Activité antiplasmine, antitrypsine et antithrombine de l'alpha2-macroglobuline

Transfusion. T. X. N ° 1. - - 1967

103

Activit~ antiplasJnine, antitrypsine et antithrombine de l' alpha2-macroglobuline p a r M. S T E P C B U C H , Ch. B L A T R I X et F. ]OSSO*

On trouve dans t o u s l e s syst~mes enzymatiques des activatenrs et des inhibiteurs. Ainsi la capacit6 du s~rum d'inhiber certaines prot6ases telles que la trypsine [9a] ou la thrombine [51, 39] est-elle connue depuis fort longtemps. Parall~lement aux connaissances de plus en plus larges concernant le hombre et la sp~cificit6 des enzymes prot6olytiques, on a cru ddceler des inhibiteurs sp~eifiques pour chacun d'entre eux et les termes d'antitrypsine, d'antiplasmine ou d'antithrombine 6voquent le plus souvent la notion d'un inhibiteur individuel et sp~cifique. Cependant, les connaissances actuelles sont plus conformes h la notion d"inhibitettrs multivalents mais ayant des affinit(is plus ou moins s61ectives. L'~2-macroglobuline (a2M) est l'exemple type de ce genre d'inhibiteurs. E l l e a 6t4 isol~e presque en m~me temps darts trois laboratoires diff6rents [3, 41, 53, 54] mais son action anti.prot6ase n'a 4t~ rdv~]de que plusieurs ann6es plus tard [56, 71, 74]. L'interaction de l'azM avec la trypsine, la plasmine et la thrombine fair l'objet de cette 6rude. Mat6riel et m 6 t h o d e I. - - MATERIEL a) L',-2M a 6t6 prdpar6e selon la technique d6crite (72) avec des modifications mineures concernant notamment la diminution de la quantit~ de bentonite et de DEAE-cellulose utilis~e an cours de ce proc~d~. Le produit final est une pr6paration homog~ne comme le montre l'uhracentrifugation analytique (1), l'61ectrophor~se en gel d'amidon et l'immuno~lectrophorbse. * Centre N a t i o n a l de T r a n s f u s i o n S a n g u i n e , Dir. J. P. SOULI~R. (1) A n a l y s e f a i t e h la S t a t i o n d ' U l i r a c e n t r i f u g a t i o n d u C.N.R.S. D i r . Wu:'a~ sea.

