNEL) après 24 heures d’incubation à 37 °C. Plus intéressant encore, cette étude suggère que la nécrose n’a aucun impact sur la fragmentation de l’ADN de spermatozoïdes et ce y compris devant une atteinte significative de l’enveloppe nucléaire, mise en évidence par l’iodure de propidium. Cependant, malgré l’absence relative d’extrémité 3′ sortante sur les fragments d’ADN générés lors de la nécrose, il demeure un risque de faux-positif avec la technique TUNEL dans certaines situations où de gros fragments sont formés (par exemple : faible concentration en zinc, temps d’incubation long, etc.) [79]. Par ailleurs et de façon rassurante, dans la mesure où la nécrose est accompagnée d’une perte de la mobilité du spermatozoïde, il est peu probable que ce dernier soit impliqué dans la fécondation in vivo d’un ovocyte. D’un autre côté, lors d’ICSI, dans les cas d’absence de mobilité (asthénozoospermie sévère, syndrome de Kartagener, spermatozoïdes testiculaires), la situation est plus délicate. L’utilisation du test de gonflement des spermatozoïdes en milieu hypo-osmotique (Hypo-Osmotic Swelling Test – HOS) peut aider au choix dans le choix d’un spermatozoïde capable d’initier et mener à terme une grossesse [80].

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2.2. Quelles peuvent être les conséquences d’une fécondation par un spermatozoïde dont l’ADN est endommagé ? D’entrée de jeu, rappelons que la présence de spermatozoïdes avec ADN fragmenté dans le sperme est un phénomène bien établi [81,82]. De plus, des hommes dont le spermogramme comporte des anomalies significatives de concentration, mobilité et morphologie présentent souvent un taux élevé de fragmentation de l’ADN de leurs spermatozoïdes [37,83,84]. Il devient donc important de considérer les conséquences possibles de la fécondation d’un ovocyte par un spermatozoïde ayant un niveau élevé de fragmentation de son ADN. Ceci est d’autant plus important lorsque le niveau de fragmentation de l’ADN du spermatozoïde dépasse la capacité de l’ovocyte à réparer le matériel génétique de ce dernier [85,86]. Cette anomalie des spermatozoïdes peut provoquer non seulement des problèmes de développement embryonnaire [87–89], mais aussi des fausses couche spontanées [90]. Plusieurs évidences en recherche animale indiquent clairement la capacité des ovocytes (chez les mammifères) à réparer les dommages endogènes (SOR, altérations spontanées) et/ou exogènes (radiations ionisantes, composantes toxiques de l’environnement, etc.) à l’ADN des spermatozoïdes (Ashwood-Smith et Edwards [91] pour revue). La réparation (post-fécondation) ovocytaire des dommages à l’ADN impliquerait des mécanismes pré- (G1) et post-réplication (G2) [92]. Cependant, la capacité de l’ovocyte à pouvoir réparer l’ADN endommagé du spermatozoïde serait limitée, et fonction du degré de l’atteinte du génome. Les dommages au dessus de cette capacité de réparation résulteront en l’arrêt du développement et inévitablement en la perte de l’embryon [86]. En clinique, la fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes a des implications importantes au regard des techniques d’AMP, telles que l’insémination intra-utérine (IIU), la FIV et l’ICSI. La fécondation par un spermatozoïde porteur d’un ADN endommagé (modèle animal) peut favoriser la transmission paternelle de gènes compromettant le développement embryonnaire normal [85]. En particulier, la forte prévalence de dommages à l’ADN des spermatozoïdes chez des hommes qui ont une faible qualité de sperme pourrait induire, lorsqu’ils ont recours à la technique d’ICSI, un plus grand risque de transmission de défauts génétiques à leurs descendants. Sakkas et al. [38] ont observé que les ovocytes qui n’ont pas été fécondés après ICSI et FIV avec des spermatozoïdes présentant un haut degré de fragmentation de l’ADN contenaient un nombre supérieur de spermatozoïdes condensés. Ceci indique que l’ADN endommagé de spermatozoïdes sélectionnés lors d’ICSI peut perturber le phénomène de décondensation de la chromatine et mener ainsi à un échec de fécondation. Même si un haut degré de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes est associé à un faible taux de fécondation, il n’en reste pas moins que les embryons issus de ces fécondations pourraient voir leur développement compromis [93]. Cette plausibilité biologique s’explique selon