S. FILITTI~

104

SOCII~T~ NATIONALE

L'~eM subit une transformation mo16culaire au cours de la conservation ~ l'6tat congel6 comme l'a montr6 GENTOU []4], et nous avons 6ga]ement constat6 une perte d'activit6 r6versible dans ces conditions. L'a2M peut ~tre lyophilis6e en pr6sence de certains anions protec. teurs (citrate, cacodylate) mais ces pr6parations ont n6anmoins une activit6 inf6rieure ~ celle des pr6parations eonserv6es A l'6tat liquide /t + 4 ° [67a]. Nous avons donc utilis6 des pr6parations d'a~M conserv6es ~ + 4 ° pendant tout an plus 14 jours ou des pr6parations congel6es et qui ont 6t6 r6chauff6es pendant an moins une heure h 37 °, co traitement provoquant en effet un r6arrangement mol6culaire [14]. b) Le plasminog~ne d'origine humaine a 6t6 pr6par6 b p a r t i r de la frac. tion I I I [70] et il a 6t6 purifi6 par adsorption sur DEAE-cellulose en pr6. senee de lysine. c) La streptokinase provient des laboratoires K a b i (Stockholm). d) Le fibrinog~ne humain exempt de plasminog~ne a 6t6 pr6par6 en adsorbant le pro-enzyme sur phosphate tricalcique selon la technique d6erite [2]. e) La cas6ine Merck a 6t6 purifi6e selon les indications de MULLERTZ [42] avec les modifications de DERECHIN [11]. f) La trypsine provient des lahoratoires Choay, elle titre 25.000 u.S.T. p a r ml. g) L'inhibiteur pancr6atique (Iniprol) provient des laboratoires Choay, il titre 100.000 u par ml. h) L'inhibiteur du soja provient des laboratoires Mann Research Laboratories New York. i) Thrombines bovine (Roche), 6quine (Roussel) et humaine du C.N.T.S. j) TAME (Tosyl-arginine-m6thylester) et B A P N A (Benzoylarginine-pnitranilide sont fournis par Mann Research Laboratories New York. k) L'h6parine provient des laboratoires Girard-Mounier; elle titre 5000 u p a r ml. 1) La m6thylamine provient des laboratoires Prolabo. II. - - MI~THODES Les 6tudes pr6alables ont montr6 que l'a2M non trait6e par la ben. tonite contient du plasminog~ne [71]. Celui-ci peut-6tre mis en 6vidence par addition de streptokinase dans un syst~me fibrinolytique ne compor. taut par ail]eurs aucune source de plasminog~ne. Un temps de lyse de quelques minutes est alors observ6. Ceci montre que l'interaction p]asmine/a2M n6cessite un laps de temps minimal. C'est pourquoi, nous avons toujours prJ-incub6 l'enzyme actif (plasmine ou trypsine) avec 1'~2M pendant 15 minutes avant de proc6der b ]a mesure proprement dite. Les activit6s prot6olytiques de ]a plasmine et de ]a trypsine ont 6t6 mesur6es dans diff6rents syst~mes. A) ]e temps de lyse d'un eaillot standard [21. B) ]a cas6inolyse selon ]a technique de REMMERT et COHEN [48] avec des modifications mineures.

DE TRANSFUSION SANGUINE

105

C) la mesure de l'activit6 d'antithrombine progressive a 6t6 effectu6e en mesurant le temps de coagulation d'une solution de fibrinog~ne par le m6lange a2M/thrombine en fonction du temps d'incubation de ce dernier. Les temps obtenus sont rapport6s en unit6s de thrombine (N.I.H.) au moyen d'une courbe d'6talonnage. D) l'activit6 de co-facteur de l'h6parine a 6t6 6valu6e selon la technique suivante: variation du temps de coagulation, d'un systbme comprenant fibrinog~ne, h6parine et thrombine en fonction d'addition de s~rum plus ou moins dilu6 ou d',~2M [75]. E) les activit6s est6rasiques de la plasmine, de la trypsine et de la thrombine ont 6t6 mesur6es selon les techniques suivantes : 1) avec le TAME comme substrat en suivant le procgd6 de SCHWERT et coil. [57] adapt6 par TROLL et coll. [76]. 2) toujours avec le TAME mais en employant la m6thode de SIEGELMANNet coll. [64]. 3) avec le BAPNA utilis6 selon la m6thode d'ERLANGER et coil. [12]. R6sultats La figure 1 montre que l'addition de plasmine ou de trypsine ~ l'a2M

1

2

3

4

FIG 1. - - M o b i l i t 6 ~ i c c t r o p h o r 6 t i q u e d e l'~o~2M et d e s n161anges a 2 M / p r o t 6 a s e e n gel d ' a midon. Microte,chniquc s e l o n MOUaAY et coil. (40) - 1 / S 6 r u m tdmoin; 2/o~ 2 t6r n o i n ; 3 / ~2 M _l_ P l a s m i n e ; 4/ o~2M -~- t r y p s i n c .

provoque 1'apparition d'une deuxibme bande un peu plus rapide que l~-zM t6moin apr~s 61ectrophor~se en gel d'amidon. Cette bande est d'autart plus importante que la quantit6 d'enzyme ajout~e est 61ev6e. L'addition de thrombine donne le m~me r6sultat alors que celle de plasmino-

106

SOCIETE N A T I O N A L E

g~ne ou de prothrombine ne modifie pas le comportement 61ectrophor6tique de '['~,2M. Le tableau I montre l'inhibition de ractivit6 prot6olytique de la plasTABLEAU I L'effet inhibiteur de l'a2M sur la plasmine est net malgrd [a concentration dlevde de l'enzyme protdolytique, choisie pour ces essais.

l

Cas61nolyse

(1' t?rc~slne/ml/h,)

Fibrinolyse (secondes)

o o

o,

8 o

0

0,25

0,50

1

2

4

6 gr/I.

Concentration en a2M

ACTIVITE PROTEOLYTIQUE DE LA PLASMINE SUR LA CASEINE ET LA FIBPdNE ACTIVITE INHIBITRICE DE L ' g 2MM..

mine avec la cas6ine et la fibrine comme substrats, et le tableau II donne les r6sultats correspondants pour la trypsine. Le tableau III monlre que les complexes a~M/trypsine et .azM/plasmine conservent leur activit6 est6rasique alors que ces m~mes complexes n'ont plus d'activit6 prot6olytique. Ce fait a 6t6 constat6 sur deux substrats h l'aide de trois techniques diff~rentes comportant chacune son propre tampon. L'addition de l'inhibi-

107

DE TR~4NSFUSION SANGUINE

TABLEAU II.

L'activitd anti-trypsine de l',azM est tr~s importante puisque pour obtenir une diminution nette de l'activit6 protdolytique de [~ trypsine des concentrations fai. bles d'c~M sont suffistmtes. Z

m|/h. ) _c:

0 ..,¢

I\

I~A

--

0

¢N

k,=

I I

I i

0

0

0,03

0,06 0,125 concentrat;on en a2M

i

0,25

I

U 0,5 gr/I.

ACTIVITE PROTEOLYTIQUE DE LA TRYPSINE SUR LA CASEINE ET LA FIBRINE ACTIVITE INHIB|TRICE DE L'~.2M

1

SOCIET~ N4TION4LE

108

TABLEAU III

L'a2M n'inhibe ni l'activitd estdrasique de la trypsine ni ceUe de la plasmine. L'a2M protege la trypsine et la plasmine vis ~ vis de l'inhlblteur pancrdatique : celui.ci n'inhibe plus que partiellement l'activitd est~rasique du complexe a2M/ enzyme pr&incttbd. fibr[no incub. 15 m~n,

~ 30 sec. (pla~m~ne) .--~'~ ~. Tncoog. (tryp~Tne)

IM (lo~/L.)

~ ~ h,

z e:0¢ M, pr6rneubg + ~nhib~feur pancri a~/que ! 0

~ ' 1 ,%

I

Enzyme + inhl iteur pahcrgal'tque k

15

30

45 rnln.

ACT l V ]TE I~STERASIQUE DES COMPLEXI~S c~2M/PROTEASES

L'act;vff~ est~ras~quv est expr~m~e en ~4rnoles/ml/h.

Corn~e eH~dlff~re selon JVenzyme

DE T R A N S F U S I O N SANGUINE

109

TABLEAUIV Activitd antithrombique de l'c~2M Variation de l'activit~ antithrombique de l'~2M en fonction de sa coltcentratlon 0,I ml de thrombine (100 U. N I H / m l ) et incub6 ~ ~ 37°C avec 0,1 rnl d'a2M. Apr~s 30 minutes d'incubation, ractivitd thrombiqne du mdlange est ddterminde p~r addition de 0,2 ml de [ibrinog~ne (0,2 %).

thrombine rdsiduelle 50 'NiH)

4£

30

20

L

40

~ 2 M g/t o,61,2 ~s

s

~o

20

TABLEAU V

Variation de l'activit6 antithrombique de l'a2M en bation de l'enzyme avec l'inhibiteur. La thrombine (i00 mdlang~es ~t parties dgales, ylpr6s des temps d'incubation thrombique du mdlange est d~terminde par addition de de fibrinog$ne (0,2g %). Concentration de cette solution d'~a~M': 1) : 1% 2) : 0,5'% 3) : 0,25%

tonction d u temps d'incu. U. N I H / m l ) , et l'a2M sont variables, ~ 37°C, l'activit~ 0,2ml du mdtange, fi 0,2ml

thrornbine r~sldv~lle

b (U. N / H )

,I

I

20- _ - ~

_

,

', i ,

•

5

_

.

q)

~

temps 3

6

12

'

'

-2¥

d'incubation

d d7%.