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Guérin et Benchaïb [94] puisque le génome de l’embryon s’active à partir du stade 6-8 cellules, les premiers stades du développement embryonnaire étant dépendants des transcrits ovocytaires. Ainsi, à l’instant où le développement du conceptus est sous contrôle de son propre génome, il devient évident qu’il puisse y avoir arrêt du développement si celui-ci a été fécondé par un spermatozoïde avec ADN endommagé. L’utilisation de la mesure de l’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes ne peut à elle seule prédire en FIV/ICSI la fécondation, le développement embryonnaire ou mieux, le taux de grossesses menées à terme. Ainsi, lors d’une étude prospective, Tesarik et al. (2004) ont comparé plusieurs paramètres en ICSI (fécondation, morphologie embryonnaire, taux d’implantation et degré de fragmentation de l’ADN [TUNEL] des spermatozoïdes) chez deux groupes de couples infertiles : ceux ayant eu, préalablement, trois échecs d’ICSI avec donneuse et ceux ayant leur première ICSI avec donneuse, la même donneuse étant utilisée pour les deux groupes. Les auteurs de cette étude n’ont pu démontrer d’association entre le degré de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes (mesuré sur lame) et son effet sur la morphologie embryonnaire avant implantation (effet paternel « précoce »). A l’inverse, dans le groupe sans grossesse mais dont les embryons ne présentaient pas d’altération morphologique, ils mettent en évidence un taux de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes élevé (effet paternel « tardif ») [95]. Ces résultats avaient aussi été rapportés dans une étude récente [60]. Un taux élevé de fragmentation de l’ADN a aussi été rapporté dans les spermatozoïdes d’hommes dont les conjointes avaient une histoire de fausses couches (inexpliqués) à répétition [90]. Celles-ci pourraient résulter d’une déficience du matériel génétique secondaire à la perte, lors du premier clivage, de fragments d’ADN du génome mâle [96]. Cependant, les mécanismes exacts de l’association « fragmentation de l’ADN/altération du génome et développement anormal des embryons » sont peu connus [97–99].

et de biologie moléculaire ont permis d’améliorer de façon notoire les connaissances sur la biologie du gamète mâle chez les mammifères. Parallèlement, le développement et l’utilisation de tests in vitro évaluant les propriétés du spermatozoïde requises pour la fécondation ont bouleversé l’approche clinique de l’infertilité masculine, imposant une démarche diagnostique beaucoup plus axée vers des aspects fonctionnels. Même si la majeure partie des tests s’intéressant à l’intégrité de la chromatine des spermatozoïdes décrits dans cet article n’est pas encore appliquée en routine, en clinique et en recherche, il n’en demeure pas moins qu’une certaine demande émerge, à l’occasion, de spécialistes en AMP. L’utilisation en routine de certains de ces tests doit cependant passer par une standardisation des protocoles interlaboratoires et évidemment, par l’établissement de seuil discriminant in vivo et in vitro pour que ces tests présentent une bonne valeur prédictive dans la survenue d’une grossesse. Références [1]

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2.3. Perspective clinique et recherche L’étude de l’intégrité de la chromatine des spermatozoïdes devrait trouver une application principalement en toxicologie et en clinique. En clinique de fertilité sûrement, car la mesure de l’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes est un paramètre important. En plus de son potentiel à prédire les difficultés à concevoir, cette étude pourra aider le clinicien à choisir une approche thérapeutique qui permette d’éviter les traitements inutiles [62]. En toxicologie de la reproduction enfin, car cette mesure permettra d’aborder dans une optique nouvelle les effets d’agents chimiques [100], physiques [85,101] ou même biologiques [102] sur les cellules germinales. La relation effet–dose pourra être objectivée de façon quantitative selon le degré de fragmentation de l’ADN. 3. Conclusion Lors des deux dernières décennies, des approches expérimentales fondées sur des techniques modernes de biochimie

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