~mn

3~

TABLEAU VI Etude comparative de raction du sdrum et d'une solution d'a2-macroglobuline sur l'activitd antithrombique immediate de rhdparine TEMPS SYST~ME

DE COAGULATION

0,1 Fibrinog6ne 0,1 >> 0,1 >>

~- 0,2 tampon A- 0,1 ~2M + 0,1 h6parine

-~- 0,1 tampon + 0,1 tampon

-4- 0,1 Thrombine A- 0,1 + 0,1 >>

16" 15"

0,1 0,1

-t- 0,1 h6parine + 0,1 h6parine

-t- 0,1 a2M -4- 0,1 s6ru.m

-~ 0,1 + 0,1

15" 42"

>> >>

) >>

L'azM n'a pas d'activit6 << co-facteur >> de l'h6parine, e'est.[t-dire qu'elle n'a pas d'activit6 antithrombiqne imm6diate en pr6sence d'h6parine. 0,1 ml de fibrinog6ne h~main (0,2 %) est coagul6 par 0,1 ml de thrombine humaiue (5 U / m l environ) en pr6sence de 0,1 ml d'h6parine (0,5 7/ml) et de 0,1 ml de tampon, de s6rum ou d'une solution d'~2M (0,65 '%).

111

DE TRANSFUSION SANGUINE

TABLEAU VII La mdthylamine supprime l'aetivitd antbprotdase de l'a2M. Cette perte d'activit~ est en grande pattie r~versible apr~s dialyse du mdlange.

.E

o"

0

u

o

E.

~

o"

;oo o

o

50

+

+

o

•

m AVANT DIALYSE

E

÷ I

"

APRES DIALYSE

L

IACTION DE LA MET.HYLAMINE SUR UACTIVITE ANT PRPTEASE | DE L' a2M

I

teur pancr~atique ne bloque que partiellement l'activit6 est~rasique des complexes alors que celle des enzymes seuls est compl~tement inhib~e par une quantit~ analogue d'inbibiteur pancr~atique. Le complexe '~2M/thrombine conserve lui aussi son activit~ est~rasique. Le tableau IV met en ~vidence ractivit~ d'antithrombine progressive de l'a2M et ]e tableau V l a cin~tique de cette r~action en fonction de la concentration en ~a2M. L~a2M n'a pas de propri~t~s de co-facteur de l'h~parine comme il r~sulte du tableau VI. Enfin le tableau VII montre l'inactivation r~versible de ]'~2']¢I par la m~thylamine, inactivation qui s'accompagne d'une modiiication mol~culaire r~v~l~e par n n d~doublement de la bande de l'a2M en gel d'amidon.

112

SOClggTI~ NATIONALE

Discussion La litt6rature concernant les antiprot6ases da s6ram est part~culi~rement abondante. Cependant, on ne trouve, parmi ces nombreuses ~tudes, gu~re d'616ments permettant d'attribuer au m~me support prot6ique h la fois une activit6 d'antithrombine progressive et eelle d'une antitrypsine ou d'une antiplasmine [66] ~ l'exception toutefois d'une publication tr~s r~cente de RIMON et coll. [49] alors que la capacit6 d'inhiber h la fois la trypsine et la plasmine a d6jh $t6 attribu6e ~ certains inhibiteurs du s6rum [61, 63, 16, 17]. C'est pourquoi, nous allons d'abord discuter des antitrypsines et des antiplasmines avant d'aborder s6par6ment les antithrombines. La propri6t~ du s6rum d'inhiber l'activit~ prot6olytique de la trypsine est connue depuis la fin du si~cle dernier [9a] alors que les premiers tra. vaux concernant son effet inhibiteur sur la plasmine remontent h u n peu plus de vingt ans [10, 23, 29]. Le support prot6ique de ces inhibiteurs n'6tant pas connu, on a essay6 de les d~finir par certaines propri6t6s physicochimiques telles que la r~sistance h la chaleur [62, 46] aux modifications de pH [78], aux traitements ehimiques [47], la solubilit6 [62, 17, 50, 59, 60] et la mobilit6 61ectrophor6tique [18, 21, 24, 30, 43]. D'autres crit~res concernent lear interaction << immediate >> ou << progressive >> avec les diff6rentes prot6ases [46] ainsi que la << sp6cificit~ >> de leur action sur tel ou tel enzyme. Nous trouvons ainsi des d6finitions telles que l'inhibiteur al ou a2 [4], iuhibiteur labile [61, 62] ou stable [45] progressif ou imm6diat [46], des d6nominations telles que << antitrypsine >>, << anti-plasmine >>, etc., attribuant de la sorte une sp~cificit6 exclusive h tel ou tel inhibiteur [46, 49, 4, 13, 44]. Les diff6rents supports prot6iques commencent h ~tre connus et nous savons maintenant que les choses sent h la lois plus complexes et plus simples. Plus simples, parce qu'il ne paralt pas y avoir d'inhibiteur sp~cifique assorti h chaque enzyme prot6olytique. Plus complexes, parce que ces diff6rents inhibiteurs r~v~lent des affinit6s plus ou moins prononc6es pour telle on telle prot~ase. Le premier de ces inhibiteurs dent le support prot6ique a 6t6 identifi6 [36] est celai que nous appelons maintenant a~-antitrypsine [55]. En fait, cette prot6ine avait d6jh 6t6 isol6e par SCrIULTZE et coll. [54] et en absence d'une activit6 biologique connue ces auteurs l'avaient appel6e ax.3,5S-gly. coprot6ine. BuNDY et MErIL [4] Font isol6e h partir de plasma humain, Wu et LASKOWSKI, ainsi que GnAY et coll. h partir du s6rum de bceuf [78, 15], enfin MAnx~r~ h partir du s6rum de mouton [32]. Cet inhibiteur a fait l'objet de nombreuses 6tudes et l'on peut actuellement l'identifier avec l'inhibiteur thermolabile [62] de mobilit6 al [18, 21, 24, 30, 43, 77]. Son action sur la trypsine est stoechiom6trique et immediate [62, 46, 4]. Son action antiplasminique a 6t6 mise en ~vidence aussi bien pour r ~ - a n t i t r y p s i n e du mou. ton que celle du boeuf [32, 15]. Scr~u~xz~ et coll. dans leur premiere ~tude trouvent l'~.antitrypsine humaine d6pourvue d'aetivit6 antiplasminique, activii6 qui rut cependant mise en ~vidence par ces auteurs lots d'une 6tude ult6rieure [55, 56]. SHAMASH et RI~ON ont isol6 r~cemment l'-~-antitrypsine (appel6e par eux antiplasmine) ~ partir de la fraction IV [59, 60] et ces

DE TRANSFUSION SANGUINE

113

auteurs constatent que cet inhibiteur r~agit imm6diatement avec la trypsine, mais progressivement avec la plasmine, r6sultat qui concorde avec les observations concernant l~al-antitrypsine du bceuf [49, 15]. Et les crit~res physicochimiques (poids mol6culaire, etc...) de 1' << antiplasmine >> de b oeuf d6crite r6cemment par NANNI~GAet GUEST [44] nous font penser que celle-ci serait en r~alit6 l'al-antitrypsine. L'al-antitrypsine est caract~ris~e par sa mobilit6 61ectrophor6tique, son poids mol6culaire assez faible (38 ~ 72.000 selon les auteurs) [4, 15, 49, 55, 78] et sa labilit6 prenonc6e sous l'action de la chaleur et de cliff'rents agents physico-chimiques [21, 47, 46, 62]. Cet inhibiteur n'agit pas seulement sur ractivit6 prot6olytique, mais 6galement sur ractivit~ est6rasique des prot6ases [18, 24, 34, 52]. Nous avons donc 1~ une diff6renee fondamentale avec le comportement de ra2M. La teneur du s6rum en ai-antitrypsine est de 2 h 5 g/1 ce qui met en ~vidence la part importante de cet inhibiteur dans le pouvoir antitrypsique total du s~rum. Apr~s l'al.antitrypsine nous citerons la prot6ine 7r isol6e par Fun de nous il y a qnelques ann6es [69] et dent l'activit6 antitryptique inter-sinhibitor) a 6t~ mise en 6vidence par HEIDE et coll. [19]. La prot6ine ~r est avant tout une antitrypsine, mais elle inhibe quoique h u n degr6 moindre ~galement la plasmine [69]. Cette prot6ine, de mobilit~ << inter-~- >> sur papier, ac6tate de cellulose et g61ose est une az-globuline lente en gel d'amidon [69]. Cette prot6ine r~siste au chauffage ~ 56°C (en ce qui concerne son activit6 inhibitrice [67]), ainsi qu'au traitement par la m6thylamine [73] ; elle inhibe aussi bien l'activit6 est~rasique que prot~olytique de la trypsine et de la plasmine [73]. Son poids mol~culaire est d'environ 180.000 et la teneur du plasma en prot6ine 7r correspond h environ 300 rag/1. I1 est facile de la diff6rencier de l',a~-antitrypsine et de l'a2M en fonction de ses propri~t6s physico-chimiques. Sa part dans l'activit~ inhibitrice globale du s6rum doit ~tre relativement modeste en fonction de sa concentration s6rique assez faible. L'a2M a par cons6quent des propri6t6s qui permettent de la distinguer nettement des autres antitrypsines et antiplasmines du s~rum, l'qous y trouvons son poids mol6culaire 61ev~, sa mobilit6 61ectrophor6tique caract6ristique en gel d'amidon d6jh signal6e par SMITHIES [65], la dissociation mol6culaire r~versible provoqu6e par la m6thylamine et accompagn~e de la perte r6versible d'activit6 en tant qu'antiprot6ase, sa relative stabilit~ fi la chaleur qui la distingue nettement de l'al-antitrypsine et enfin la formation de complexes prot~ases/~zM pr6servant l'activit~ est~rasique des enzymes [18, 33, 22, 2a, 67a]. Le comportement des complexes a2M/prot6ases envers les substrats de synth~se (tels que TAME, BAEE, BAPNA, etc...) montre que l'emploi de ces substrats est h proscrire dans l'appr~ciation globale des antiprot6ases du s6rum - - techniques pourtant propos6es par diff6rents auteurs [34, 52, 18]. L'activit6 est6rasique inchang6e des complexes ~ M / t r y p s i n e avait par ailleurs amen6 plusieurs auteurs fi la notion que l~azM fixerait les prot~ases sans les inhiber, les stabilisant ainsi en quelques sortes [22, 33]. Ce comportement est sans doute le r~suhat d'un ph~nom~ne d'ordre st6rique, le site d'interaction entre l'~2M et la prot6ase 6tant sufffisamment 61oign6 du site

114

SOCII~TE NztTIONALE

actif pour permettre ~ une petite molecule d'approcher de cehti.ci alors qu'une mol6cule plus grande (cas~ine, fibrine) s'en trouve 6eart6e. I1 est donc assez facile de d6terminer la place de l',a2M parmi les antitrypsines et antiplasmines du s6rum. Nous allons voir s'il e n e s t de m~me pour les antithrombines. SE•cEns [25] avait ~tabli une nomenclature des diff~rentes antithrombines en leur donnant des chiffres romains de ! ~ IV comme d~signation. Aux quatre antithrombines pr6e6dentes sont venues s'ajouter les antithrombines V e t VI [66]. P a r m i les six antithrombines seules les antithrombines II et I I I sont ~ discuter dans le contexte de l'a2M. L'antithrombine I I I d6signe l'aetivit6 d'antithrombine progressive alors que rantithrombine I I correspond au co-facteur de l'h6parine, c'est.~dire, ~ l'aetivit6 inhibitrice imm6diate observ6e quand on ajoute de l'h6parine au s~rum [1, 31, 37]. Les propri6t6s physico-chimiques analogues de ces deux inhibiteurs ont amen6 eertains chercheurs [5 ~ 9, 26, 27, 28] ~ la conviction que les antithrombines I I et I I I ne correspondent qu'~ un seul et m~me support prot6ique. I1 est done int~ressant de noter que l~a~M a bien les propri6t6s d'une antithrombine progressive, alors que nous n'avons pu d6celer une activit6 de co-facteur de l'h~parine. Les propri6t6S physico.chimiques de l'a2M ressemblent en beaucoup de points ~ celles rapport6es pour r a n t i t h r o m b i n e I I I [28, 35, 58, 20]. I1 est vrai, que les donn~es de la litt~rature sont souvent contradietoires comme l'ont soulign$ HEr~S~.Net LOELICErt [20] ~ juste titre. L~a2M n e s'est pas comport6e en co-facteur de l'h6parine et l'on pourrait se demander si cette prot$ine n'a pas subi une d6t6rioration lots du proc~d6 de purification qui aurait priv6 la prot6ine de certaines structures n~cessaires ~ cette aetivit6. Cette explication ne semble pas probable pour diffSrentes raisons: d'une part, nous avons pu mesurer 1a demi-vie de preparations analogues d'a2M et l'on sait qu'une prot~ine m~me l~g~rement modifi6e est rapidement 61imin6e par le SRE alors que l'a~M marquee demeure dans le eompartiment vaseulaire, la demi.vie ~tant d u n pen plus de 10 jours [48a]. D'autre part, nous avons pu obtenir par diff6rents moyens tels que l'ultraeentrifugation pr6parative, ainsi que des techniques immnno.chimiques [68] des 616ments permettant d'affirmer : 1) que l~a2M correspond effectivement ~ une partie importante de raetivit~ antithrombine progressive du s6rum, 2) que l'aetivit6 de co-faeteur de l'h6parine appartient a u n support prot6ique different. Compte-tenu de la pr6sence des activit6s antiplasmine et antitrypsine sur plusieurs supports prot6iques, il ne serait pas ~tonnant de trouver une situation analogue pour les antithrombines. La notion de ridentit~ des Antithrombines II et I I I 6taut bas6e sur une similitude des propri6t~s de ces deux inhibiteurs bien qu'aucun d'eux n'eut 6t6 obtenu ~ l'~tat put. I1 est donc important de d6montrer qu'une prot6ine pure ne contenant aueun contaminant prot6ique poss6de l'activit6 de l'antithrombine III, mais non celle de r a n t i t h r o m b i n e II. Notons que la prot6ine 7r n'a aucune activit6 d'antithrombine progressive ni de co.faeteur de l'h6parine, alors que Rx~o~ et coll. [49] out rapport~ r6cemment que leur antiplasmine ( = a~-antitrypsine) isol6e it partir

DE TRANSFUSION SANGUINE

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de la fraction IV avait des propri6t6s d'antithrombine progressive. De plus, la thrombine incub6e avec cette al.antitrypsine perd aussi bien son activit6 coagulante que son activit6 est6rasique avec le BAMe comme substrat, alors que le complexe a2M/thrombine conserve l'activit6 est6rasique tout comme les complexes a2M/trypsine et a2M/plasmine. Cette similitude de comportement des trois enzymes refl6te une analogie de structure en ce qui concerne la conformation du site d'amarrage et sa distance du centre actif de l'enzyme. L'inactivation r6versible de l'a2M par la m6thylamine est une autre particularit6 de cette macromol6cule qui int6resse aussi bien son activit6 antitrypsine, antiplasmine et antithrombine. D~s 1954, RAT~OFF et co11. [47] avaient cru d6celer la pr6sence de trois inhibiteurs (antitrypsines, ou antiplasmines) s6riques diff6rents qu'on peut ~ pr6sent, identifier en fonction des caract6ristiques donn6es par ces auteurs : 1) un inhibiteur thermolabile d6truit par le chauffage h 56°C: al/antitrypsine. TABLEAU V I I I

Tableau comparatij des propri~t~s principales de 3 antiprot~ases du s~rum. CeUes de rat.antitrypsine sont extraites de la litt$rature. ~1 ANTI-* TRYPSINE

I Mobilit6 61ectrophor6tique

papier, g61ose ac6tate cellulose gel d'arnidon

~2 MACROGLOBULINE

PROT~INE 7r

~2

<>

,a2 lente

I n h i b i t i o n de la trypsine : cas6inolyse et fibrinolyse . . . . . . . .

+++

Inhibition de l'aetivit6 est6rasique des prot6ases (TAME, B A P N A ) ..

+++

+++

,aft (Smithies)

+++ +++

Inhibition de la plasmine . . . . . . . . . .

++

++ a +++

Inhibition de la t h r o m b i n e . . . . . . . .

÷

+++

I n h i b i t i o n de la c h y m o t r y p s i n e . . . .

+

+

+

Inhibition de la brom61ine . . . . . . . .

?

?

+

Destruction par chauffage h 56°C ..

+++

Aetivit6 d6truite p a r m6thylamine ..

+++

Activit6 d6truite p a r : ac6tylation el succinylation . . . . . .

+++

*$

* Indications donndes d'aprSs la litt6rature. ** L'activit6 d.e la pro~6ine qr est d6truite par 0,25 M de m6fllylamine dans le test (est6rasique (TAME), ell e reste intacte dans le syst~me cas6inolytique.

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2) u n inhibiteur inactiv6 par l'hydrazine et la m6thylamine : ~2M. 3) n n inhibiteur r6sistant h la chaleur et h ses a m i n e s : prot6ine ~7. Le comportement de l'a2M en pr6senee de m6thylamine montre par ailleurs, que l'emploi de cette substance pr6conis6e pour la distinction des inhibiteurs <>et progressif >>[ l l a ] est trSs discutable. La part exacte de l'~2M dans l'activit6 antiprot6ase globale (notamment antitrypsine et antiplasmine) reste h pr6ciser avec des m6thodes appropri6es. Les r6suhats obtenus h l'aide de substrats de synth~se et plus particuli~rement darts les absences cong6nitales d'a~-antitrypsine sont sujets h caution et le probl6me devra 6tre r66tudi6 avec d'autres substrats. Enfin, l'emploi de thrombine radio-active, par exemple pourra aider h d6gager le r61e pr6pond6rant d Fa2M comme antithrombine III. Dans le tableau VIII, nous avons group6 quelques propri6t6s des trois inhibiteurs (azM, uUantitrypsine et prot6ine 7r) qui permettent de les diff6rencier faeilement. R6surn6 1) L'a2M est une antiprot6ase qui inhibe les trois enzymes 6tudi6s : la trypsine, la plasmine et la thrombine. Cette inhibition concerne les substrats prot6iques (cas6ine, fibrine). Son activit6 antitrypsine et antithrombine paralt plus importante que son activit6 antiplasmine. 2) Son action inhibitrice est progressive (plasmine, t h r o m b i n e ) ; elle repr6sente une part importante de l'antithrombine III, et n'a pas d'activit6 <>. 3) L'activit6 est6rasique des trois prot6ases 6tudi6es n'est pas iuhib6e par l~a2M. 4) La cong61ation, et plus encore la m&hylamine, lui font perdre ses propri6t6s antiprot6ases ; le r6chauffement dans le cas de la cong61ation, la dialyse, dans le cas de la m&hylamine, permettent de r6cup6rer (partiellemerit) ses propriSt6s inhibitrices. 5) Les propri6t6s inhibitrices de l'a2M sont compar6es h eelles des deux autres antiprot6ases les mieux caract6ris6es: l'a~-antitrypsine, et la prot6ine rr.

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